Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Immunology and Infection
 

Summary

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

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Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

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Abstract

Au cours des dernières années, il est devenu évident que l'instabilité génomique est étroitement liée à de nombreux troubles du développement, des cancers et de vieillissement. Étant donné que les cellules souches sont responsables d'assurer l'homéostasie tissulaire et la réparation tout au long de la vie, il est raisonnable d'émettre l'hypothèse que la population de cellules souches est essentielle pour la préservation de l'intégrité du génome de tissus. Par conséquent, beaucoup d'intérêt a été soulevée dans l'évaluation de l'impact des facteurs endogènes et environnementaux sur l'intégrité du génome dans les cellules souches et leur progéniture, visant à comprendre l'étiologie des maladies à base de cellules souches.

Souris transgéniques lacI portent un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène LacI sert de rapporteur de mutation. Le résultat d'un gène muté LacI est la production de β-galactosidase qui clive un substrat chromogène, le tournant dans le bleu. Le système rapporteur Lad est réalisée in toutes les cellules, y compris les cellules souches / progénitrices et peuvent facilement être récupérés et utilisés pour infecter ensuite E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat correct, plaques peut être marqué; plaques bleues indiquent un gène mutant Lad, tandis que les plaques claires abritent de type sauvage. La fréquence de bleu (entre les plaques claires) indique la fréquence de mutation dans la population de cellules d'origine de l'ADN a été extrait à partir de. Le séquençage du gène mutant LacI affiche l'emplacement des mutations dans le gène et le type de mutation.

Le modèle de souris transgénique Lad est bien établi comme un test in vivo de mutagenèse. En outre, les souris et les réactifs pour le test sont disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici en détail comment ce modèle peut être adapté pour mesurer la fréquence d'apparition spontanée de mutants d'ADN dans les cellules souches enrichie en cellules Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) et d'autres sous-populations de cellules du système hématopoïétique.

Introduction

Dans la plupart des tissus, des cellules différenciées ont une durée de vie limitée. Afin de maintenir l'intégrité fonctionnelle, les cellules souches spécifiques de tissu à long terme produisent en continu des cellules souches qui à leur tour donnent naissance à des cellules complètement différenciées nécessaires à la fonction de ce tissu particulier. Les cellules souches reconstituer aussi leur propre compartiment par un processus appelé auto-renouvellement. Ainsi, les cellules souches sont responsables du maintien de l'intégrité fonctionnelle des tissus ils résident po Par conséquent, il est impératif qu'ils sont équipés de mécanismes solides pour détecter et potentiellement réparer l'ADN endommagé. Sinon, ils peuvent acquérir de multiples perturbations génomiques (potentiellement dangereux), qui peuvent être hérités par leur progéniture. Comprendre comment les cellules souches sauve-garde de leur génome au cours de la durée de vie d'un organisme est une question importante et peut nous aider à comprendre pourquoi l'instabilité génomique est liée à un cancer et d'autres maladies liées à l'âge (examinés dans 1,2).

6.3. On a constaté que, par exemple, dans le système hématopoïétique, les cassures double brin de l'ADN peuvent être réparées par recombinaison homologue (RH) ou de la fin non homologue de jonction (NHEJ), ce dernier étant un procédé de réparation d'une fidélité plus faible et donc une augmentation du risque de prise erreurs. Les deux sont utilisés dans des cellules souches hématopoïétiques (CSH) 4,5, cependant, chez la souris, il semble qu'il est essentiellement NHEJ dans les CSH tandis que les cellules progéniteurs précoces utilisent HR 4. Une observation similaire a été faite pour les cellules souches dans la peau 6. Fait intéressant, dans les CSH humaines HR, pas NHEJ,semble être le mécanisme de réparation de choix pour des cassures double brin 3. Si cette différence fonctionnelle entre les deux espèces est réelle ou représente une différence technologique ou simplement expérimental reste à voir.

Un répertoire de cellules souches pour réparer l'ADN endommagé est susceptible d'inclure d'autres mécanismes de réparation d'ADN, telles que l'excision de base de réparation (BER), la réparation par excision de nucléotides (NER) et la réparation des mésappariements (MMR). BER et NER sont responsables de la réparation des lésions de paires de bases simples ou multiples dans l'ADN simple brin, alors que l'inadéquation des correctifs ROR base de base et des boucles d'insertion / délétion; ces types de dommages à l'ADN peuvent pas être réparés par NHEJ ou RH. L'appui de cette notion existe plusieurs études provenant du système hématopoïétique qui démontre un lien entre les modifications dans l'une de ces voies et des anomalies dans le compartiment HSC 7-9, ainsi qu'un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique 10-16, une maladie qui prend naissance dans laHSC et qui est associée à l'augmentation de l'instabilité génomique que la maladie progresse 17. Pour l'instant, les mesures de BER, NER et MMR directement dans les CSH n'ont pas été signalés.

En plus d'élucider les divers processus qui contrôlent l'intégrité des tissus au niveau mécanique, il est impératif de pouvoir mesurer l'ampleur de l'ADN muté, de sorte que les conséquences d'aberrations dans l'un de ces processus peuvent être testés, par exemple dans la normale par rapport génétiquement cellules souches modifiées ou vieux par rapport à jeune. Cependant, le développement d'un test pertinent est difficile en raison de la rareté des cellules souches tissulaires spécifiques et le manque de conditions de culture qui préserve "caractère souche". En outre, une telle analyse devrait être amendée à des manipulations génétiques et environnementaux. Une solution possible à ces limitations et exigences est l'utilisation de modèles de souris qui sont spécifiquement conçues pour détecter des mutations de l'ADN.

Muldes modèles de souris transgéniques tiples pour la détection de mutations ont été développés. Par exemple, des souris transgéniques 18 LacI porter un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène code pour un suppresseur LacI de l'opérateur lac et sert de rapporteur de mutation. Lors de la mutation du gène LacI, l'opérateur Lac est activé et β-galactosidase est produite. β-galactosidase clive le substrat chromogène X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), qui transforme le bleu. Les sites cos flanquant le vecteur Lacl permet une récupération facile par lambda protéines de phage et une infection ultérieure de E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat X-gal, plaques peut être marqué. Des plaques bleues contiennent un mutant putatif Lac-I portant un phage, alors que des plages claires abritent les non-mutants. La fréquence des plages bleues (e parmie ceux claires) indique la fréquence de mutants dans la population de cellules d'origine de l'ADN a été extrait à partir de. En outre, le phage λ accueillir la cible LacI peut être facilement séquencée en utilisant des techniques de PCR pour l'analyse relativement à haut débit. Le séquençage des gènes multiples Laci mutants va révéler des informations importantes sur le spectre de mutation, qui à son tour peut pointer vers d'éventuelles déficiences dans les voies spécifiques de réparation d'ADN ou à des événements spécifiques génotoxiques. Le système transgénique Lad a été normalisé sur plusieurs laboratoires 19 et les réactifs sont disponibles dans le commerce. Un inconvénient majeur du système Lad est la capacité limitée pour détecter des délétions ou des réarrangements, par conséquent, d'autres méthodes, par exemple FISH multi-couleur sur les spreads métaphase doivent être utilisés pour compléter cette lacune.

Au sein du vecteur de phage λ du modèle de souris LacI, il existe un gène beaucoup plus petite, CII, Disponible pour l'analyse des mutations. Sa taille et le fait que les mutants peuvent être sélectionnés en font un test de main-d'œuvre et moins cher moins 20 que l'analyse du gène Lad. Cependant, le gène LacI est plus largement étudié pour la mutagenèse 21 et la sensibilité du gène de mutations a été bien caractérisé de sorte qu'il y ait une compréhension claire des résidus d'acides aminés qui produisent une réponse phénotypique d'un substrat chromogène de 22 à 25.

D'autres modèles de souris pour la détection de mutations incluent l'utilisation de la ΦX174 ou les transgènes LacZ. Le modèle de souris transgénique ΦX174, avec le A initial: T → G: C réversion mutation dosage 26 ou le test de mutation directe 27 qui permet la détection d'un spectre des substitutions de paires de bases, représente un système moins coûteux que le modèle Lad. Cependant, l'écran de mutation dans le dosage de l'avant n'est pas anodin et la spécification de mutationtrum du transgène ΦX174 n'est pas aussi bien caractérisé que celui de la LacI. Dans des modèles de souris portant des transgènes LacZ, le journaliste de mutation LacZ est récupéré en utilisant E. des cellules hôtes E. coli qui sont sensibles au galactose et un milieu contenant du galactose 28. Un inconvénient de ce système est que la récupération de la cible LacZ implique également la digestion d'endonucléase de restriction suivie d'une ligature et l'électroporation de E. coli héberge, ce qui rend difficile d'adapter le système pour de petits nombres de cellules. Bien que ce n'est pas une exigence absolue pour travailler avec les populations de cellules souches / progénitrices (on peut toujours commencer avec plus souris), si un grand nombre de cellules sont nécessaires (par exemple, des millions ou plus), il deviendra vite impossible et un coût prohibitif. En outre, la taille relativement importante de LacZ, tout en offrant un reporter sensible mutationnelle, est lourd et plus coûteux pour une analyse de séquence d'ADN et la détermination de spectres de mutation. Toutefois, un des grands avantages de ce modèle est sa capacité à détecter de grandes deletions et insertions, ainsi que des réarrangements chromosomiques.

Etant donné que toutes les cellules dans les modèles de souris transgéniques LacI, ΦX174 et LacZ portent le système rapporteur, l'un de ces modèles de souris peut être utilisée pour mesurer la mutagenèse dans n'importe quel type de cellule d'intérêt, y compris des cellules souches et progénitrices, tant qu'ils peuvent être récoltées de façon fiable et en nombre suffisant. Parce que nous avions une grande expérience avec le modèle de la souris Lad et le test de mutation Lad, nous avons décidé de poursuivre encore ce système pour l'analyse de mutagenèse dans souches hématopoïétiques et populations de cellules progénitrices.

Le tissu hématopoïétique est bien caractérisée en termes de phénotype de surface cellulaire de ses composants individuels, y compris les cellules de repopulation à long terme souches, qui sont identifiables comme la population extrêmement rare de Lin - IL7R + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 29 cellules. . Mohrin et al 4 ont démontré que la population légèrement plus grand de LSK/Flk2 - cellules sont encore bons représentants pour les CSH et significativement différent de l'ancêtre myéloïde engagé plus primitive (CMP) de la population quand il s'agit de l'étude de réparation de l'ADN. En outre, lorsque le LSK HSC enrichi (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules ont été comparés à la Lin - IL7R - Sca-1-cKit + (cellules progénitrices LS-K) +, il y avait encore une différence significative dans NHEJ capacité 5 entre le moins pur, de la tige de LSK population enrichie en cellules, et les cellules progénitrices. Dans notre étude, nous utilisons HSC enrichi LSK (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules parce que nous avons constaté qu'au moins 2 x 10 5 cellules sont nécessaires pour des résultats cohérents et fiables dans ce test de mutagenèse; ce numéro de cellule est extrêmement difficileà obtenir quand on trie le LSK/Flk2 - population CD150 + CD48 ou même la LSK/Flk2 - population (en termes de souris, les coûts et pratique). Ce protocole, sur la base de celui initialement mis au point par Kohler et al. 18 décrit en détail la façon dont la fréquence de mutants spontanés d'ADN peut être déterminée dans des cellules LSK et des populations de cellules myéloïdes différenciées ainsi que des cellules de moelle osseuse non séparée et la rate définie.

Protocol

Les leucocytes de souris transgéniques LacI sur un fond C57BL / 6 n'expriment pas Sca-1 (Figure 1). Par conséquent, si Sca-1 est un marqueur utilisé pour la purification de cellules, ces souris ont besoin d'être croisée avec une souche appropriée pour obtenir Sca-1 expression; dans ce protocole F1 d'un croisement entre des souris C57BL / 6 (B6) des souris normales et LacI (C57BL / 6) chez la souris transgénique (LacI) a été utilisé (figure 1). Des populations cellulaires utilisées dans ce protocole, LSKs et CMP représentent les plus petites populations dans la moelle osseuse. Afin de purifier au moins 2 x 10 5 de chaque / trier, combiner la moelle d'environ dix souris lors de la récolte de la moelle à partir de seulement les membres postérieurs ou d'au moins quatre souris quand aussi la hanche, jambes-, avant os de la colonne vertébrale, et le sternum sont utilisés.

Faire des suspensions monocellulaires à partir de la moelle osseuse et la rate. Une petite proportion de la moelle osseuse est utilisé tel quel, la majorité est utilisée pour PURIFy LSKs et les cellules progénitrices myéloïdes différenciées, à savoir CMP et de granulocytes / progéniteurs monocytaires (BPF) par cellule activé par fluorescence (FACS). L'isolement des cellules de moelle osseuse et purification par FACS de ces populations est décrit ailleurs 30-32. Environ six sortes indépendants sont nécessaires pour identifier les différences significatives des fréquences de mutation entre les populations.

Le protocole suivant pour la mesure de la fréquence spontanée vivo dans le mutant dans des sous-populations hématopoïétiques purifiées est une adaptation de plusieurs manuels d'instruction Stratagene 33-35, sur la base de l'œuvre originale de Kohler et al. 18 Les différences les plus importantes entre les protocoles existants 33-35 et ce protocole , nécessaire lors de l'utilisation relativement petit nombre de cellules, y compris les différences de volumes de réactifs et les temps et les températures utilisées pour la protéinase K incubation.

Après avoir recueilli les populations de cellules, les cellules désirées aliquotes dans des tubes de centrifugation de 1 ml (pour le nombre de cellules par aliquote, voir le tableau 1). Centrifuger à 266 g pendant 7 min, à 4 ° C. Aspirer le surnageant avec précaution. Mettez les tubes dans l'azote liquide pendant 5 min, puis les transférer dans un congélateur à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Les échantillons peuvent être stockés pendant au moins 6 mois.

2. Isolement d'ADN génomique

  1. Prenez les échantillons de -80 ° C congélateur. Ajouter 500 ul de tampon d'ADN lyse glacé (tableau 3) pour le tube d'échantillonnage. Vortex les tubes pour 3-5 sec à vitesse moyenne et placer les tubes sur de la glace pendant 10 min.
  2. Centrifuger les tubes pendant 12 min, 4000 g, 4 ° C. Défaire délicatement ~ 450 pi du surnageant. Isoler le tube pendant 3-5 sec. Utiliser un tube capillaire en verre pour éliminer soigneusement le reste du surnageant. Sécher à l'air des parois intérieures du til tube jusqu'à ce qu'aucune goutte sont plus visibles (~ 2 min).
  3. Ajouter 2 ul de RNace-Il ribonucléase cocktail et 10 pi de 1 M DTT à 100 pi du tampon de digestion d'ADN (tableau 3). Ajuster le volume en fonction du nombre d'échantillons qui seront traités, 20 ul de cette solution de digestion d'ADN par échantillon est nécessaire. Après addition de 20 pl de cette au culot cellulaire, essayer de faire le culot de se détacher du fond, en tapotant doucement le tube avec le doigt ou un stylo.
    Remarque: il peut être difficile de voir le culot en raison des faibles nombres de cellules.
  4. Ajouter 20 ul protéinase K solution * (tableau 3) à chaque échantillon, très doucement appuyez à nouveau tube.
    * Remarque: la solution de protéinase K doit être réchauffé dans un bain d'eau à 50 ° C, 2 min avant de les utiliser afin d'activer l'enzyme.
  5. Placer le tube immédiatement dans un bain d'eau à 50 °. Digérer l'échantillon selon les lignes directrices Remarque: Avec un si petit nombre de cellules, la température du bain d'eau et les temps de digestion sont absolument critique pour obtenir avec succès l'ADN génomique de grande qualité.
  6. Préparer le système de dialyse de l'ADN dans la chambre froide (figure 2). Verser 600 ml de tampon TE (tableau 3) dans un bécher de 600 ml en verre, ajouter une petite barre d'agitation magnétique, de sorte que le tampon peut être agité pendant la dialyse et de laisser les 0,025 mm (taille des pores) membranes flottent à la surface de la mémoire tampon. Une membrane par échantillon; 1-4 membranes peuvent être utilisées dans un seul récipient de dialyse. Faire une marque sur le bord de la membrane avec des ciseaux pour l'identification de chaque échantillon.
  7. Après le temps de digestion approprié, ajouter de l'ADN génomique présent très visqueux * soigneusement au centre de la membrane flottante (figure 2). Recouvrir immédiatement d'une feuille d'aluminium. Dialyser l'ADN génomique à 4 ° C pendant ~ 16 à 20h, remuer doucement le tampon.
    * Remarque: Lorsque vous travaillez avec des solutions d'ADN visqueux, utiliser des embouts de pipette à large ouverture.
  8. Le lendemain, versez 600 ml de tampon TE fraîchement préparé (tableau 3) dans un bécher de verre propre et de transférer les membranes pour le nouveau gobelet avec une cuillère très attentivement, et couvrir le bécher d'une feuille. Dialyser pendant 2 h.
  9. Retirer la membrane de dialyse du bécher avec le tampon TE aide d'une cuillère et de ne transférer que le "bouquet" plus visqueux de la solution d'ADN dans un nouveau tube de 1 ml, stérile. Conserver l'échantillon à 4 ° C. Continuer le test de mutagenèse le lendemain ou jusqu'à 1,5 mois plus tard. Pour les populations purifiées, attendre au moins 1 semaine.

3. Préparation de plateaux pour le E. coli / Phage Culture (Jour 1)

Chaque bac contient deux couches différentes, une couche d'agar à la base et une couche d'agarose dans la partie supérieure qui contient X-gal. Le E.coli solution / du phage sera ajouté à celui-ci. Le nombre et le type de cellules isolées détermineront combien de plateaux sera nécessaire. Consulter le tableau 1 pour calculer le nombre de plateaux nécessaires et les montants suivants de solutions pour cette partie du protocole. Ce qui suit va générer ~ 60 plateaux, dont une personne expérimentée peut traiter facilement.

  1. Préparer les supports suivants:
    1. pour la couche inférieure, la préparation de 6 x 2 L avec des flacons contenant chacun 1 600 ml trou DDH 2 O. Ajouter la poudre NZY (21 g / L) et de la gélose (15 g / L) et bien mélanger.
    2. pour la couche supérieure, préparer 4 x 1 L flacons contenant chacun avec 800 ml ddH 2 O. Ajouter NZY poudre (21 g / L) et d'agarose (7,2 g / L) et bien mélanger.
    3. pour la culture de E. coli, ajouter 2,5 g de poudre NZY à chacun des deux ballons de 250 ml x et porter le volume à 100 ml avec le trou DDH 2 O;
    4. pour les plateaux de confirmation utilisés à l'étape 8, ajouter 8,4 g de poudre NZY et 6 g de agar à une fiole de 1 L et porter le volume à 400 ml avec le trou DDH 2 O.
  2. Couvrir l'ouverture des fioles avec une feuille d'aluminium. Mélangez bien et les passer à l'autoclave à 121 ° C, 15 psi pendant 30 min.
  3. Retirez les flacons (très chaud!) De l'autoclave. Agiter soigneusement les flacons à mélanger l'agar-agar et d'agarose, puis placez-les dans un bain d'eau à 50 °. Lorsque le bain d'eau a atteint 50 ° C, à nouveau, verser des flacons de 2 litres (étape 3.1.1) ~ 150 ml de gélose NZY dans chaque plateau (couche inférieure).
  4. Laisser la gélose se solidifier à la température ambiante pendant au moins 2 heures, puis inverser et ouvrir les tiroirs. Placez le fond des bacs sur le couvercle, 45 ° hors centre (figure 3) et laisser sécher pendant 30 min. Fermez les plateaux et laissez O / N à la température ambiante.
  5. Pendant ce temps, préparer la SCS-8 E. coli pour la culture du lendemain. De l'un des deux flacons de 250 ml * (étape 3.1.3), prendre 5 ml de bouillon NZY (tableau 3) et transférer à un stérile 14 ml tube. Supplément avec 62,5 pi de maltose / solution de MgSO 4 et ajouter 10 ul du SCS-8 E. coli stock de glycérol. Incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures tout en agitant à 250-300 rpm. Utiliser 15 pi de cette culture pour inoculer 95 ml de bouillon NZY (dans un ballon de 250 ml arme de poing), la culture O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation (250-300 tours par minute).
    * Remarque: l'autre flacon de 250 ml peut être utilisé plus tard pour ajuster le diamètre extérieur de la culture si nécessaire (étape 4.1)
  6. Prenez la fiole de 1 L avec de l'agar (étape 3.1.4), et versez ~ 6-7 ml de gélose NZY en boîtes de 60 mm (ce sera suffisant pour ~ 50 plats, nécessaires à l'étape 8). Laisser durcir agar (~ 10 min), puis inversez et envelopper dans du plastique. Ces plats peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.

4. Préparation de plateaux pour le E. coli / Phage Culture (Jour 2)

  1. Vérifiez la DO du SCS-8 E. culture coli (étape 3.5) sur le spectrophotomètre.Régler la DO 600 à 0,6 avec du bouillon NZY (tableau 3) (étape 3.1.3), et placer le ballon sur glace pour arrêter la croissance et garder sur la glace jusqu'à utilisation. Il sera utilisé pour les étapes 6.3 et 8.2. Cette culture peut être conservé pendant 5 jours à 4 ° C.
  2. Air sécher tous les bacs de dosage (versé la veille) pour ~ 5 heures (Figure 3).

5. Conditionnement de l'ADN génomique (Jour 2, suite)

  1. Prenez le nombre requis d'orange Transpack les tubes à -80 ° C congélateur et placez-les sur de la glace sèche avant d'être prêt à l'emploi; prendre un tube de Transpack orange pour chaque réaction de l'emballage doit être effectuée. Étiqueter chaque tube de manière appropriée. Avoir les échantillons d'ADN génomique (étape 2.9) prêts sur la glace.
  2. Cette étape doit être effectuée une tube à la fois. Terminer l'étape complète avant de passer à la prochaine échantillon d'ADN. Décongeler un tube orange * note 1 rapidement: utilisez vos doigts jusqu'à ce que la plus grande partie est décongelé, puis mettresur la glace. Prenez l'échantillon d'ADN génomique correspondant et transférer immédiatement 8-12 ul d'échantillon * Note 2,3 au tube orange. Mélanger le contenu en pipetage de haut en bas 3x, ainsi que par tapotant doucement le tube avec votre doigt. Essayez de ne pas introduire de bulles lors du mélange. Placer le tube dans un bain-marie à 30 ° pendant 90 min.
    * Note 1: un tour rapide dans une micro peut être nécessaire de recueillir tous les contenus de la paroi intérieure et le bouchon.
    * Note 2: volume de l'échantillon ajouté est fonction du nombre de cellules utilisées pour générer l'échantillon: 11 à 12 pi d'échantillons préparés à 2,0 à 5,0 x 10 5 cellules, 10 ul de 1,0 x 10 6 cellules-échantillons, et 8 pl de 1,5 x 10 6 cellules-échantillons.
    * Note 3: L'ADN est encore très visqueux; prendre l'ADN, enfoncez la pointe de la pipette vers le bas du tube de l'échantillon et soigneusement tordre le bout autour contre la paroi intérieure du tube.
  3. Prendre 1 ou 2 bleu Transpack tubes * le congélateur à -80 ° C et placez-les sur de la glace sèche jusqu'à utilisation ultérieure. Décongeler rapidement et transférer 12 pi de chacun des tubes oranges. Mélanger la solution par un léger pipetage de haut en bas 3 fois. Spin le tube diagonal pour 2-3 sec, puis appuyez sur le tube avec le doigt pour obtenir un mélange et retourner immédiatement au bain-marie à 30 ° pour un autre 90 min.
    * Remarque: Utilisez 1 tube bleu 5-6 réactions et deux tubes bleus pour 10-12 réactions.
  4. Après 90 min, diluer chaque réaction avec un tampon de 970 pi de SM * (tableau 3) pour arrêter la réaction et vortex à vitesse moyenne pendant 5 sec. Mettez tubes sur la glace jusqu'à utilisation ultérieure.
    * Remarque: si le nombre de cellules est ≤ 5 x 10 5, utiliser 500 pi SM tampon (tableau 3) pour arrêter la réaction, 2 tubes (du même échantillon) peuvent ensuite être combinées plus tard (étape 6.4).

6. Placage emballée ADN génomique (Jour 2, suite)

  1. Fermez l'agar inversé trayons qui ont été ouverts pour le séchage du matin. Étiqueter les plateaux pour chaque échantillon.
  2. Dissoudre 4,8 g de X-gal dans 16,8 ml de N, N-diméthylformamide (nécessaire pour l'étape 6.5). Incorporer immédiatement et mettre sur une plate-forme de shaker. Protéger de la lumière. Solution doit être limpide dans 20-30 min.
  3. Aliquoter le SCS-8 E. cellules de E. coli. Pour chaque ensemble de plateaux *, utiliser un tube conique de 50 ml. Étiqueter le tube avec le nom de l'échantillon d'ADN emballé. Ajouter 2 ml de E. coli suspension pour chaque bac.
    * Note: Par exemple 3 x 10 5 BPF nécessite un ensemble de 8 plateaux (voir le tableau 1). Ainsi, les deux parties aliquotes, nécessitent 8 x 2 = 16 plateaux. Gardez les aliquotes séparent et préparent ainsi deux tubes de 50 ml, avec chacun 8 x 2 = 16 ml E. suspension coli.
  4. Ajouter les 1 ml * de l'échantillon d'ADN emballé (de l'étape 5.4) dans le tube approprié ml 50 contenant le SCS-8 E. aliquote coli et bien mélanger. Incuber ce E. coli mélange / de phage dans un incu secouantbator (250-300 rpm), à 37 ° C pendant 23 min.
    * Remarque: Si l'ADN a été extrait à partir de ≤ 5 x 10 5 cellules, 500 ul de tampon SM ont été utilisées pour arrêter la réaction (étape 5.4). A ce stade, les tubes peuvent être combinés et ajoutés à 50 ml d'un tube conique.
  5. Lorsque le E. mélange coli / phage est en incubation, commencer la préparation de la couche d'agarose haut. Ajouter 5 ml de X-gal / N, solution N-diméthylformamide (étape 6.2) dans chaque fiole de 800 ml de solution d'agarose couche supérieure (de l'étape 3.1.2, maintenue à 50 ° C). Concentration finale de X-gal sera de 1,5 mg / ml. Le X-gal peut précipiter un peu lorsqu'il est ajouté à l'agarose. Agiter pour dissoudre le X-gal et mettre la bouteille dans le bain d'eau à 50 ° C.
  6. Prenez le E. mélange coli / phage de l'incubateur (étape 6.4). Chaque échantillon nécessite plusieurs plateaux, chaque plateau, nécessite 50 ml de solution X-gal/agarose (étape 6.5). Verser le volume requis de X-gal/agarose pour chaque échantillon (par exemple 50 ml xnombre de plateaux) dans une grande bouteille en plastique stérile et ajouter la E. approprié coli mélange / de phage. Agiter le flacon pour mélanger. Répartir le mélange dans des aliquotes de 45-50 ml à 50 ml tubes coniques. Le nombre de tubes doit être le même que le nombre de plateaux nécessaires à cet échantillon.
    Remarque: La solution X-gal/agarose restes sera utilisé dans l'étape 8.3. La solution peut être stockée dans un bain-marie à 50 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure.
  7. Verser 50 ml d'agarose top mélange à travers la moitié inférieure de la barre d'essai. Propager rapidement l'agarose en inclinant légèrement le tiroir de dosage dans une direction.
    Remarque: l'agarose se refroidit très rapidement et deviendra impossible à s'étaler sur le plateau. Par conséquent, cette étape doit être effectuée relativement rapidement et avec de l'agarose qui a été maintenu à 50 ° C.
  8. Laisser l'agarose haut à durcir pendant au moins 15 min. Ensuite, inverser et ouvrir les tiroirs de dosage pour les laisser sécher à l'air pendant 30 minutes (Figure 3). Fermez les plateaux, incuber les bacs de dosage inversées (côté de la couche de gélose de bas en haut) à 37 ° C pendant 15-16 h. Ne pas empiler plus de 5 plateaux.

7. La détermination d'une fréquence putatif Mutant (Jour 3)

  1. Retirez les bacs à partir du 37 ° C incubateur et laisser refroidir. Compter les unités formant des plaques translucides (UFP) sur chaque plateau, choisir au hasard 2 sites sur les plateaux, dessiner un carré * de 2,5 x 2,5 cm 2 ou 5 x 5 cm 2 et comptez toutes les UFP dans chaque carré avec un compteur de cellules marquage (figure 4A, B).
    * Note: Pour dessiner l'utilisation carré un dispositif tel que représenté sur la figure 5. Si le nombre de compté PFU est ≥ 40, utiliser le petit carré, sinon utiliser la plus grande.
  2. Prendre la moyenne des carrés comptés et multiplier par 96 si le comptage avec un petit carré, ou multiplier ce nombre par 24 si le comptage avec la grande. Ajouter le nombre de PFU compté pour tous les magasins de la SAmoi échantillon. Ceci est le nombre total de PFU généré pour cet échantillon.
  3. Ensuite, compter les plaques mutants dans chaque bac. Les plateaux ont refroidi, ce qui aidera à localiser les plaques mutantes. Pour faciliter encore repérer les plaques bleues, déplacer le plateau sur une surface rouge et / ou blanc; feuilles de papier rouge et blanc bien travailler. Encerclez une plaque bleue avec un marqueur. Notez la forme et l'intensité de la couleur bleue de chaque mutant (par exemple complet, cercle, secteur, figure 4C) 36,37.
  4. Déterminer la fréquence de mutants putatifs pour chaque échantillon en divisant le nombre de PFU mutant (étape 7.3) par le nombre total de PFU (étape 7.2).

8. Vérification des putatif Mutant Plaques (Jour 3-5)

  1. L'utilisation d'un pipette Pasteur, le noyau de chaque mutant (bleu) PFU et transférer la fiche dans 250 pi de tampon SM stérile (tableau 3). Ajouter 25 ul de chloroforme, vortex pendant 5 secondes uned conserver à 4 ° C pour continuer le lendemain ou à laisser pendant 2 heures à température ambiante avant de continuer à l'étape suivante, pour vérifier que le mutant PFU est en effet un mutant. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins 1 an.
  2. Label One 1 ml et un 4 ml tube stérile pour chaque mutant qui a été branché. Dans le nouveau tube de 1 ml, diluer le phage remis en suspension libéré du bouchon de gélose (étape 8.1) 1:50 dans un tampon SM stérile (2 pi d'échantillon dans 100 pi de tampon SM (Tableau 3)), vortex brièvement, mettre de côté. Pour les 4 ml tube stérile ajouter 200 ul SCS-8 E. coli culture (de l'étape 4.1) et 2 ul de la dilution du phage à partir du tube de 1 ml correspondant, incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
  3. Ajouter 2,5 ml de la gélose supérieure contenant X-gal (à gauche depuis l'étape 6.6) à chaque tube de 4 ml, tube agiter pour mélanger et verser sur une plaque de gélose NZY 60 mm précédemment versé (étape 3.6). Laisser reposer 10 minutes (pour laisser til agarose de solidifier), inverser le plat et laisser incuber O / N à 37 ° C.
  4. Le lendemain matin, retirez le plat de l'incubateur et de déterminer la proportion de bleu UFP sur chaque plat (figure 6). Lorsque 70% ou plus de la PFU sont bleus, un mutant est considéré comme confirmé 38,39. La plaque de base mutant de la boîte et mettre dans un 1,5 ml vis tube supérieur, contenant 250 pi de tampon SM (tableau 3) et 25 ul de chloroforme, il est maintenant prêt pour le séquençage.
  5. Lorsque 50% ou moins de la PFU est bleu, il n'est pas considéré comme un réel 38,39 mutant. Lorsque la fréquence de bleu PFU est entre 60-70%, revenez dans les notes sur la forme de la plaque, si la forme de la PFU était "complet", procéder à un séquençage.

9. Séquençage de mutations dans le Lacl G ène

  1. Mise en place des réactions de PCR dans un volume réactionnel de 25 ul, comprenant 1,5 μ; L de surnageant plaque (modèle, l'étape 8.4), l'amorce sens SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') et l'amorce inverse SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Utiliser le kit de polymerase Taq PCR extenseur selon les instructions du fabricant. Les conditions de cyclage sont les suivantes: 94 ° C pendant 2 min, puis 35 cycles de 94 ° C pendant 20 sec, 60 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 2 min, suivie par une étape finale de 72 ° C pendant 5 min .
  2. Prendre une aliquote de 5 ul de chaque réaction et sur un gel d'agarose à 0,8%, pour confirmer l'amplification.
  3. Nettoyer les réactions de PCR en utilisant le kit de nettoyage Augencourt selon les instructions du fabricant.
  4. Quantifier Patron de l'ADN.
  5. Utiliser ~ 100 ng de produit de PCR comme matrice d'ADN pour le séquençage. amplicons de séquence dans les deux directions en utilisant les mêmes amorces de PCR comme amorces de séquençage (voir ci-dessus).
  6. Assembler et aligner les séquences avec la séquence de référence Lacl 40 pour détecter mutations.

Representative Results

Le test in vivo de mutagenèse mesure un événement rare (mutant UFP) parmi beaucoup d'événements (UFP). En effectuant le dosage avec un petit nombre de cellules, il est possible que le résultat est considérablement influencée par des résultats faux-positifs et faux-négatifs. Pour répondre à cette question nous avons réalisé une expérience de dilution en série avec des cellules de moelle osseuse non fractionnées, récoltées à partir de trois animaux différents. Nous avons mesuré la proportion de mutants dans la moelle osseuse de ces animaux à l'aide de 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 et 1,75 x 10 5 cellules. Les résultats (figure 7) montrent une relation linéaire entre le nombre de cellules d'entrée et le nombre de PFU de produit. Surtout, la fréquence des mutants est conforme, si mesurée avec des numéros bas ou élevés de cellules. Bien que pas directement testé (en raison de la rareté des cellules), il n'ya aucune raison de croire que ce n'est pas le cas pour LSKs et les BPF.

t "> L'étape la plus importante dans ce test de mutagenèse est l'isolement de l'ADN génomique (étape 2). Bien que la concentration de l'ADN devrait idéalement être ≥ 500 ng / pl, ce protocole fonctionne bien avec 40-150 ng / ul. plus important est le rapport 260/280 (ce doit être> 1,8-2,0) et le poids moléculaire (devrait être d'environ 300-500 kb). Il est recommandé quand on n'est pas familier avec le test pour vérifier la qualité et la taille de l'ADN isolé . figure 8 montre un exemple d'exécution de l'électrophorèse de l'ADN de haut poids moléculaire.

Les marques de PFU individuels sur un plateau de la figure 4B représentent une densité raisonnable et réalisable de plaques quand on commence avec un petit nombre de cellules purifiées, un plateau devrait tenir entre 40-150 UFP / petit carré. Dans cette expérience particulière, le petit carré à la figure 4B contient 103 plaques. L'autre carré sur le plateau, représenté dans le coin supérieur de la figure 4A 41, parce que nous utilisons un peu plus petites plateaux et 12 000 UFP sur ces plateaux ne nous permettent une bonne distinction entre les plaques individuelles.

La figure 4C montre des exemples des différents types de plaques bleues qui peuvent être observées. Dans le test de mutagenèse Lad, la morphologie des plaques (c.-plein, secteur ou cercle) est une indication de l'origine de la mutation; complet est une mutation d'origine de la souris, tandis que les deux autres sont probablement produite dans E. coli 36,37. Lors de réensemencement (voir also Figure 6), la quasi-totalité des plaques "plein" reproduire> 70% des plaques bleues à nouveau, alors que seulement une très petite partie des plaques de secteur et faire pratiquement aucun des plaques circulaires, souvent plus petits.

Le tableau 2 montre la reproductibilité de la formation de plaque avec un nombre relativement faible de cellules purifiées par rapport à celle avec un nombre élevé de cellules de moelle osseuse (le même groupe de cellules où les cellules ont été triées à partir de) et de cellules de rate.

PFU mutantes sont confirmés, d'abord par réensemencement (figure 6 montre des exemples représentatifs de plats pour la confirmation de mutant primaire (bleu) UFP) et d'autre part, par séquençage. Les plats de la figure 6, contenant> 70% PFU bleus (deux en bas) confirment que le mutant originaire de la souris (et non dans le E. coli). Cependant, le plat en haut à gauche montre aucun UFP bleu et par conséquent, le PFU primaire ne doit pas être considéré comme mutant et sequencing n'est pas nécessaire. Le plat de droite montre ~ 65% UFP bleu. Selon la forme de la plaque primaire, cet échantillon sera envoyé pour le séquençage (voir l'étape 8.4). Ce n'est que si une mutation de l'ADN peut être confirmé par séquençage de ce PFU sera compté comme mutant. En cas de doute sur la forme de la PFU, séquence!

Figure 1
Figure 1. Sca-1 coloration sur les cellules de la moelle osseuse de souris de type sauvage C57BL6 (B6), des souris Laci transgéniques (Lad) et la descendance d'un croisement entre ces deux cellules (B6 x Lad). Moelle osseuse de souris B6 exprimer Sca- 1 sur leur surface cellulaire et cette caractéristique est utilisée pour purifier les cellules souches et progénitrices-. Souris transgéniques LACI sur un fond de B6, cependant, n'expriment pas Sca-1, ce marqueur doit avoir été perdu WHile instituant la colonie. Pour réintroduire Sca-1 chez des souris transgéniques Laci, ces souris ont été croisées avec des souris B6 réguliers.

Figure 2
Figure 2. Système de dialyse de l'ADN. Trois membranes retenant une solution d'ADN visqueux dans le centre (de couleur bleue pour une meilleure visualisation) flottent sur ​​le tampon TE. Les flèches rouges indiquent les petites entailles dans la membrane, qui sont utilisés pour l'identification des échantillons.

Figure 3
Figure 3. Efficace façon de sécher 60 ou plus agar / agarose plateaux contenant.

gether.within page = "always"> Figure 4
Figure 4. Détection des unités de formation de plaque (PFU). Représentés sont (en partie) de grands plateaux de gélose (représentées sur la figure 3) avec des colonies primaires de phage-infectés E. coli. (A) est montré toute une plaque avec 2 petits carrés dessinés sur elle pour compter plaques. L'insert rouge est représenté agrandi dans (B). (B) Chaque marqueur point noir indique un individu de type sauvage PFU clair dans la plaque de gélose (103 au total). (C) Différentes formes de PFU potentiellement mutantes. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Figure 5. Plexiglas compter carrés. Sont représentés dans un petit et un grand carré de comptage. Les mesures internes de la grande place est de 5 cm x 5 cm, celle du petit carré de 2,5 cm x 2,5 cm.

Figure 6
Figure 6. Confirmation d'unités formant plaque (UFP) mutantes. Vivant sont quatre petits plats inoculées le jour précédent avec un diluant d'un PFU bleu. Le plat supérieur gauche montre aucun UFP bleu. Le plat supérieur droit montre ~ 65% UFP bleu. Les deux plateaux inférieurs montrent 80-90% UFP bleu (gauche) et 100% UFP bleu (à droite). Les flèches rouges indiquent clairement (type sauvage) PFU.

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Figure 7. Fréquence Mutant non fractionnée moelle osseuse. Représentées sont (A) le nombre de PFU, (B) le nombre de mutants et (C) la fréquence des mutants mesurée dans trois animaux différents (vieux 24-26 mois), qui sont représentés par des couleurs différentes. Pour chaque souris, les mesures ont été effectuées sur quatre différentes tailles de l'échantillon: 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 et 1,75 x 10 5 cellules. Les données montrent que, dans cette plage de cellules, la taille de l'échantillon n'influence pas significativement les mesures de fréquence de mutants.

Figure 8
Figueure 8. électrophorèse en champ pulsé des échantillons d'ADN de haut poids moléculaire isolés à partir de cellules purifiées. L'ADN génomique a été isolé comme décrit à l'étape 2 du protocole et exécuté sur un système Bio-Rad (CHEF-DR III). Les différents échantillons chargés sur le gel sont des échantillons d'ADN isolés à partir du foie (Li, piste 1), des cellules de moelle osseuse appauvries en lignée matures + cellules (LB; pistes 2 et 14), les cellules CD34 + LSK (L; piste 6), CMP (pistes 7-9), BPF (voies 11 et 12) et Sca-1 + cellules (S; voie 15). La piste 4 contient la échelle de l'ADN de haut poids moléculaire. La photo montre que la majorité de l'ADN est de haut poids moléculaire (> 600 kb).

Tableau 1. Divers exemples de paramètres de populations purifiées, toute la moelle osseuse et la rate. Utilisez ce tableau où est indiqué dans le Protocole. Pour chaque population a indiqué au-dessus, le nombre de cellules (10 x 5) par aliquote, le temps de digestion de l'ADN, le volume de l'échantillon d'ADNaprès dialyse, le nombre de réactions nécessaires pour chaque aliquote et le nombre de plateaux nécessaires par aliquote sont indiqués sur la gauche. Les temps de digestion à 50 ° C sont critiques pour le succès de l'expérience.

Tableau 1

LSK = Lin - Sca-1 + Kit cellules + +; CMP = de progéniteurs myéloïdes engagés; GMP = de progéniteur granulocytaire / monocytaire; WBM = (non triés) os entier osseuse. Les cellules de rate ne sont pas triés.

Tableau 2. Efficacité de la formation de la plaque est comparable entre les différentes populations de cellules. Ce tableau montre la formation de la plaque entre les différentes populations. Six mois vieilles souris C57BL / 6 ont été utilisés pour ces expériences (fémurs et tibias de 10-11 souris par expérience, 6 expériences au total). Toutes, sauf une des populations utilisées dans ces expériences gave au moins 1 jusqu'à 24 (confirmé) mutant PFU (Zhou et al., manuscrit en préparation). Numéros UFP peuvent varier selon la souche de souris.

Tableau 2

LSK = Lin - Sca-1 + Kit cellules + +; CMP = de progéniteurs myéloïdes engagés; GMP = de progéniteur granulocytaire / monocytaire; WBM = (non triés) os entier osseuse * cellules de rate ne sont pas triés.. = Écart-type.

Tableau 3. Instructions pour la préparation des réactifs supplémentaires.

Tableau 3

§ De l'Instruction Manual Stratagene du kit d'isolation RecoverEase ADN

¶ De l'Instruction Manual Stratagene de l'emballage Extrait Transpack

Discussion

Le test in vivo de mutagenèse in décrite ici est basée sur le modèle de souris transgénique LacI initialement généré par Kohler et al. 18 Ce modèle utilise un vecteur de phage λ portant un gène rapporteur lad. Les deux sites cos flanquant le vecteur permettre une relativement simple récupération et le conditionnement ultérieur en particules infectieuses de phages, utilisés pour infecter E. coli. Une plaque bleue sera généré par phage infectées E. coli qui contiennent un gène muté LacI. La plaque bleue est placée sur un fond incolore, ce qui simplifie grandement la tâche de notation mutant. les techniques de séquençage d'ADN peuvent être utilisées pour identifier la position et le type de mutation qui a eu lieu, ce qui peut aider d'autres investigations dans les mécanismes sous-jacents de la mutagenèse.

Les modifications que nous avons faites au protocole de cet essai de mutagenèse permettent de l'utiliser avec hematopoie FACS purifiépopulations cellulaires tic. Cependant, nous avons constaté que l'analyse reproductible nécessite toujours au moins 2 x 10 5 cellules hématopoïétiques pour assurer des quantités suffisantes de l'ADN de haute qualité. Comme la fréquence de long terme repeupler CSH est extrêmement faible 29, effectuer une analyse de mutagenèse sur les CSH est à ce point n'est pas réalisable. La population enrichie en cellules souches que nous utilisons dans ce protocole, les cellules LSK, contient, en plus de Flk-2 - à long terme repeupler CSH, aussi FLK-2 - à court terme CSH repeuplement et Flk-2 cellules +, qui représentent ancêtre multipotentielle cellules (Députés) 42. Malgré cette limitation, nous pensons que l'utilisation de cellules LSK comme une lecture de CSH dans cet essai de mutagenèse est raisonnable car il a été montré que les cellules LSK se comportent plus comme LSK-Flk-2 - CSH en termes de l'utilisation NHEJ que les cellules progénitrices 5. En outre, le travail de Rossi et al. 8 suggère que les députés sont mieux dans la copie avec damagADN ed de CSH, surtout quand ils vieillissent, nous conduit à émettre l'hypothèse que le nombre de mutants trouvés dans la population LSK reflète celle de la CSH plutôt que les députés.

Depuis un petit nombre de cellules triées sont obtenus à chaque expérience, un problème important à considérer à l'étape de la planification de ce test in vivo de mutagenèse, est la taille de l'échantillon (le nombre total de plaques par exemple) nécessaire pour atteindre une signification statistique. En d'autres termes, lorsque l'objectif est, par exemple, comparer la fréquence de mutation des cellules LSK manipulées à des cellules contrôle LSK de type sauvage, combien de plaques au total sont nécessaires pour chaque population LSK pour détecter une différence de deux ou trois fois dans fréquence de mutation? Il faut noter que le nombre total de plaques peut être combiné à partir de toutes les expériences, car nous n'avons trouvé aucune différence significative entre les expériences de tri, au moins dans les cellules de type sauvage, sur la base d'une analyse de régression binomiale négative 43. Plaque numérobres sont importants à connaître parce que cela va déterminer le nombre de toutes sortes qui doivent être effectuées (~ 10 000 pour WBM et des BPF et ~ 7000 pour Spleen, LSKs et CMP). Etant donné que les fréquences de mutation sont petites dans les tissus de type sauvage 44, l'approximation normale sont comparés statistiquement ceux-ci ne sont pas exactes. Pour cette raison, nous utilisons la distribution de Poisson, car il se rapproche de la vraie distribution binomiale (de la fréquence de mutation) lorsque cette fréquence est faible et la taille de l'échantillon est relativement important; Huffman 45 prévoit une formule (équation 4) pour calculer la taille de l'échantillon sur la base sur la distribution de Poisson. Lorsqu'il est appliqué à des fréquences hypothétiques de mutation de 2,5, 4 et 7 mutations par 100 000 cellules dans les cellules de contrôle 44, nous avons besoin de 456 949 fléaux, 285 592 et 163 196, respectivement, pour détecter une différence de deux fois significative (test de l'échantillon avec deux signification queue de 0,05 et une puissance de 0,80). Moins de plaques sont nécessaires pour détecter une fois troisdifférence: 122148; 76 342 et 43 624, respectivement. Ainsi, le nombre de plaques nécessaires pour chaque population d'intérêt (et donc le nombre de sortes nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules) dépend de la fréquence de mutation qui peut être attendue dans la population de cellules de commande et le changement de pliage prévue dans le groupe de comparaison.

L'étape la plus importante dans ce test de mutagenèse est l'isolement de l'ADN génomique (étape 2). Bien qu'il est essentiel de commencer ce protocole avec des échantillons d'ADN de haute qualité (voir "des résultats représentatifs"), lorsque l'on travaille avec des cellules triées, le nombre de cellules sont souvent limitées et ne peuvent pas être gaspillées sur la détermination de la concentration ou de la taille de l'ADN. Nous avons constaté que un autre bon indicateur de la qualité de l'échantillon d'ADN est sa viscosité; à l'étape 2.9, l'échantillon doit être extrêmement visqueux et difficile à travailler. Il nécessite une certaine pratique pour obtenir ce droit de l'étape. Par conséquent, il est recommandé de travailler sur le protocole avec le nombre de cellules grandes, par exemple avec Sca-1 + cellules triées toute la moelle osseuse ou, et se familiariser avec isolement de l'ADN de ces échantillons et d'apprendre à juger de la qualité de l'ADN par sa viscosité.

La qualité et la taille de l'ADN affecte le nombre de PFU généré. Lorsque l'étape d'isolement de l'ADN est parfaite, l'autre élément important de l'optimisation de l'essai est la densité de PFU par plaque. Tableau 1 montre le nombre recommandé de plateaux à utiliser pour chaque type d'échantillon correspondant à un nombre optimal de cellules pour cet échantillon. L'utilisation de ce guide devrait se traduire par des plateaux où les plaques individuelles peuvent encore être distingués, mais ne sont pas trop éparpillé. Un plateau devrait tenir entre 40-120 PFU par petit carré; l'exemple illustré à la figure 4B représente une densité raisonnable. Grâce à ces aspects de l'optimisation d'élaboration, le nombre de PFU généré par échantillon est très efficace et reproductible (tableau 2).

»> Le modèle de souris transgénique Lad a été utilisé avec une variété d'autres tissus, mais pas en conjonction avec un nombre relativement restreint de populations hautement purifiés. Lorsqu'il est appliqué à l'autre (de hématopoïétique) populations enrichies de cellules souches spécifiques de tissus, il est recommandé à accorder une attention particulière à la procédure d'isolement de l'ADN;. elles peuvent différer de type de cellule du type de cellule et la recommandation pour les cellules hématopoïétiques peuvent ne fonctionnera pas nécessairement pour d'autres types de cellules de tissu Les facteurs critiques, tels que la quantité de réactifs, la température à laquelle la protéinase K digestion doit avoir lieu et, plus important encore, la protéinase K temps de digestion devra être élaboré pour chaque type de cellule, ce protocole peut servir de point de départ.

Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier David R. Rodriguez, MA pour la conception graphique et la photographie dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un financement de la GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) et la subvention d'appui Cancer Center (P30CA054174) à l'installation UTHSCSA cytométrie de flux de base et le Fonds UTHSCSA avancée Nucleic Acids Core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM Pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N,N-Dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/Coulter A63880

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