Identifikation DNA-mutationer i renset hæmatopoietisk stamcelletransplantation / stamceller

Immunology and Infection
 

Summary

Her beskriver vi en in vivo-mutagenese analyse for et lille antal af oprensede hæmatopoietiske celler ved anvendelse af LacI transgene musemodel. LacI genet kan isoleres til at bestemme frekvens, placering og type af DNA mutanter spontant opstået eller efter udsættelse for genotoxins.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de senere år er det blevet klart, at genomisk instabilitet stramt er relateret til mange udviklingsmæssige forstyrrelser, kræft og aldring. Da stamceller er ansvarlig for at sikre vævshomeostase og reparation gennem hele livet, er det rimeligt at gætte på, at stamceller befolkning er afgørende for at bevare genomisk integritet af væv. Derfor har betydelig interesse opstået i vurderingen af ​​virkningen af ​​endogene og miljømæssige faktorer på genomisk integritet i stamceller og deres afkom, for at forstå ætiologien af ​​stamcelle baserede sygdomme.

Laci transgene mus bære en erstattes λ fag-vektor, der koder LacI reporter system, hvor LacI-genet fungerer som mutationen reporter. Resultatet af en muteret LacI-genet er produktionen af β-galactosidase, som spalter et chromogent substrat, dreje det blå. LacI reportersystemet udføres in alle celler, herunder stamceller / stamceller og kan let genvindes og anvendes til efterfølgende at inficere E. coli. Efter inkubering inficerede E. coli på agarose der indeholder den korrekte substrat kan plaque scores, blå plakker indikerer en mutant LacI-genet, mens tydelige plaques harbor vildtype. Hyppigheden af ​​blå (blandt klar) plaques angiver mutanthyppigheden i den oprindelige cellepopulation DNA blev ekstraheret fra. Sekventering mutant LacI genet, vil vise placeringen af mutationer i genet og typen af mutation.

LacI transgene musemodel er veletableret som en in vivo-mutagenese assay. Desuden mus og reagenserne til assayet er kommercielt tilgængelige. Her beskriver vi i detaljer, hvordan denne model kan være indrettet til at måle frekvensen af spontant forekommende DNA-mutanter, stamcelle-beriget Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) celler og andre underpopulationer af det hæmatopoietiske system.

Introduction

I de fleste væv, differentierede celler har en begrænset levetid. For at opretholde funktionelle integritet, langlivede, vævs-specifikke stamceller kontinuerligt producere stamceller, som til gengæld giver anledning til den fuldt differentierede celler, der er nødvendige for funktionen af ​​det pågældende væv. Stamceller også genopbygge deres eget rum gennem en proces kaldet selv-fornyelse. Således stamceller er ansvarlige for at opretholde den funktionelle integritet af vævet, de bor i. Derfor er det bydende nødvendigt, at de er udstyret med robuste mekanismer til at sanse og potentielt reparere beskadiget DNA. Hvis ikke, kan de erhverve flere genomiske (potentielt skadelig) forstyrrelser, som kan blive arvet af deres afkom. Forstå, hvordan stamceller safe-guard deres genom i levetiden for en organisme er et vigtigt spørgsmål, og kan hjælpe os med at forstå, hvorfor genomisk instabilitet er forbundet med kræft og nogle andre aldersrelaterede sygdomme (revideret i 1,2).

3-6. Det blev konstateret, at for eksempel i hæmatopoietiske system, dobbeltstrenget DNA pauser kan repareres ved homolog rekombination (HR) eller ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ), hvor sidstnævnte er en reparation proces lavere nøjagtighed, og dermed øget risiko for at fejl. Begge bliver udnyttet i bloddannende stamceller (HSCs) 4,5, men i mus det synes det er overvejende NHEJ i HSCs mens tidlige stamceller udnytte HR 4. En lignende observation blev lavet til stamceller i huden 6.. Interessant i human HSCs HR, ikke NHEJ,synes at være ophelingsmekanismen valg for dobbeltstrengede brud 3. Hvorvidt dette funktionelle forskel mellem de to arter er ægte eller blot repræsenterer en teknologisk eller eksperimentel forskel er endnu uvist.

En stamcelle repertoire til at reparere beskadiget DNA er sandsynligvis til at omfatte andre DNA reparation mekanismer, såsom bunden excision reparation (BER), nukleotid excision reparation (NER) og fejlparringsreparation (MFR). BER og NER er ansvarlige for at reparere en enkelt eller flere basepar læsioner i enkeltstrenget DNA, mens MFR rettelser basis-basefejlparringer og indsættelse / sletning loops, disse typer af DNA-skader kan ikke repareres af NHEJ eller HR. Støtte dette begreb er flere undersøgelser fra hæmatopoietiske system viser en sammenhæng mellem ændringer i en af disse veje og abnormiteter i HSC rum 7-9, samt en øget risiko for udvikling myelodysplastisk syndrom 10-16, en sygdom, der stammer iHSC, og som er forbundet med stigende genomisk ustabilitet som sygdommen skrider frem 17. Som i endnu, ikke er blevet rapporteret målinger af BER, NER, og MFR direkte i HSCs.

Ud over at belyse de forskellige processer, der styrer vævs integritet på en mekanistisk niveau, er det nødvendigt at være i stand til at måle omfanget af muterede DNA, således at konsekvenserne af aberrationer i én af disse processer kan testes, f.eks normal versus genetisk manipuleret stamceller eller i gamle kontra unge. Det er imidlertid vanskeligt på grund af mangel på vævsspecifikke stamceller og manglen på dyrkningsbetingelser, der bevarer "stemness" udvikling af et relevant assay. Desuden bør en sådan analyse kunne ændres til miljømæssige og genetiske manipulationer. En mulig løsning på disse begrænsninger og krav, er brugen af ​​musemodeller, som er specifikt udviklet til at detektere DNA-mutationer.

Mulmultiplum transgene musemodeller for mutationsdetektion er blevet udviklet. For eksempel LacI transgene mus 18 bære en erstattes λ fag-vektor, der koder LacI reporter system, hvor LacI-genet koder for et suppressor af Lac operatøren og tjener som mutationen reporter. Ved mutation af LacI-genet, lac-operatoren aktiveret og β-galactosidase er produceret. β-galactosidase spalter det kromogene substrat X-gal (5-brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), som omdanner det blå. Cos flankerer LacI vektor tillader nem inddrivelse ved lambdafag proteiner og efterfølgende infektion af E. coli. Efter inkubering inficerede E. coli på agarose, der indeholder X-gal-substrat kan plaque scores. Blå plader indeholder en formodet mutant Lac-I bærer fagen, mens tydelige plaques harbor ikke-mutanter. Hyppigheden af ​​blå plaques (blandt the klare dem) angiver mutanthyppigheden i den oprindelige cellepopulation DNA blev ekstraheret fra. Desuden kan λ-fag vært LacI målet let sekventeres ved anvendelse af PCR-teknikker til relativt højt gennemløb analyse. Sekventering af flere mutant Laci gener vil afsløre vigtige informationer om mutationen spektrum, hvilket igen kan pege på eventuelle mangler i specifikke DNA reparation veje eller specifikke genotoksiske begivenheder. LacI transgene system er blevet standardiseret på tværs af flere laboratorier 19 og reagenser findes i handelen. En væsentlig ulempe ved LacI-systemet, er den begrænsede evne til at detektere store deletioner eller rearrangementer, og derfor andre metoder, f.eks flerfarvede FISH på metafasespredninger skal bruges til at komplimentere denne mangel.

Inden for λ-fag vektor LacI musemodel, der er et meget mindre genet CII, Til rådighed for mutationsanalyse. Dens størrelse og det faktum, at der kan vælges mutanter gør dette til en mindre arbejdskrævende og billigere assay 20 end LacI genanalyse. Imidlertid er LacI-genet mere grundigt undersøgt til mutagenese 21 og følsomheden af genet mutationer er blevet godt karakteriseret, så at der er en klar forståelse af de aminosyrerester, der genererer en fænotypisk reaktion på et kromogent substrat 22-25.

Andre musemodeller for mutationsdetektion omfatter anvendelse af ΦX174 eller LacZ transgener. Den ΦX174 transgene mus model, med den oprindelige A: T → G: C tilbagefald mutation assay 26 eller fremad mutation assay 27, der tillader detektering af et spektrum af basepar udskiftninger, repræsenterer et billigere system end LacI modellen. Men mutational skærmen i fremad assayet er ikke trivielt, og mutationen spectrum af ΦX174 transgenet er ikke så godt karakteriseret som for LacI. I musemodeller bærer LacZ transgener er LacZ mutations reporter udvindes udnytte E. coli værtsceller, der er følsomme over for galactose og medium indeholdende galactose 28. En ulempe ved dette system er, at inddrivelsen af LacZ mål indebærer også restriktionsendonucleasefordøjelse efterfulgt af ligatur og elektroporation af E. coli vært, hvilket gør det vanskeligt at tilpasse systemet til et lille antal celler. Selvom det ikke er et absolut krav for at arbejde med stamceller / stamceller populationer (man kan altid starte med flere mus), hvis et stort antal celler er påkrævet (f.eks millioner eller mere) vil det hurtigt blive upraktisk og omkostningseffektive uoverkommelige. Også den relativt store størrelse af LacZ, men samtidig give en følsom mutational reporter, er besværligt og dyrere for DNA-sekvens analyse og determgennemgang af mutation spektre. En stor fordel ved denne model er imidlertid dens evne til at detektere store deletioner og insertioner samt kromosomale omlejringer.

Eftersom alle celler i LacI, ΦX174 og LacZ transgene musemodeller bære reporter system, kan nogen af disse musemodeller anvendes til at måle mutagenese i en celletype af interesse, herunder stamceller og progenitorceller, så længe de kan pålideligt høstes og i tilstrækkeligt antal. Fordi vi havde stor erfaring med LacI musemodel og LacI mutation assay, besluttede vi at forfølge denne ordning yderligere for mutagenese analyse i hæmatopoietiske stamceller og progenitorpopulationer.

Hæmatopoietisk væv er godt karakteriseret i form af celleoverfladen fænotype af de enkelte bestanddele, herunder langsigtede repopulariserende stamceller, som kan identificeres som den yderst sjælden population af Lin - IL7R + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - celler 29. . Mohrin m.fl. 4 viste, at lidt større population af LSK/Flk2 - celler er stadig gode repræsentanter for HSCs og signifikant forskellig fra den mest primitive engagerede myeloid stamfader (CMP) befolkning, når det kommer til at studere DNA-reparation. Desuden, når HSC-berigede LSK (Flk-2 + og Flk-2 -) celler blev sammenlignet med Lin - IL7R - Sca-1-cKit + + (LS-K stamceller), var der stadig en betydelig forskel i NHEJ evne 5 mellem mindre rent, stamcelle-beriget LSK befolkning og progenitorceller. I vores undersøgelse bruger vi HSC-beriget LSK (Flk-2 + og Flk-2 -) celler, fordi vi fandt, at der kræves mindst 2 x 10 5 celler til konsekvente, pålidelige resultater i denne mutagenese assay; denne celle nummer er yderst vanskeligtat opnå, når man sorterer LSK/Flk2 - CD150 + CD48 befolkning eller endda LSK/Flk2 - befolkning (i form af mus, omkostninger og funktionalitet). Denne protokol, der er baseret på den ene oprindeligt udviklet af Kohler et al. 18 beskriver i detaljer, hvordan den spontane DNA mutanthyppigheden kan bestemmes i LSK celler og defineret populationer af differentierede myeloide celler samt usorteret knoglemarv og milt celler.

Protocol

Leukocytter fra LacI transgene mus på en C57BL / 6 baggrund ikke udtrykker Sca-1 (figur 1). Derfor, hvis Sca-1 er en markør, der anvendes til celle rensning, behøver disse mus, der skal krydses med en passende belastning for at opnå Sca-1-ekspression, i denne protokol F1 af en krydsning mellem regulære C57BL / 6 (B6) mus og LacI (C57BL / 6) transgene mus (LacI) blev anvendt (fig. 1). Af de cellepopulationer anvendes i denne protokol, LSKs og kystforvaltningsplaner repræsenterer de mindste befolkninger i knoglemarven. For at rense mindst 2 x 10 5 af hver / sort, kombinere marv fra cirka ti mus ved høst marven fra kun bagbenene eller fra mindst fire mus, når også hip-, forben-, rygsøjle knogler, og brystbenet bliver brugt.

Sørg enkelte cellesuspensioner fra knoglemarv og milt. En lille del af knoglemarven bruges som de er, er de fleste bruges til purify LSKs og differentierede myeloide stamceller, dvs kystforvaltningsplaner og granulocytiske / monocytiske progenitorer (GMP), ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Isoleringen af knoglemarvsceller og FACS-oprensning af disse populationer er beskrevet andetsteds 30-32. Cirka seks uafhængige slags er nødvendige for at identificere signifikante forskelle i mutationsfrekvenser mellem befolkninger.

Følgende protokol til måling af spontan in vivo mutanthyppigheden i oprensede hæmatopoietiske subpopulationer er tilpasset fra flere Stratagene brugsanvisninger 33-35, baseret på originale værk fra Kohler et al. 18. De mest kritiske forskelle mellem de eksisterende protokoller 33-35 og denne protokol påkrævet, når anvendelse af et forholdsvis lille antal celler omfatter forskelle i de mængder af reagenser og tider og temperaturer, der anvendes til proteinase K inkubation.

Efter indsamling af de ønskede cellepopulationer, alikvote cellerne i 1 ml centrifugeglas (for celle nummer per portion, se tabel 1). Centrifuger ved 266 x g i 7 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten omhyggeligt. Sæt rørene i flydende nitrogen i 5 minutter, og derefter overføre dem til en -80 ° C fryser til yderligere brug. Prøverne kan opbevares i mindst 6 måneder.

2. Isolering af genomisk DNA

  1. Tag prøverne fra -80 ° C fryseren. Tilsæt 500 pi iskold DNA lysisbuffer (tabel 3) til prøverøret. Vortex rørene i 3-5 sek på medium hastighed og placere rørene på is i 10 min.
  2. Centrifuger rørene i 12 min, 4.000 xg, 4 ° C. Kassere forsigtigt ~ 450 pi af supernatanten. Spin ned i røret i 3-5 sek. Brug et glaskapillarrør til forsigtigt at fjerne resten af ​​supernatanten. Air-tørre indvendige vægge i than rør, indtil ingen er synlige dråber længere (~ 2 min.)
  3. Tilsæt 2 pi RNace-Det ribonuklease cocktail og 10 pi 1 M DTT til 100 pi af DNA-fordøjelse buffer (tabel 3). Juster mængder i forhold til antallet af prøver, der vil blive behandlet, 20 pi af dette DNA fordøjelse opløsning er påkrævet per prøve. Efter tilsætning af 20 ul dette cellepelletten, forsøge at gøre pillen frigøre sig fra bunden, ved forsigtigt at banke røret med fingeren eller en pen.
    Bemærk: Det kan være svært at se pelleten grund af lave celleantal.
  4. Tilsæt 20 ul proteinase K-løsning * (tabel 3) til hver prøve, meget forsigtigt trykke røret igen.
    * Bemærk: proteinase K opløsning bør opvarmes i et 50 ° C vandbad, 2 min før brug for at aktivere enzymet.
  5. Glasset anbringes straks i en 50 ° C vandbad. Prøven fordøje i henhold til retningslinjerne i Bemærk: Med sådanne små antal celler, temperaturen af ​​vandbadet og fordøjelsen tider er helt afgørende for succes at opnå en høj kvalitet genomisk DNA.
  6. Forbered DNA dialyse system i kølerum (figur 2). Hæld 600 ml TE-buffer (tabel 3) i et 600 ml bægerglas, tilsættes en lille magnetisk omrørerstav, således at bufferen kan omrøres under dialyse og lad (0,025 mM porestørrelse) membraner flyder på overfladen af bufferen. En membran per prøve, 1-4 membraner kan anvendes i en enkelt dialyse bægerglas. Lav et mærke på marginen af ​​membranen med en saks til identifikation af hver prøve.
  7. Efter passende fordøjelse tid, tilsæt nu meget tyktflydende genomisk DNA * omhyggeligt til centrum af den flydende membran (figur 2). Bægerglasset dækkes straks med alufolie. Dialysere genomisk DNA ved 4 ° C i ~ 16-20hr, røre bufferen forsigtigt.
    * Bemærk: Når du arbejder med tyktflydende DNA-løsninger, kan du bruge pipettespidser med en bred åbning.
  8. Den næste dag hælde 600 ml frisk fremstillet TE buffer (tabel 3) til et rent bægerglas og overføre membranerne til den nye bæger med en ske meget omhyggeligt, og dette tildækkes med folie. Dialyseres i yderligere 2 timer.
  9. Fjern dialysemembranen fra bægerglasset med TE-buffer med en ske, og kun overføre de viskos "klump" af DNA-opløsning til en ny, steril 1 ml rør. Prøven opbevares ved 4 ° C. Fortsæt mutagenese assay næste dag eller op til 1,5 måneder senere. For de rensede populationer vente mindst 1 uge.

3. Forberedelse af Bakker for E. coli / Phage Kultur (dag 1)

Hver bakke skal indeholde to forskellige lag, et agarlag i bunden og en agarose lag på toppen, der indeholder X-gal. E.coli / fagopløsning vil blive tilføjet til den sidstnævnte. Antallet og typen af ​​celler isoleret vil afgøre, hvor mange bakker vil være påkrævet. Se Tabel 1 for at beregne antallet af bakker, der er nødvendige og efterfølgende mængder af løsninger til denne del af protokollen. Følgende vil generere ~ 60 bakker, som man erfaren person kan behandle let.

  1. Forbered følgende medier:
    1. for det nederste lag, forberede 6 x 2 L kolber med hver indeholdende 1.600 ml Hedeselskabet 2 O. Tilføj NZY pulver (21 g / l) og agar (15 g / l), bland godt.
    2. til det øverste lag, forberede 4 x 1 L kolber hver indeholdende 800 ml dobbeltdestilleret 2 O. Tilføj NZY pulver (21 g / l) og agarose (7,2 g / l), bland godt.
    3. til dyrkning af E. coli, tilsættes 2,5 g NZY pulver til hver af 2 x 250 ml kolber og rumfanget bringes op på 100 ml med Hedeselskabet 2 O;
    4. for confirmation bakker ved trin 8, tilsættes 8,4 g NZY pulver og 6 g AGAr til en 1 L kolbe og rumfanget bringes op på 400 ml med Hedeselskabet 2 O.
  2. Dække åbningen af ​​kolberne med aluminiumsfolie. Bland godt og autoklaveres dem ved 121 ° C, 15 psi i 30 minutter.
  3. Fjern kolber (meget varmt!) Fra autoklaven. Forsigtigt hvirvle kolberne at blande agar og agarose, og derefter placere dem i et 50 ° C vandbad. Når vandbadet har nået 50 ° C igen, hælde fra de 2 L kolber (trin 3.1.1) ~ 150 ml NZY agar i hver bakke (nederste lag).
  4. Lad agar at størkne ved stuetemperatur i mindst 2 timer, derefter vendes og åbne skufferne. Placer bunden af bakkerne på låget, 45 ° off center (figur 3) og lad tørre i 30 min. Luk bakkerne og lad O / N ved RT.
  5. I mellemtiden forbereder SCS-8 E. coli kultur for den næste dag. Fra den ene af de to 250 ml kolber * (trin 3.1.3), tage 5 ml NZY bouillon (tabel 3) og overføres til en steril 14 ml røret. Supplement med 62,5 ul maltose / MgSO4-opløsning og tilsæt 10 ul af SCS-8 E. coli glycerol lager. Der inkuberes ved 37 ° C i 3-4 hr mens omrystning ved 250-300 rpm. Anvendes 15 pi af denne kultur til podning af 95 ml NZY medium (i en 250 ml sidearm kolbe), kultur O / N ved 37 ° C i en rysteinkubator (250-300 rpm).
    * Bemærk: den anden 250 ml kolbe senere kan anvendes til at justere OD af kulturen om nødvendigt (trin 4.1)
  6. Tag 1 L kolbe med agar (trin 3.1.4), og hæld ~ 6-7 ml NZY agar i 60 mm skåle (dette vil være nok for ~ 50 retter, der er nødvendige for trin 8). Tillad agar til at hærde (~ 10 min), så vend og wrap i plast. Disse skåle kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.

4.. Forberedelse af Bakker for E. coli / Fag Kultur (dag 2)

  1. Kontroller OD af SCS-8 E. coli kultur (trin 3.5) på spektrofotometer.Juster OD 600 til 0,6 med NZY bouillon (tabel 3) (trin 3.1.3), og placer kolben på is for at standse væksten og holde på is, indtil klar til brug. Dette vil blive brugt til trin 6.3 og 8.2. Denne kultur kan opbevares i 5 dage ved 4 ° C.
  2. Lufttørre alle assay bakker (hældes dagen før) for ~ 5 timer (figur 3).

5.. Pakning af Genomisk DNA (Dag 2; Fortsat)

  1. Tag det nødvendige antal appelsin Transpack rør ud -80 ° C fryser og placere dem på tøris indtil den er klar til brug; tage en appelsin Transpack rør for hver emballage reaktion der skal udføres. Mærk hvert rør korrekt. Har de genomiske DNA-prøver (trin 2.9) er klar på is.
  2. Dette trin skal udføres ét rør ad gangen. Afslut komplet trin, før man går videre til den næste DNA-prøve. Tø en appelsin rør * note 1 hurtigt: Brug fingrene, indtil det meste af det er optøet, og derefter sættepå is. Tag den tilsvarende genomisk DNA-prøve og straks overføre 8-12 ul prøve * note 2,3 til den orange rør. Bland indholdet ved forsigtigt at pipettere op og ned 3x, samt ved forsigtigt at banke på glasset med fingeren. Prøv ikke at indføre bobler når blanding. Glasset anbringes i et 30 ° C vandbad i 90 min.
    * Note 1: en hurtig tur i en mikrocentrifuge kan være nødvendigt at indsamle alt indhold fra de indvendige vægge og hætten.
    * Bemærk 2: volumen af tilsat prøve afhænger af antallet af celler, der bruges til at generere, at prøve: 11-12 ul af prøver fremstillet 2,0-5,0 x 10 5 celler 10 pi af 1,0 x 10 6 celle-prøver og 8 pi 1,5 x 10 6 celle-prøver.
    * Note 3: DNA er stadig meget viskøs, til at tage DNA ud skubbe pipettespids til bunden af ​​prøveglasset og omhyggeligt dreje spidsen rundt imod den indvendige væg af røret.
  3. Tag 1 eller 2 blå Transpack tubes * ud -80 ° C fryser og placere dem på tøris indtil videre brug. Tø dem hurtigt og overføre 12 pi til hver af de orange rør. Bland opløsningen ved forsigtigt at pipettere op og ned 3 gange. Spin rør ned i 2-3 sek, og tryk derefter på røret med fingeren for yderligere blanding og straks returnere den til 30 ° C vandbad i en anden 90 min.
    * Bemærk: Brug 1 blå rør til 5-6 reaktioner og 2 blå rør til 10-12 reaktioner.
  4. Efter 90 minutter, fortyndes reaktionsblandingen med 970 pi SM-puffer * (tabel 3) for at standse reaktionen og vortex på medium hastighed i 5 sek. Sæt rørene på is indtil videre brug.
    * Bemærk: Hvis antallet af celler er ≤ 5 x 10 5, anvende 500 pi SM-buffer (tabel 3) for at standse reaktionen, 2 rør (af den samme prøve) kan herefter kombineres senere (trin 6.4).

6.. Belægning Emballeret Genomisk DNA (Dag 2; Fortsat)

  1. Luk inverteret agar tstråler, der blev åbnet til tørring i morgen. Mærk bakkerne for hver prøve.
  2. 4,8 g X-gal opløses i 16,8 ml N, N-dimethylformamid (nødvendig for trin 6.5). Rør straks og sat på en shaker platform. Beskyttes mod lys. Opløsningen skal være klar i 20-30 min.
  3. Afmål SCS-8 E. coli-celler. For hvert sæt bakker * bruge en 50 ml konisk rør. Mærk røret med navnet på det pakkede DNA-prøve. Tilsæt 2 ml E. coli suspension for hver bakke.
    * Bemærk: For eksempel 3 x 10 5 GMP'er kræver et sæt af 8 bakker (se tabel 1). Således to portioner kræve 8 x 2 = 16 bakker. Hold portioner adskilt, og dermed forberede to 50 ml rør, med hver 8 x 2 = 16 ml E. coli suspension.
  4. Tilsæt 1 ml * emballeret DNA-prøve (fra trin 5.4) til den relevante 50 ml rør indeholdende SCS-8 E. coli portion og bland godt. Inkubér denne E. coli / fag blandingen i en rystende inkubatorbator (250-300 rpm) ved 37 ° C i 23 min.
    * Bemærk: Hvis DNA blev ekstraheret fra ≤ 5 x 10 5 celler blev 500 pi SM-puffer anvendt til at standse reaktionen (trin 5.4). På dette trin kan rørene kombineres og sættes til en 50 ml konisk rør.
  5. Når E. coli / fag blandingen inkubere, starter forberedelserne til den topagarose lag. Tilsæt 5 ml X-gal / N, N-dimethylformamid-opløsning (trin 6.2) til hver 800 ml kolbe af toplaget agaroseopløsning (fra trin 3.1.2 holdt ved 50 ° C). Slutkoncentration af X-gal vil være 1,5 mg / ml. X-gal kan fremskynde en smule, når de tilsættes til agarose. Swirl at opløse X-gal og sætte flasken tilbage i 50 ° C vandbad.
  6. Tag E. coli / fag-blandingen ud af inkubatoren (trin 6.4). Hver prøve kræver flere bakker, hver bakke, kræver 50 ml X-gal/agarose opløsning (trin 6.5). Hæld den nødvendige mængde X-gal/agarose for hver prøve (dvs. 50 ml xAntallet af bakker) på en større steril plastflaske og tilføje relevante E. coli / fag-blandingen. Swirl flasken for at blande. Opdel blandingen i portioner på 45-50 ml i 50 ml koniske rør. Antallet af rør skal være det samme som antallet af bakker, der kræves for den pågældende prøve.
    Bemærk: Den sidesten X-gal/agarose løsning vil blive brugt i trin 8.3. Opløsningen kan opbevares i et 50 ° C vandbad, indtil yderligere anvendelse.
  7. Hæld 50 ml topagarose blanding over den nederste halvdel af analysens bakken. Hurtigt sprede agarose ved at vippe analysebakkeenhed lidt i én retning.
    Bemærk: agarose afkøler meget hurtigt og bliver umuligt at spredes ud over bakken. Derfor skal udføres forholdsvis hurtigt og med agarose, der er blevet holdt ved 50 ° C. dette trin
  8. Lad topagarose hærde i mindst 15 min. Derefter vendes og åbne assay bakker for at lade dem lufttørre i 30 min (Figur 3). Luk bakkerne inkuberes analyseelementerne bakker omvendte (nederst agarlag side øverst) ved 37 ° C i 15-16 timer. Der må ikke stables mere end 5 bakker.

7.. Bestemmelse af en formodet mutanthyppigheden (Dag 3)

  1. Fjern bakkerne fra 37 ° C inkubator, og lad dem køle af. Tæl gennemskinnelige plakdannende enheder (PFU) på hver bakke, tilfældigt vælge 2 steder på bakkerne, tegne et kvadrat * på 2,5 x 2,5 cm 2 eller 5 x 5 cm 2 og tælle alle de PFU'er i hvert kvadrat med en markering celle tæller (figur 4A, B).
    * Bemærk: For at tegne den firkantede bruge en enhed, som vist i figur 5.. Hvis antallet af tælles PFU'er er ≥ 40, skal du bruge mindre firkantet, ellers bruge større.
  2. Tag gennemsnittet af kvadraterne tælles og ganges med 96, hvis at tælle med en mindre firkantet, eller formere dette tal med 24, hvis at tælle med den store. Tilføj antal PFU'er tælles for alle skuffer fra samig prøve. Dette er det samlede antal PFU'er genereret for at prøve.
  3. Næste, tælle mutant plaques i hver bakke. Bakkerne er nu kølet ned, hvilket vil bidrage til at finde de mutant plaques. For yderligere at lette spotting de blå plaques, flytte bakken over en rød og / eller hvid overflade, ark af rødt og hvidt papir fungerer godt. Circle nogen blå plak med en tuschpen. Optag formen og intensiteten af den blå farve for hver mutant (f.eks fuld, cirkel, sektor figur 4C) 36,37.
  4. Bestem den formodede mutanthyppigheden for hver prøve ved at dividere antallet af mutant PFU'er (trin 7.3) med det samlede antal af PFU'er (trin 7.2).

8.. Verifikation af formodede Mutant Plaques (dag 3-5)

  1. Ved hjælp af en Pasteur-pipette, core hver mutant (blå) PFU og overføre stikket i 250 ul sterilt SM-buffer (tabel 3). Tilsæt 25 ul chloroform, vortex i 5 sek end opbevares ved 4 ° C for at fortsætte den næste dag eller forlade i 2 timer ved RT, før du fortsætter med næste trin, at kontrollere, at mutant PFU er faktisk en mutant. Prøverne kan opbevares ved 4 ° C i mindst 1 år.
  2. Mærk en 1 ml og en 4 ml sterilt rør for hver mutant, der var tilsluttet. I den nye 1 ml tube, fortyndes resuspenderet fag frigivet fra agar stik (trin 8.1) 1:50 i steril SM buffer (2 pi prøve i 100 ul SM buffer (tabel 3)), vortex kortvarigt, der er afsat. Til 4 ml sterilt rør tilsættes 200 pi SCS-8 E. coli-kultur (fra trin 4.1) og 2 pi af den fortyndede fager fra det tilsvarende 1 ml rør, inkuberes ved 37 ° C i 5-10 minutter.
  3. Tilsæt 2,5 ml af topagarose indeholdende X-gal (venstre-over fra trin 6.6) til hver 4 ml tube, hvirvel rør blandes og hældes på en 60 mm NZY agarplade tidligere hældt (trin 3.6). Lad i 10 min (for at lade than topagarose størkne), vend skålen og inkuberes O / N ved 37 ° C.
  4. Den næste morgen, fjerne skålen fra rugemaskinen, og bestemme andelen af blå PFU'er på hver skål (figur 6). Når 70% eller mere af PFU'er er blå, er en mutant anses for bekræftet 38,39. Core mutant plak fra fadet og sat i et 1,5 ml skrue top rør, indeholdende 250 pi SM buffer (tabel 3) og 25 pi chloroform, det er nu klar til sekventering.
  5. Når 50% eller mindre af PFU er blå, betragtes det ikke som en reel mutant 38,39. Når hyppigheden af ​​blå PFU er mellem 60-70%, kontrollere tilbage med i noter om formen af ​​pladen, hvis formen af ​​PFU var "fuld", fortsætte med sekventering.

9.. Sekventering for mutationer i LacI G ene

  1. Opsæt PCR-reaktioner i en reaktion volumen 25 ul, herunder 1,5 μ; L plaque supernatant (skabelon, trin 8.4), fremad-primeren SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') og den reverse primer SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Brug af PCR forlænger Taq-polymerase kit ifølge producentens anvisninger. Cykling er som følger: 94 ° C i 2 minutter, derefter 35 cykler ved 94 ° C i 20 sek, 60 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 2 minutter efterfulgt af et afsluttende trin på 72 ° C i 5 min .
  2. Tag en 5 gl aliquot af hver reaktion og kørt på en 0,8% agarosegel for at bekræfte amplifikation.
  3. Rense PCR-reaktioner ved hjælp af Augencourt oprydning kit ifølge producentens anvisninger.
  4. Kvantificere skabelon DNA.
  5. Brug ~ 100 ng PCR-produkt som template DNA til sekventering. Sequence ampliconer i begge retninger ved hjælp af de samme PCR primere som sekventeringsprimere (se ovenfor).
  6. Saml sekvenser og tilpasse med reference sekvensen LacI 40 at detektere Mutations.

Representative Results

In vivo mutagenese assay måler en sjælden begivenhed (mutant PFU'er) blandt mange hændelser (alle PFU'er). Ved at udføre analysen med lille antal celler, er det muligt, at resultatet bliver væsentligt påvirket af falsk positive og falsk negative resultater. For at løse dette problem, vi udførte en seriel fortynding eksperiment med fraktionerede knoglemarvsceller, der er høstet fra tre forskellige dyr. Vi målte mutanthyppigheden i knoglemarven af disse dyr under anvendelse af 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 og 1,75 x 10 5 celler. Resultaterne (figur 7) viser en lineær sammenhæng mellem input celle og antallet af PFU genererede. Vigtigere er det, mutanthyppigheden er konsistent, uanset om målestokken med lave eller høje antal celler. Selv om det ikke direkte testet (på grund af mangel på celler), er der ingen grund til at tro, at dette ikke er tilfældet for LSKs og GMP'er.

t "> Det vigtigste skridt i denne mutagenese assay er isolering af genomisk DNA (trin 2). Selv om DNA-koncentrationen ideelt set bør ≥ 500 ng / ul, denne protokol fungerer godt med 40-150 ng / ul. mere vigtigt er den 260/280 ratio (dette bør være> 1,8-2,0) og molekylvægt (bør være omkring 300-500 kb). Det anbefales, når man ikke er bekendt med analysen at kontrollere kvaliteten og størrelsen af ​​det isolerede DNA . Figur 8 viser et eksempel på en elektroforese køre af DNA med høj molekylvægt.

Markeringerne enkelte PFU'er på en bakke vist i figur 4B repræsenterer en rimelig og opnåelige tæthed af plaques, når man starter med et lille antal af oprensede celler en bakke skal holde mellem 40-150 PFU'er / lille firkant. I dette særlige eksperiment, det lille torv i figur 4B indeholder 103 plaques. Den anden plads på bakken, vises i det øverste hjørne af figur 4A 41, fordi vi bruger lidt mindre bakker og 12.000 PFU på disse bakker ikke tillade os en god skelnen mellem de enkelte plaques.

Figur 4C viser eksempler på de forskellige typer af blå mindeplader, der kan observeres. I LacI mutagenese assay, morfologi plaques (dvs. fuld, sektor eller cirkel) er en indikation af oprindelsen af mutationen, fuld er en mutation fra mus oprindelse, mens de to andre sandsynligvis er produceret i E. coli 36,37. Ved genudpladning (se also figur 6), næsten alle "fuld" plaques reproducere> 70% blå plaques igen, mens kun en meget lille del af sektoren plaques gøre og næsten ingen af de ofte mindre, cirkulære plaques.

Tabel 2 viser reproducerbarheden af plakdannelse med relativt små antal af oprensede celler sammenlignet med høje antal af knoglemarvsceller (den samme pulje af celler, hvor cellerne blev sorteret fra) og miltceller.

Mutant PFU'er bekræftes, først ved genudpladning (Figur 6 viser repræsentative eksempler på retter til bekræftelse af primær mutant (blå) PFU'er), og for det andet ved sekventering. Retterne i Figur 6 indeholder> 70% blå PFU'er (bottom to) bekræfter, at mutanten opstod i mus (og ikke i E. coli). Øverste venstre parabol viser ingen blå PFU'er dog, og derfor bør den primære PFU ikke regnes som mutanten og sequencing er ikke nødvendig. Den rigtige skålen viser ~ 65% blå PFU. Afhængig af formen af ​​den primære plaque, vil denne prøve blive sendt ud til sekventering (se trin 8.4). Kun hvis en DNA-mutation kan bekræftes ved sekventering vil PFU regnes som mutanten. Hvis du er usikker på formen af ​​PFU, sekvens!

Figur 1
Figur 1.. Sca-1-farvning på knoglemarvsceller fra vildtype C57BL6 mus (B6), transgene Laci mus (LacI) og afkom af en krydsning mellem disse to (B6 x LacI). Knoglemarvceller af B6 mus udtrykker Sca- 1 på deres celleoverflade, og denne egenskab anvendes til at oprense stamceller-og progenitorceller. Transgene Laci mus på en B6 baggrund imidlertid ikke udtrykker Sca-1, denne markør, skal have været tabt WHile oprettelse af kolonien. At genindføre Sca-1 i transgene lacI mus, blev disse mus krydset med regelmæssige B6 mus.

Figur 2
Figur 2.. DNA dialyse system. Tre membraner beklæder en tyktflydende DNA-opløsning i midten (farvet blå for bedre visualisering) er flydende på TE-buffer. De røde pile viser små rifter i membranen, som anvendes til prøveidentifikation.

Figur 3
Figur 3.. Effektiv måde at tørre 60 eller flere agar / agarose indeholdende bakker.

gether.within-side = "altid"> Figur 4
Fig. 4. Påvisning af plakdannende enheder (PFU). Afbildet er (dele af) store agar bakker (afbildet i figur 3) med primære kolonier af phag-inficerede E. coli. (A) Vist er en hel plade med 2 små firkanter trukket på den til at tælle plaques. Den røde insert er vist forstørret i (B). (B) Hver enkelt sort markør prik viser en klar vildtype PFU i agarplade (103 i alt). (C) forskellige former for potentielt mutant PFU'er. Klik her for at se større billede.

s/ftp_upload/50752/50752fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig5.jpg "/>
Figur 5.. Plexiglas tælle pladser. Afbildet er en lille og stor optælling firkantet. De indre målinger af den store plads er 5 cm x 5 cm, der af den lille firkant 2,5 cm x 2,5 cm.

Figur 6
Fig. 6. Bekræftelse af mutant plakdannende enheder (PFU). Vist er 4 små retter inokuleret dagen før med et fortyndingsmiddel, en blå PFU. Den øverste venstre parabol viser ingen blå PFU'er. Den øverste højre parabol viser ~ 65% blå PFU'er. De to nederste skuffer viser 80-90% blå PFU'er (til venstre) og 100% blå PFU'er (til højre). De røde pile angiver klar (vildtype) PFU'er.

Ad 7 "fo: content-width =" 4tommer "fo: src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
Figur 7. Mutanthyppigheden i ufraktioneret knoglemarv. Afbildet er (A) antallet af PFU (B) antallet af mutanter og (C) mutanthyppigheden målt i tre forskellige dyr (24-26 måneder gamle), som er repræsenteret med forskellige farver. For hver mus blev målingerne udført på fire forskellige stikprøvestørrelser: 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 og 1,75 x 10 5 celler. Dataene viser, at inden for dette område af celler, stikprøve ikke væsentligt påvirke mutanthyppigheden målinger.

Figur 8
FigUre 8. Pulserende-field elektroforese af højmolekylære DNA-prøver isoleret fra oprensede celler. Genomisk DNA blev isoleret som beskrevet i trin 2 i protokollen og køre på et system Bio-Rad (CHEF-DR III). De forskellige prøver på geleen er DNA-prøver isoleret fra leveren (Li, bane 1), knoglemarvsceller forarmet af modne afstamning + celler (LB, bane 2 og 14), CD34 + LSK-celler (L, bane 6), kystforvaltningsplaner (bane 7-9), god fremstillingspraksis (bane 11 og 12) og Sca-1 +-celler (S, lane 15). Bane 4 holder stigen for DNA med høj molekylvægt. Billedet viser, at størstedelen af ​​DNA'et er høj molekylvægt (> 600 kb).

Tabel 1. Diverse prøve parametre oprensede populationer, hel knoglemarv og milt. Brug denne tabel hvor det er angivet i protokollen. For hver population er anført på toppen, antallet af celler (x 10 5) per portion DNA fordøjelse tid, mængden af DNA-prøvenefter dialyse, angives antal reaktioner, der kræves for hver alikvot og antal bakker, der kræves pr alikvot til venstre. De fordøjelsesperiode ved 50 ° C er afgørende for succes af forsøget.

Tabel 1

LSK = Lin - Sca-1 + Kit + + celler CMP = engageret myeloid stamfader, GMP = granulocytisk / monocytic stamfader, WBM = (usorteret) hel knoglemarv. Miltceller usorteret.

Tabel 2. Effektivitet af plak dannelse er sammenlignelig mellem forskellige cellepopulationer. Denne tabel viser plak dannelse mellem de forskellige befolkningsgrupper. Seks måneder gamle C57BL / 6 mus blev anvendt til disse eksperimenter (lårben og skinneben 10-11 mus pr eksperiment, 6 eksperimenter i alt). Alle på nær én af de bestande, der anvendes i disse forsøg gave mindst 1, op til 24, (bekræftet) mutant PFU'er (Zhou et al., manuskript under udarbejdelse). PFU numre kan variere per mus stamme.

Tabel 2

LSK = Lin - Sca-1 + Kit + + celler CMP = engageret myeloid stamfader, GMP = granulocytisk / monocytic stamfader, WBM = (usorteret) hel knoglemarv * Miltceller er usorteret.. SD = standardafvigelse.

Tabel 3. Vejledning til forberedelsen af yderligere reagenser.

Tabel 3

§ Fra Stratagene instruktionen for RecoverEase DNA Isolation Kit

¶ Fra Stratagene instruktionen for Transpack Packaging Extract

Discussion

In vivo-mutagenese-assay beskrevet heri er baseret på LacI transgene musemodel oprindeligt blev genereret af Kohler et al. 18. Denne model anvender en λ-fag vektor, der bærer en lacl reportergen. De to cos flankerer vektoren giver mulighed for en relativt simpel genvinding og efterfølgende pakning i infektiøse fagpartikler, anvendes til at inficere E. coli. En blå plak vil blive genereret ved fag-inficerede E. coli, der indeholder et muteret LacI-genet. Den blå plak er sat mod en farveløs baggrund, hvilket i høj grad forenkler opgaven med mutant scoring. DNA sekventering teknikker kan anvendes til at identificere positionen og typen af ​​mutation, der har fundet sted, som kan bidrage yderligere undersøgelser i mekanismerne bag mutagenese.

Ændringerne vi til protokollen af ​​denne mutagenese assay tillader en at bruge det med FACS-renset hematopoietic cellepopulationer. Vi fandt imidlertid, at en reproducerbar analyse kræver stadig mindst 2 x 10 5 hæmatopoietiske celler for at sikre tilstrækkelige mængder af høj kvalitet DNA. Da hyppigheden af langsigtet genbefolkning HSCs er meget lav 29, der udfører en mutagenese analyse på disse HSCs er på dette tidspunkt ikke kan gennemføres. Den stamcelle-beriget population vi bruger i denne protokol, LSK celler, indeholder foruden Flk-2 - langsigtede repopulating HSCs, også FLK-2 - kortsigtede repopulariserende HSCs og Flk-2 +-celler, der repræsenterer multipotente stamfader celler (MPP) 42. På trods af denne begrænsning, vi føler, at bruge LSK celler som en read-out for HSCs i denne mutagenese assay er rimelig, da det blev påvist, at LSK celler opfører sig mere som LSK-Flk-2 - HSCs i form af bedre udnyttelse NHEJ end stamceller 5. Endvidere arbejdes fra Rossi et al. 8. foreslår, at MPP'er er bedre i kopiering med DAMAGed DNA end HSCs, især når de bliver ældre, hvilket fører os til hypotesen, at antallet af mutanter fundet i LSK befolkning afspejler sammensætningen af ​​HSC'er snarere end MPP'erne.

Da et lille antal sorteret celler opnås ved hvert forsøg på et vigtigt spørgsmål at overveje i planlægningsfasen af denne in vivo mutagenese assay, er prøvens størrelse (dvs. det samlede antal plaques pr prøve) er nødvendige for at opnå statistisk signifikans. Med andre ord, når målet er at for eksempel sammenligne mutationsfrekvensen manipulerede LSK celler til vildtype kontrol LSK celler, hvor mange plaques i alt er nødvendige for hvert LSK befolkning til at opdage en to eller tre-fold forskel i mutationsfrekvens? Af note, kan det samlede antal plaques kombineres fra alle eksperimenter, da vi fandt ingen signifikant forskel mellem sortering eksperimenter, i hvert fald i vildtypeceller, baseret på en negativ binomial regressionsanalyse 43. Plaque nummer er vigtigt at vide, fordi det vil bestemme antallet af mulige, der skal udføres (~ 10.000 for WBM og alment praktiserende læger og ~ 7.000 for Spleen, LSKs og kystforvaltningsplaner). Da mutationsfrekvenser er små i vildtype-væv 44, den normale tilnærmelse statistisk sammenligne disse er ikke korrekt. Derfor bruger vi Poisson-fordelingen, da det tilnærmelsesvis sande binomialfordeling (af mutationen frekvens), når denne frekvens er lille og stikprøvestørrelsen er relativ stor, Huffman 45 indeholder en formel (ligning 4) til at beregne stikprøvestørrelse baseret på Poisson-fordeling. Når de anvendes til hypotetiske mutationsfrekvenser 2,5, 4 og 7 mutationer per 100.000 celler i kontrol celler 44, kræver vi 456.949 plager, 285.592 og 163.196, henholdsvis at opdage en betydelig to-fold forskel (to prøve-test med to tailed betydning på 0,05 og magt på 0,80). Færre plaques er forpligtet til at opdage en tre-foldforskel: 122.148, 76.342 og 43.624, hhv. Således er antallet af plaques, der kræves for hver population af interesse (og dermed antallet af former, der er nødvendige for at opnå nok celler) afhænger af mutationsfrekvensen, der kan forventes i kontrolgruppen cellepopulation og den forudsagte fold-ændring i sammenligning befolkning.

Det vigtigste skridt i denne mutagenese assay er isolering af genomisk DNA (trin 2). Selv om det er vigtigt at starte denne protokol med DNA-prøver af høj kvalitet (se "repræsentative resultater"), når du arbejder med sorterede celler, celle tal er ofte begrænset, og kan ikke være spildt på at bestemme DNA-koncentration eller størrelse. Vi fandt, at en anden god indikator for kvaliteten af ​​DNA-prøven er dens viskositet, ved trin 2.9 prøven bør være yderst tyktflydende og svært at arbejde med. Det kræver lidt øvelse at få dette skridt til højre. Derfor anbefales det, at arbejde ud protokol med store celletal, fx med hel knoglemarv eller sorteret Sca-1 +-celler, og blive fortrolig med at isolere DNA fra disse prøver og lære at bedømme kvaliteten af DNA ved sin viskositet.

Kvalitet og størrelse af DNA påvirker antallet af PFU'er genereres. Når DNA isolation skridt er perfektioneret, det næste vigtige element i optimering af analysen er massefylden af PFU'er per bakke. Tabel 1 viser det anbefalede antal bakker til brug for hver type prøve, der svarer til en optimal antal celler for at prøve. Brug af denne retningslinje bør resultere i bakker, hvor der stadig kan skelnes individuelle plaques, endnu ikke spredt for tyndt. En bakke skal holde mellem 40-120 PFU'er pr lille torv, vist i figur 4B eksempel repræsenterer en rimelig tæthed. Med disse optimering aspekter arbejdede, antallet af PFU genereret per prøve er yderst effektiv og reproducerbar (tabel 2).

"> LACI transgene musemodel er blevet anvendt med en række andre væv, men ikke i forbindelse med et forholdsvis lille antal højt oprensede populationer Når de anvendes til andet (end hæmatopoietisk) vævsbegrænset stamcelle-berigede populationer, det anbefales. at lægge særlig vægt på DNA isolation procedure. de kan variere fra celletype til celletype og anbefalingen for hæmatopoietiske celler kan ikke nødvendigvis arbejde for andre væv celletyper De kritiske faktorer, såsom mængden af ​​reagenser, ved hvilken temperatur det proteinase K fordøjelse skal finde sted, og vigtigst af alt vil det proteinase K fordøjelse tid skal udarbejdes for hver celletype; denne protokol kan tjene som et udgangspunkt.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke David R. Rodriguez, MA for grafisk design og fotografering i dette manuskript. Dette arbejde blev støttet med midler fra GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) og Cancer Center Support Grant (P30CA054174) til UTHSCSA Flowcytometri Core faciliteten og UTHSCSA Advanced Nucleic Acids Core Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM Pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N,N-Dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/Coulter A63880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790, (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9, (3), 204-217 (2008).
  3. Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7, (2), 186-197 (2010).
  4. Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7, (2), 174-185 (2010).
  5. Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7, (3), (2012).
  6. Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12, (6), 572-582 (2010).
  7. Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24, (4), 861-871 (2005).
  8. Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, (7145), 725-729 (2007).
  9. Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102, (5), 1626-1633 (2003).
  10. Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24, (12), 2056-2062 (2010).
  11. Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22, (3), 551-558 (2008).
  12. Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91, (11), 1546-1550 (2006).
  13. Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336, (7641), 444-446 (2008).
  14. Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88, (11), 4296-4303 (1996).
  15. Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2, (5), 547-559 (2003).
  16. Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34, (2), 243-248 (2002).
  17. Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110, (13), 4385-4395 (2007).
  18. Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18, (4), 316-321 (1991).
  19. Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327, (1-2), 57-66 (1995).
  20. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, (17), 9073-9078 (1996).
  21. Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51, (4), 344-348 (2010).
  22. Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274, (5673), 770-775 (1978).
  23. Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288, (1), 133-149 (1993).
  24. Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189, (2), 273-284 (1986).
  25. Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129, (2), 317-326 (1991).
  26. Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292, (1), 69-81 (1993).
  27. Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39, (1), 55-68 (2002).
  28. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20, (12), 3254 (1992).
  29. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, (7), 1109-1121 (2005).
  30. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, (6674), 193-197 (2000).
  31. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
  32. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, (5272), 242-245 (1996).
  33. Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. (2001).
  34. Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. (2009).
  35. Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. (1992).
  36. Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372, (1), 97-105 (1996).
  37. Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
  38. Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11391-11396 (2000).
  39. Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373, (2), 277-284 (1997).
  40. de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148, (4), 1441-1451 (1998).
  41. Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25, (3), 231-245 (1995).
  42. Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105, (7), 2717-2723 (2005).
  43. Hilbe, J. M. Negative Binomial Regression. second edn. Cambridge University Press. (2011).
  44. de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13, (2), 109-114 (1998).
  45. Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33, (2), 224-226 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics