Optische Detektion von * These authors contributed equally

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ein Label-freien optischen Biosensor zur schnellen Nachweis von Bakterien wird eingeführt. Der Biosensor auf einem nanostrukturierten porösen Si, das dazu bestimmt ist, direkt zu erfassen, die Zielbakterien-Zellen auf ihrer Oberfläche basiert. Wir verwenden monoklonale Antikörper, auf die poröse Wandler immobilisiert, wie die Capture-Sonden. Unsere Studien zeigen die Anwendbarkeit dieser Biosensoren zum Nachweis von geringen Bakterienkonzentrationen innerhalb von Minuten, ohne vorherige Probenaufbereitung (beispielsweise Zell-Lyse).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ein Label-freien optischen Biosensor auf der Basis eines nanostrukturierten porösen Si ist für die schnelle Erfassung und Erkennung von Escherichia coli K12 Bakterien als Modell Mikroorganismus entwickelt. Biosensor beruht auf direkten Bindung der Zielbakterienzellen auf ihrer Oberfläche, während keine Vorbehandlung (z. B. durch Lyse der Zellen) der untersuchten Probe ist erforderlich. Mesoporöse Si-Dünnfilm als die optische Wandlerelement des Biosensors verwendet wird. Unter Beleuchtung mit weißem Licht, zeigt die poröse Schicht gut aufgelöste Fabry-Perot-Streifenmuster in seiner Reflexionsspektrum. Anwenden einer schnellen Fourier-Transformation (FFT), um die Reflexionsdaten ergibt einen einzigen Peak. Änderungen in der Intensität der Peak FFT überwacht. Somit Zielbakterien zu erfassen auf die Biosensor-Oberfläche, durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, induziert messbare Veränderungen in der Intensität der FFT-Spitzen, so dass für eine "Echtzeit" Beobachtung von Bakterien Befestigung.

nt "> Die mesoporösen Si-Film, durch einen elektrochemischen Anodisierung hergestellt wird, wird mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die Zielbakterien konjugiert. Die Immobilisierung Immunaktivität und Spezifität der Antikörper durch Fluoreszenz-Markierungsexperimente bestätigt. Sobald der Biosensor wird den exponierten Zielbakterien, werden die Zellen direkt auf die Antikörper-modifizierten porösen Si-Oberfläche eingefangen. Diese spezifischen Einfangen Ereignisse führen Intensitätsänderungen in der optischen Dünnfilm-Interferenzspektrum des Biosensors. Wir zeigen, dass diese Biosensoren können relativ niedrige Bakterienkonzentrationen zu erkennen (Erkennungs Grenze von 10 4 Zellen / ml) in weniger als einer Stunde.

Introduction

Frühe und genaue Identifizierung von pathogenen Bakterien ist für Lebensmittel-und Wassersicherheit, Umweltüberwachung und Point-of-Care-Diagnostik ein extrem wichtig. Da die traditionellen Mikrobiologie Techniken sind zeitaufwendig, mühsam und nicht die Fähigkeit, Mikroorganismen in "Echtzeit" oder außerhalb der Laborumgebung zu erfassen, werden Biosensoren entwickelt, um diese Herausforderungen 5.2 erfüllen.

In den letzten Jahren hat porösen Si (PSi) als vielversprechende Plattform für die Gestaltung von Sensoren und Biosensoren 6-20 entstanden. Im vergangenen Jahrzehnt zahlreiche Studien über PSi-basierte optische Sensoren und Biosensoren veröffentlicht wurden 21,22. Die nanostrukturierte Schicht PSi wird typischerweise durch elektrochemische anodische Ätzen aus einem einkristallinen Si-Wafer hergestellt. Die daraus resultierenden PSi Nanomaterialien weisen viele vorteilhafte Eigenschaften, wie große Oberfläche und Freivolumen, Porengrößen, die gesteuert werden kann und abstimmbaren optischaften 10,16. Die optischen Eigenschaften der Schicht PSi wie Photolumineszenz 8,11 und Weißlicht-Interferometrie Reflexionsbasis 7,19, werden stark durch Umweltbedingungen beeinflusst. Erfassung von Gastmolekülen / Zielanalyten in der porösen Schicht zu einer Änderung des mittleren Brechungsindex des Films, als eine Modulation in der Photolumineszenz oder eine Wellenlängenverschiebung des Reflexionsspektrum 10 beobachtet.

Obwohl die überwiegende Innovation in PSi optischen Biosensor-Technologie, gibt es nur wenige Berichte über PSi-basierte Plattformen für Bakterien Erkennung 6,8,20,23-29. Zudem sind die meisten dieser Proof-of-Concept-Studien "indirekte" Nachweis von Bakterien nachgewiesen. Somit wird im allgemeinen vor der Lyse der Zellen erforderlich ist, um die angestrebten Protein / DNA-Fragmente, die charakteristisch für die untersuchten Bakterien 29 zu extrahieren. Unser Ansatz ist, um direkt erfassen die ZielbakterienZellen auf der PSi Biosensor. Daher werden monoklonale Antikörper, die spezifisch für Zielbakterien sind, auf die poröse Oberfläche immobilisiert ist. Bindung der Bakterienzellen durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, auf die Oberfläche des Biosensors induzieren Änderungen in der Amplitude (Intensität) des Reflexionsspektrums 24-26.

In dieser Arbeit berichten wir über die Konstruktion eines optischen PSi-basierten Biosensor und zeigen ihre Anwendung als markierungsfreien Biosensoren Plattform für den Nachweis von Escherichia coli (E. coli) K12 Bakterien (als Modell verwendeten Mikroorganismus). Die überwachte optische Signal ist das Licht von der PSi Nanostruktur durch Fabry-Perot-Dünnschicht-Interferenz (Abbildung 1A) wider. Änderungen in der Lichtamplitude / Intensität auf spezifische Immobilisierung der Zielbakterienzellen korreliert auf die Biosensor-Oberfläche, was eine schnelle Detektion und Quantifizierung der Bakterien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Herstellung von oxidierten porösen SiO 2

  1. Si-Wafer Etch (einseitig auf der <100>-Gesicht poliert und stark dotierten p-Typ, 0,0008 Ω · cm) in einem 3:1 (v / v) Lösung von wässrigen HF und absolutem Ethanol für 30 Sekunden bei einer konstanten Strom Dichte von 385 mA / cm 2. Bitte beachten Sie, dass HF ist eine stark ätzende Flüssigkeit, und es sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden.
  2. Spülen der Oberfläche des resultierenden porösen Si (PSI)-Films mit absolutem Ethanol mehrere Male, trocknen die Filme unter einer trockenen Stickstoffgas.
  3. Oxidieren die frisch geätzten PSi Proben in einem Rohrofen bei 800 ° C für 1 Stunde in der Luft (legen Sie die Probe in den Ofen bei Raumtemperatur zu erwärmen den Ofen auf 800 ° C, lassen im Ofen 1 Stunde, schalten Sie die Ofen und Entfernen der Proben aus dem Ofen nur bei Raumtemperatur).

2. Biofunktionalisierung von PSIO 2 Gerüste

  1. Inkubation eine oxidierte PSi (PSiO 2) Probe für 1 Stunde in mercaptopropyl (Trimethoxysilans-3) 95% (MPTS)-Lösung (108 mM in Toluol).
  2. Mit Toluol, Methanol und Aceton gründlich Silan behandelten PSIO 2 Probe; trocken unter einer trockenen Stickstoffgas.
  3. Inkubieren des silanmodifizierten PSIO Probe 2 für 30 min in 1 ml 100 mM PEO-Iodacetyl Biotin-Lösung.
  4. Mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mehrfach ausspülen Biotin behandelten PSIO 2 Probe.
  5. Inkubieren der Biotin-modifizierte PSIO 2 Probe für 30 min in 1 ml von 100 ug / ml Streptavidin (SA)-Lösung.
  6. Mit 0,1 M PBS-Lösung mehrmals Spülen Sie die SA-2 behandelt PSIO Probe.
  7. Inkubieren der resultierenden SA-modifizierten PSIO 2 Probe für 30 min in 1 ml von 100 ug / ml biotinyliertem E. coli-Antikörper (Immunglobulin G, IgG)-Lösung oder mit 100 &mgr; g / ml biotinyliertem Kaninchen-IgG (als ein Modell für einen monoklonalen Antikörper).

3. Fluoreszenzmarkierung und Fluoreszenzmikroskopie

  1. Inkubieren der IgG-modifizierten Oberflächen mit 15 ug / ml Fluorescein (FITC)-markierten anti-Kaninchen-IgG für 40 min und mit 15 ug / ml Fluorescein (FITC) markierten anti-Maus-IgG als Kontrolle.
  2. Spülen Sie die modifizierten Proben mit 0,1 M PBS-Lösung mehrmals.
  3. Untersuchen Sie die Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop.

4. Bakterien Kultur

  1. Kultivieren Sie E. coli K12-Bakterien in einer 10-ml-Röhrchen mit 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (Zusammensetzung des Mediums in 1 l deionisiertem Wasser: 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 10 g Trypton). Inkubation die Bakterien Schütteln über Nacht bei 37 ° C
  2. Überwachung der Bakterienkonzentration durch Lesen der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm aufweist. Nach Wachstum über Nacht in LB-Medium, lesen Sie die OD 600 mit einem Spektralphotometer, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. Die Anzahl der Zellen ist schrecklichctly proportional zu der OD 600-Messungen (1 OD 600 = 10 8 Zellen / ml).

5. Bakterien Sensing

  1. Legen Sie die IgG-modifizierten PSIO 2 und ordentlich PSIO 2 (als Kontrolle) Proben in einem maßgeschneiderten Plexiglas Durchflusszelle. Die Durchflusszelle zu befestigen, um sicherzustellen, daß die Probe das Reflexionsvermögen an der gleichen Stelle während aller Messungen gemessen.
  2. Die Proben mit E. inkubieren coli K12-Suspension (10 4 Zellen / ml) für 30 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Bakteriensuspension durch Spülen der Zelle mit 0,85% w / v Kochsalzlösung für 30 min.
  3. Überwachung der Änderungen der Reflexionsgraddaten während des Experiments. Alle optischen Messungen müssen in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden. Spektren sollten mit einer CCD-Spektrometer gesammelt und durch Anlegen schnelle Fourier-Transformation (FFT), wie zuvor beschrieben 25,26 analysieren.
  4. Bestätigen die Anwesenheit der Bakterien auf dieBiosensor-Oberfläche, durch Beobachtung der Proben unter einem Lichtmikroskop aufrecht unmittelbar nach der Biosensor-Experiments.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oxidiert psi (PSIO 2) Filme werden hergestellt, wie in dem Protokoll Text beschrieben. 1B zeigt ein hochauflösendes Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme des erhaltenen PSi Film nach der thermischen Oxidation. Die PSIO 2-Schicht wird durch gut definierte zylindrische Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 30-80 nm aufweist.

Der monoklonale Antikörper (IgG)-Moleküle werden auf die PSIO zwei Oberflächen mit Hilfe eines gut etablierten Silanisierung Technologie gepaart mit einem Biotin-SA System aufgepfropft. Die detaillierte Syntheseschema ist in Abbildung 2 dargestellt. Zuerst wird die thermisch oxidierte Oberfläche von MPTS silanisiert, was zu einer Thiol-silanisierte Oberfläche (Abbildung 2c). Im folgenden Schritt wird die aktivierte Oberfläche mit einer SH-reaktive Linkermoleküle, Biotin (Fig. 2d), gefolgt von der Bindung der Proteine ​​über Biotin SA-SA Brücken an das Biotin-modifizierte Oberfläche inkubiert (2e). Der letzte Schritt bei der Funktionalisierung des Biosensors Oberfläche beinhaltet die Biokonjugation von biotinyliertem monoklonalen Antikörper gegen das SA (Fig. 2f).

Die Befestigung der Antikörper an das PSIO 2 Oberfläche durch Fluoreszenzmarkierung, gefolgt von Beobachtung der Oberfläche unter dem Fluoreszenzmikroskop bestätigt. Zusätzlich Fluoreszenzuntersuchungen können wir die Aktivität und die antigene Spezifität der Oberfläche immobilisierten Antikörper (Kaninchen-IgG) durch Bindung von fluoreszenzmarkierten Anti-Kaninchen-IgG und anti-Maus-IgG als Kontrolle charakterisieren. Abbildung 3 fasst die Ergebnisse dieser Experimente .

Um Bakterien Biosensorik zeigen, haben wir eine spezielle E verwendet coli IgG statt das Modell IgG (Kaninchen-IgG). Auch hier ist der Ansatz, um Änderungen in der Amplitude (Intensität) des Lichts von der PSIO 2 nanostr reflektiert überwachenucture. In den Erfassungsversuchen werden die Biosensoren in einer Strömungszelle, um fest um sicherzustellen, daß die Probe das Reflexionsvermögen an der gleichen Stelle in allen Messungen gemessen. Das gesamte Experiment wird in nasser Umgebung durchgeführt und die Probe Reflexionsspektrum kontinuierlich überwacht wird. Die Biosensoren sind E. ausgesetzt coli K12-Suspension (10 4 Zellen / ml) für 30 min, wonach eine Pufferlösung zum Waschen des Biosensors Fläche (zur Entfernung von losen Bakterien) eingesetzt. Eine FFT-Spektrum des Biosensors vor und nach der Einführung des E. coli-Bakterien (10 4 Zellen / ml) ist in Fig. 4a (oben) gezeigt. Somit wird nach der Exposition gegenüber E. coli-Bakterien (und nachfolgende Waschschritt) ein Intensitätsverlust von 7 ± 1% registriert wird und geringfügig ändert (weniger als 0,5% ige Abnahme der Intensität FFT) für die unmodifizierte PSIO 2 Fläche (4b, oben) beobachtet. Darüber hinaus wird in ous, um die Anwesenheit von eingefangenen Zellen auf der Oberfläche PSIO 2 bestätigen, werden die Biosensoren unter einem Lichtmikroskop sofort nach Beendigung des Biosensor-Experiment. 4a (unten) zeigt immobilisierten Bakterienzellen auf dem Biosensor Oberfläche beobachtet, während keine Zellen beobachtet auf der nicht modifizierten Oberflächen (Kontrolle), siehe Fig. 4b (unten).

Figur 1
1. (A) Typische Reflexionsspektrum eines typischen Fabry-Pérot PSIO 2 Nanostruktur (links) und der entsprechenden Spektrum nach einer schnellen Fourier-Transformation (rechts). Die Position und die Größe des resultierenden einzelnen Peak überwacht. (B) Eine Querschnittshochauflösenden Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme (secZWEIT Elektronen) eines PSIO 2-Schicht (30 s geätzt bei 385 mA / cm 2).

Figur 2
2. Schematische Darstellung der Syntheseschritte folgen, um die PSIO 2 Oberfläche mit Antikörpern biofunctionalize. (A) Eine anodische elektrochemische Ätzen wird verwendet, um eine PSi Schicht aus einem Einkristall-Si-Wafer herzustellen. (B) Die frisch geätzte Probe wird dann thermisch bei 800 ° C oxidiert, (C) Die PSIO 2-Oberfläche wird zunächst mit MPTS reagierte auf freien Thiolgruppe Oberfläche (aktiviert PSIO 2 Film) erstellen. (D) Inkubation des aktivierten Folie mit PEO-Iodacetyl-Biotin an biotinylierte Oberfläche zu erzeugen. (E) Inkubation der biotinylierten surface mit SA. (F) Inkubation der modifizierten Oberfläche mit biotinylierten Antikörpern. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 3
3. Ergebnisse der Fluoreszenzmarkierungsexperimenten, die Aktivität und antigene Spezifität des immobilisierten IgG bestätigen. Die Proben werden unter einem Fluoreszenzmikroskop bei einer konstanten Belichtungszeit beobachtet. (A) Komplette Biokonjugation PSIO 2 + MPTS + Biotin + SA + biotinyliertem Kaninchen-IgG und FITC-Anti-Kaninchen-IgG, (B) Kontrollexperiment mit FITC-Anti-Maus-IgG, (C) Kontrollexperiment, keine IgG, PSIO 2 + + Biotin MPTS + SA und FITC-Anti-Kaninchen-IgG.

Hinweis: Diese Pläne sind für illustratIonen-Zwecke nur als Konjugation von IgG tritt auch in den Poren.

Fig. 4
4. E. coli Biosensor-Experimente und entsprechende optische Mikroskopbilder der Biosensoren unmittelbar nach der Experimente. Die Biosensoren sind mit 10 4 Zellen / ml inkubiert E. coli-Suspensionen. Legende: (a) IgG-modifizierten PSIO 2, (b) ordentlich (unveränderte) PSIO 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ein Label-freien optischen Immun, basierend auf einem PSIO 2 Nanostruktur (ein Fabry-Perot-Dünnfilm) hergestellt wird, und seine potentielle Anwendbarkeit als Biosensor für Nachweis von Bakterien wird bestätigt.

Änderungen und Fehlersuche

Eines der Hauptprobleme bei der Entwicklung eines Immun ist die Anfälligkeit von Antikörpern gegen unerwünschte Konformationsänderungen während der Abscheidung und Musterbildung auf dem festen Substrat, das zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Biosensors 31,32 führen können, zu unterziehen. Um dieses Problem zu minimieren, wird die Konjugation der Antikörper an die Oberfläche PSIO 2 durch Biotin-SA Brücken erreicht. SA und Biotin werden üblicherweise in vielen biotechnologischen Anwendungen aufgrund ihrer hohen Bindungsaffinität (Kd ~ 10 -13 M) verwendet. Das Biotin-SA-Link ist eine der häufigsten Chemikalien für die Rezeptor-Immobilisierung in Biosensor-Entwicklung 10,32,33,34 praktiziert. Die Zugänglichkeit der immobilisierte Antikörper kann durch die Biotin-SA Reaktion, die eine flexible Verbindung zwischen der festen Oberfläche und der IgGs 31,35 bietet geregelt werden. Somit wird die erste PSIO 2 mit Biotin / SA biofunktionalisierte die Konjugation von biotinylierten Antikörpern auf die Nanostruktur zu ermöglichen.

Grenzen der Technik

Die wichtigsten Einschränkungen dieser Regelung Biosensorik werden den Einsatz der Bakterien Antikörper als capture-Element zugeschrieben. Wie bei anderen Immun, sind wir auf die Erfassung von Zielen, die erhältliche Antikörper, die Spezifität der verwendeten Antikörper und ihre Stabilität haben 36 begrenzt. Der Typ von Antikörpern verwendet werden, hängt von der spezifischen Anwendung und, wann immer möglich monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Trotz der hohen Präzision, die monoklonale Antikörper liefern, ist die Erkennung von ganzen Zellen, Bakterien unter 1.000 Zellen / ml immer noch eine Herausforderung35. Zusätzlich sollten die hohen Kosten bei der Herstellung dieser Antikörper beteiligt berücksichtigt werden.

Eine weitere Einschränkung ist die chemische Stabilität der oxidierten PSi Wandler in korrosiven / wässrigen Umgebungen assoziiert. Obwohl die PSIO 2 Stabilität ist im Vergleich zu PSi dünnen Filmen überlegen, noch bei der Durchführung lange (mehrere Stunden) Strömungsexperimente Grundlinie driftet beobachtet 14,15,21,24 werden. Darüber hinaus ist es bevorzugt um neutrale pH-Wert (im Bereich von 6-8), um die mechanische Instabilität der Nanostruktur zu verhindern, zu arbeiten.

Natürlich, dass beim Umgang mit realen Lebens-oder Wasserproben, die mit Bakterien verunreinigt sind, muss eine geeignete Vorbehandlungsverfahren, die vor der Erfassungsschritt berücksichtigt werden. Die Vorbehandlung sollte im Einklang mit den spezifischen Eigenschaften der untersuchten Probe ausgelegt werden. Beispielsweise Herstellungsverfahren, wie Dispersion, Filtration, pH baLanze, etc. in Betracht gezogen werden. Jedoch sind diese Vorbehandlungsmethoden über den Rahmen dieser Arbeit.

Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden

Bisher Nachweis und die Identifizierung von bakteriellen Verunreinigungen beruhen hauptsächlich auf der klassischen Mikrobiologie Kulturtechniken oder Techniken, die in schnellen Mikrobiologie, wie biochemische Kits, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), und die PCR (Polymerasekettenreaktion)-Assays 2,3. Diese Verfahren sind mühsam, zeitaufwendig und erfordert mehrere Tage, um Ergebnisse zu erhalten, wodurch Echtzeit'''' Beurteilung der Wasser-und Nahrungsmittelsicherheit bleibt undurchführbar 2,4,5. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Fähigkeit des PSi-Biosensoren, die Nachteile dieser Techniken zu überwinden. Die vorliegende Biosensor ermöglicht eine einfache und relativ empfindlichen Nachweis von Bakterien über eine direkte Zell-Capture'''' Ansatz, durch Überwachung von Veränderungen in seiner opoptischen Interferenzspektrum. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen eine niedrige Nachweisgrenze von 10 4 Zellen / ml E. coli und eine schnelle Reaktionszeit von mehreren Minuten. Zum Vergleich ist die Nachweisgrenze des derzeitigen Stand der Technik die Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Biosensoren im Bereich von 10 2 bis 10 6 Zellen / ml 37-40. In Bezug auf die Reaktionszeit, ist unsere Antwort auf Biosensoren Bakterien Exposition vergleichbar mit der SPR-Techniken. So sind die großen Stärken dieses Biosensor-System sind die Einfachheit des Tests und ermöglicht schnelle Erkennung für "Echtzeit"-Identifizierung der Zielbakterien.

Zukünftige Anwendungen

Verschiedene Ansätze werden gegenwärtig untersucht, um die Nachweisgrenze und Sensitivität des Biosensors, einschließlich der Optimierung der Antikörperkonzentration und der Orientierung zu verbessern, verwenden Antikörperfragmenten anstelle von ganzen Antikörpern. Darüber hinaus untersuchen wir das Potenzial von aptamers als alternative Fangsonden. Zusammenfassend stellt die vorliegende Arbeit eine generische Biosensor-Plattform, die für viele Anwendungen der Biosensor eine Vielzahl von Mikroorganismen, übersetzt werden können.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Um eine optimale Leistung des Biosensors zu erreichen, ist es sehr wichtig, die Biofunktionalisierung der PSIO 2 Gerüste (siehe Abschnitt 3 in der Protokoll-Text, Fluoreszenzmarkierung und Fluoreszenzmikroskopie) bestätigen. Die Fluoreszenzstudien können wir die Bindung der Antikörper an den Wandler (PSIO 2) Oberfläche zu bestätigen und zu charakterisieren, die Aktivität und Antigen-Spezifität der Antikörper gebunden, durch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Anti-Kaninchen-IgG und anti-Maus-IgG als Kontrolle .

Darüber hinaus, um zu falschen Ergebnissen in der optischen Anzeige zu beseitigen, ist es wichtig, die Oberfläche des Biosensors folgenden exposu richtig spülenre auf die Zielbakterien (zur Entfernung von Bakterien-Zellen, die spezifisch gebundene oder befinden sich auf der Oberfläche) und die Kontrollexperimente mit ordentlich PSIO 2 durchzuführen. Die Bedeutung der Kontrollversuch ist für die Eliminierung von Bakterien unspezifische Adsorption an der Biosensoroberfläche (siehe Abschnitt 5 im Protokolltext, Bakterien Sensing).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Grant No 1118-1108 und Zuschuss Nr. 1146/12) und der Minna Kroll Memorial Research Fund unterstützt. ES dankt der finanziellen Unterstützung des Russell Berrie Nanotechnology Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5, (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59, (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32, (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204, (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18, (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84, (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120, (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127, (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79, (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12, (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8, (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6, (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27, (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22, (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83, (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20, (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20, (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79, (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13, (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8, (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85, (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23, (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. Springer. 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. Springer. 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40, (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4, (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24, (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Springer. 83 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics