Coculture System med en Organotypiska Brain Slice och 3D Sfär av cancerceller

* These authors contributed equally
Medicine
 

Summary

Den organotypisk hjärnan skiva coculture med cancerceller möjliggör visualisering av morfologiska förändringar av fluorescens och ljusa fält (video) mikroskopi under processen för cancer cell invasion av hjärnvävnad. Detta modellsystem möjliggör också för cell utbytes-och påfyllnings tillvägagångssätt och erbjuder ett brett utbud av manipulationer och analyser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chuang, H. N., Lohaus, R., Hanisch, U. K., Binder, C., Dehghani, F., Pukrop, T. Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (80), e50881, doi:10.3791/50881 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Patienter med cerebral metastasering av cancer har en dålig prognos. Dock har processen vid metastaserande plats knappt undersökts, i synnerhet den roll som är bosatta (stromaceller) celler. Studier i primära karcinom demonstrera påverkan av mikromiljön på metastaser, även om prognosen 1,2. Speciellt tumörassocierade makrofager (TAM) stöd migration, invasion och spridning 3. Interestingly de stora målställen av metastas besitter vävnadsspecifika makrofager, såsom Kupffer-celler i levern eller mikroglia i CNS. Dessutom, de metastaser har även andra vävnadsspecifika celler, såsom astrocyter. Nyligen var astrocyter visat att främja spridning och ihållande cancerceller 4,5. Därför funktioner av dessa vävnadsspecifika celltyper verkar vara mycket viktigt i arbetet med metastaser i hjärnan 6,7.

Trots dessa observationer,Men fram till nu finns det ingen lämplig in vivo / in-modell vitro tillgängliga för direkt visualisera gliaceller reaktioner under cerebral metastasering bildning, särskilt genom ljusfältsmikroskopi. Nyligen in vivo levande avbildning av cancerceller visat sin cerebral kolonisering beteende 8. Emellertid är denna metod mycket arbetskrävande, dyrt och tekniskt komplicerad. Dessutom är dessa typer av djurförsök begränsas till små serier och komma med en betydande stress för djuren (efter implantation av glasskivan, injektion av tumörceller, repetitiv anestesi och långsiktig fixering). Vidare är in vivo imaging hittills begränsad till visualisering av karcinomceller, medan interaktioner med inhemska celler ännu inte har illustrerats. Slutligen undersökningar av humana cancerceller i immunkompetenta djur är omöjliga 8.

Av dessa skäl har vi etablerat ett coculture systemet consisting av en organotypisk mushjärnan skiva och epitelceller inbäddade i matrigel (3D cell sfär). 3D cell sfärerna carcinoma placerades direkt intill hjärnan slice kanten för att undersöka invasionen av grannhjärnvävnaden. Detta gör att vi kan visualisera morfologiska förändringar och interaktion mellan gliaceller och cancerceller genom fluorescens och även med ljusa fält mikroskopi. Efter coculture experimentet, kan hjärnvävnaden eller 3D cell spheroids samlas in och användas för ytterligare molekylära analyser (t.ex. QRT-PCR, IHC, eller immunoblot) samt för undersökningar av konfokalmikroskopi. Denna metod kan tillämpas för att övervaka händelser inom en levande hjärnvävnad flera dagar utan skadliga effekter på hjärnan skivor. Modellen gör det också selektiv hämning och byte av hemvist celler från celler från en givare vävnad för att bestämma den distinkta effekten av en given genotyp. Slutligen är det coculture modellen ett praktiskt alternativtill in vivo närmar sig när man testar riktade farmakologiska manipulationer.

Protocol

Denna nya modell är en anpassning av en tidigare publicerad organotypisk hippocampus hjärnan skiva förhållningssätt 9-12. Modifikationer och tillägg infördes för att optimera de cancercell-hjärnvävnadsinteraktioner och för att garantera reproducerbarheten. Studien har granskats och godkänts av den lokala etiska kommittén. Djuren behandlas noggrant i enlighet med riktlinjerna för djuromsorg vid University Medicine Göttingen. The organotypic hjärnan skiva samodling kan uppdelas i två steg. Steg ett är att förbereda den organotypisk hjärnan skiva. Steg två omfattar tumörcellberedningen och nedfall i coculture modellen.

1. Organotypiska Brain Slice

  1. Förbered dissektion medium bestående av minimalt essentiellt medium (MEM), kompletterat med 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin och 4,5 mg / ml glukos.
  2. Halshugga mössen från varje musstam mellan postnatal dagsex och åtta (P6-8).
  3. Ta bort hjärnan snabbt från skallen under aseptiska förhållanden och överföra den till iskallt dissektion medium.
  4. Ta bort den främre stolpen och lillhjärnan från hela hjärnan avsnittet.
  5. Fix och stabilisera hjärnan på en scen med kryo lim och 5% agaros.
  6. Skiva hjärnan sektioner horisontellt till en 350 ìm tjocklek med hjälp av en vibratome.
  7. Samla 4-6 hela hjärnan skivor från en enda mus hjärna, beroende på art och ålder.
  8. Förbered odlingsmedium bestående av 50% MEM, 25% Hanks balanserade saltlösning (HBSS), 25% normalt hästserum (NHS), 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin (Sigma, Munchen, Tyskland), och 4,5 mg / ml glukos.
  9. Lägg varje organotypic hjärna skiva på en 0,4 ^ m polykarbonattranswell membraninsatsen i en sex-brunnar med 1 ml odlingsmedium i den lägre brunnen.
  10. Kultur organotypic hjärnsnitt över natten i en humidified atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C inkubator.

2. Den Slice Coculture Modell

  1. Använd 10 5 av GFP-transfekterade tumören eller andra celler (t ex MCF-7-GFP-celler) i 20 | il gel matris, bestående av 15% RPMI-medium och 85% ECM gel.
  2. Placera MCF-7-gelmatris blandning i en steril metalliska distansorgan (3,8 mm diameter) i direkt anslutning till det kortikala regionen av organotypic hjärnan skiva och inkubera i 2 timmar.
  3. Ta bort distans och låta 3D tumören sfäroid att coculture med organotypic slice för 24-96 timmar.
  4. Ändra odlingsmediet varannan dag.

3. Immunofluorescensfärgning av astrocyter och Microglial i Organotypiska Brain Slice Coculture

  1. Fäst organotypic hjärnan skiva samodling med 4% paraformaldehyd under 8 h vid 4 ° C.
  2. Tvätta skiva samodling med PBST (PBS med 0,5% Triton X-100) under 5 min.
  3. Blockera sempel med normalt getserum i PBST (1:20) vid rumstemperatur i en timme.
  4. Färga astrocyter genom att inkubera hjärnan skiva samodling med anti-gliafibrillärt surt protein monoklonal antikropp (GFAP, 1:200 i PBST) under 36 h vid 4 ° C följt av get-anti-mus-TRITC (1:100 i PBST) färgning under 1 h vid rumstemperatur.
  5. Tvätta proven med PBST tre gånger under 5 min.
  6. Färga mikrogliaceller med ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 i PBST) under 1 timme vid rumstemperatur.
  7. Motfärg hjärnan skiva samodling med DAPI (1:1000) under 3 min vid rumstemperatur.
  8. Montera och täckglas hjärnan slice coculture med DAKO fluorescerande monteringsmedel.
  9. Utvärdera betyget för tumörinvasion baseras på följande poängsystem: 0 = ingen av cellerna, + <1/3, + + = 1/3 - 2/3, + + + ≥ 2/3 av de invaderade cellerna (första mäta längden på kontaktsektionen mellan tumörpluggen och slice, mät därefter fraktionen kontakt upptäckas av de invaderande cellerna).

4. Live avbildning av interaktionen mellan Gliaceller och tumörceller

  1. Utför experimentet under ett Leica inverterat DMI 6000B mikroskop vid 10x förstoring lins och en Leica DFC 350 FX CCD-kamera.

Representative Results

Först, alla använda cancerceller (human: MCF-7 och mus: 410,4) invaderade organotypisk musen hjärnan skiva. Invasionen var därför art-oberoende (Figur 1 A), vilket tyder på ett brett spektrum av tillämpningar inom en art-oberoende sätt. Dessutom mikroglia liksom astrocyter ackumulerats vid gränsytan, såsom beskrivits tidigare in vivo och i patientprover 13. Time-lapse avbildning under en längre tid inte bara avslöjat livskraft skiva utan också erbjudit en bra plattform för att observera cellulära interaktioner. Genom tidsförlopp experiment mikrogliaceller inspelade att komma in i 3D-cell sfären samtidigt, i sin tur, cancerceller invaderade också hjärnan slice (figur 1B1-B2). Dessutom har vi tidigare visat förmågan hos mikroglia att transportera karcinomceller av en fortfarande gåtfulla mekanism för att därigenom hjälpa till i carcinoma invasion. Med hjälp av immunofluorescens märkningsteknik, vibeskrivs co-lokaliseringar av tumörceller och stromaceller (t.ex. mikroglia och astrocyter), både i hjärnvävnaden och i tumörcellen pluggen (figur 1C-D), vilket tyder på en tät samverkan mellan dessa celler under invasionen processen. Jämförbara resultat erhölls när musen hjärnan skivor samodlades antingen med mänskliga (figur 1C1-C3) eller mus (Siffror 1D1-D3) cancerceller - som visar brett utbud av applikationer för att studera celler från olika arter, genotyper och stammar.

Figur 1
Figur 1. Brain skiva coculture modell med en 3D sfäroid av mus och humana cancerceller. A) Kvantifiering av cancercellinvasion i organotypic hela hjärnan skiva samodlingar med en mus bröstcancercellinje 410,4 eller en human bröstcancercellinje MCF-7. Data representerar den procentuella graden av cellinvasion in i hjärnan skiva i varje grupp med n ≥ 38. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de två grupperna (Kruskal-Wallis test). B) Time-lapse bilder av organotypic hela hjärnan slice samodlingar med MCF-7-GFP celler och representativa bilder från day2 (B1) och dag 5 (B2) var visas. CD) konfokalmikroskopi bilder visade kohorter av karcinom, astrocyter och mikroglia. Dubbel färgning av astrocyter (anti-GFAP-TRITC, röd) och mikroglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violett) av hela coculture med 350 um tjock organotypisk hjärnan skiva och GFP-transfekterade tumörcellplugg (grön): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) och 3D-410.4-GFP (D1-D3). Vita fläckar visade kanten av hjärnan skiva och tumörinvasion front. Skalstrecken representerar 50 um. Mikroglia, astrocyter ennd tumörer colocalizations (C1 och D1), astrocyter-tumörer colocalizations (C2 och D2) och mikroglia-tumör colocalizations (C3 och D3) i segmentet coculture. Klicka här för att visa en större bild

Discussion

Tidigare histologiska undersökningar av cerebrala metastaser visade snabba och drastiska förändringar av de inhemska gliaceller, i synnerhet av astrocyter och mikroglia 13. För att studera dessa förändringar och interaktion med de cancerceller, är denna roman coculture systemet väl lämpad. Andra forskningsområden som redan har lång erfarenhet med organotypic hippocampus hjärnan skivor. En fördel är att de organotypic hippocampus hjärnan skiva kulturer är lönsamt och effektivt bevaras för dagar till veckor, vilket gör den lämplig för långtidsförsök. Eftersom Stoppini s införande av organotypisk hippocampus slice systemet 1991 har det i stor utsträckning använts, till exempel i forskning av degenerativa sjukdomar. Således representerar här originella coculture systemet en modifiering av en väletablerad metod med en rad tillämpningar inom tumörbiologi 9,11. Modifieringen erbjöd oss ​​en reproducerbar modell för att utvärdera graden av tumörinvasion afterwards och kulturer odlas av gränssnittsmetoden är idealisk för experiment som kräver en tre-dimensionell struktur. Flera tekniker har använts för att samodling organotypic hippocampus skivor med andra celler. Dessa inkluderar ett indirekt system mellan makrofagceller och organotypic hjärnan skiva 14, och en direkt samodling av två olika skivorna från hippocampala regionen 15. Gliom aggregat har också samodlades med hjärnan skivor 16. Dessa modeller kan användas för att analysera cellulära och molekylära händelser i hjärnan skivor, men tillåter inte direkt, fysiologisk kontakt mellan tumörceller, mikroglia och hjärnparenkymet. Dessutom tillåter denna metod observation av mikroglia utan förorening av härledd från benmärg perifera monocyter / makrofager. Användningen av CCR2 och CX3CR1 transgen musmodell är en kritisk förbättring till följd av det faktum att det är svårt att skilja det residenta mikroglia från invaderande monocyterbaserat på deras liknande egenskaper 17,18,19. Även intracerebral injektion av cancerceller låter undersöka tumörprogression, det kan inte berätta mycket om huruvida de omgivna makrofagliknande celler härstammar från hjärnan hemmahörande mikroglia befolkningen eller från härledd från benmärg perifera monocyter / makrofager 17. Teamet av Kettenmann införde en organotypisk hjärnan skiva modell som involverade ympa gliomceller i hjärnan skivor med en mikromanipulator 20. Men primära maligna gliom skiljer sig i många avseenden från metastaserande cancer. Först, maligna gliom är av mesenkymala ursprung, inte metastaser utanför nervsystemet, och migrera / invadera som enskilda celler med ingen gräns mellan tumör-och hjärnvävnad. Däremot är infiltrativ tillväxt en typisk patologisk kännetecken, och sådana karcinom brukar migrera / invadera som kohorter. För det andra, karcinom försöker ofta att återuppbygga epiteliala strukturer i hjärnan, medan gliacellerförsöka skilja tumören från hjärnvävnad genom en (pseudo) kapsel. Med tanke på biologiska och morfologiska egenskaper, malignt gliom och metastasering av cancer är inte riktigt jämförbara. Av dessa skäl har vi modifierat och utvecklat ett coculture system där vi inte injicera men coculture en karcinomcellinje plugg i anslutning till hjärnan slice. Dessutom observerade vi microglial och astrocytisk ackumulering vid gränsen av tumören kontakten, vilket innebär att mikroglia in i tumören kontakten och kunde lätt upptäckas genom ljusfältsmikroskopi och bekräftats i efterhand av konfokalmikroskopi. De cancerceller invaderar in i hjärnan skiva, vilket är jämförbart med den verkliga in vivo situationen och en observation som Baumert och kollegor, som fann en infiltrations zon i 63% av obduktionsfall med hjärnmetastaser 21.

På grund av den saknade blodperfusion, det finns bara residenta makrofager / mikroglia i denna kultur. Dessutom, på grund av de mIssing T-celler och därför frånvarande allo-reaktivitet, humana cancerceller kan användas för samodling även med hjärnan skivor av immunkompetenta möss eller råttor (NMRI, B6, eller Wistar). Detta skulle kunna tjäna som ett alternativ till den naken musmodell. Sedan 4-5 skivor kan erhållas från varje mus, är betydligt minskat antal djur som krävs, i jämförelse med befintliga injektion modellerna. Dessutom har djuren inte lider under en lång period av metastaserad sjukdom och att de inte genomgår operativa ingrepp upprepade 22.

Med denna samodling systemet har vi visat att aktivering av mikroglia av cancerceller och förmågan att främja cancercellinvasion. Dessutom är detta den första gången, så vitt vi vet, har mikroglia fann att aktivt transportera cancerceller 23.

Trots alla dessa fördelar har de samodling systemet faktiskt också begränsningar. Det är fortfarande en in vitromodell saknade stegen metastaser före kolonisationen. På grund av den bristande genomblödning, är det inte möjligt att studera extravasering. Sålunda kan alternativt sätt att studera extravasering är att använda antingen in vivo injektion modell eller den modifierade Boyden-kammarsystem med extracellulär matris, HUVEC och astrocyter för att efterlikna den blod-hjärnbarriären 22,24. Hjärnan slice coculture metod är ännu en tillförlitlig och reproducerbar modell med många fördelar och en potential för en mängd olika tillämpningar, till exempel analys av kolonisering, särskilt med fokus på den roll som de inhemska cellerna. I kombination med andra etablerade tekniker (såsom immunohistokemi, konfokalmikroskopi och time-lapse mikroskopi) stöder utredningen av direkta cell-till-cell interaktioner. Det är ett enkelt alternativ och komplettering av andra tekniker och erbjuder tillgång till utredningen av de ledtrådar och effekter som följer av metastaserande mikromiljö.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgements

Författarna tackar Chalid Ghadban för hans utmärkta tekniskt bistånd, Andreas Wodarz och Stephan Heermann för deras tekniska råd om konfokala och time-lapse mikroskopi. Det finns ingen intressekonflikt för någon av författarna. Detta arbete finansieras av tyska forskningsrådet (DFG) i Projekt 2 av Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), av Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Tyskland) och genom forskningsprogrammet Medicinska fakulteten, Georg-August-universitetet Göttingen, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Darmstadt,Germany 24020
Minimum essential medium (MEM) Gibco, Darmstadt , Germany 32360
RPMI-1640 PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany E15-840
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Pan Biotech, Aidenbach, Germany P04-36500
Normal horse serum (NHS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 16050-122
Fetal calf serum (FCS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 10091148
Glucose B. Braum, Melsungen, Germany
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution Sigma, Steinheim, Germany G1146
Vibratome Leica, Wetzlar, Germany Leica VT1200S
Microtome Leica, Wetzlar, Germany Leica SM 2000R
Polycarbonate membrane BD Falcon, Heidelberg,Germany 353090 transwell membrane insert (0.4 μm pore size)
ECM gel Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany 3432-005-01 Basement membrane extract
Metallic spacer Kig GmbG, Kirkel, Germany DIN 433
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany LSM 510
Time-lapse microscope and camera Leica, Wetzlar, Germany DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera
Anatomy microscope Zeiss, Göttingen, Germany Stemi SV11
Paraformaldehyde Merck, Darmstadt, Germany 1.04005.1000
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody Sigma, Steinheim, Germany G3893
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2- TRITC Santa Cruz, Heidelberg, Germany SC3796
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen, Karlsruhe, Germany 132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) Sigma, Steinheim, Germany D8417
Fluorescent mounting medium DAKO, Glostrup, Denmark S3023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langley, R. R., Fidler, I. J. The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs. Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454, 436-444 (2008).
  4. Fidler, I. J. The role of the organ microenvironment in brain metastasis. Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).
  5. Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells. PloS one. 8, e54752 (2013).
  6. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12, 895-904 (2006).
  7. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).
  8. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
  9. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  10. Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures. Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).
  11. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  12. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).
  13. Lorger, M., Felding-Habermann, B. Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis. Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).
  14. Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage. J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).
  15. Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices. Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).
  16. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).
  17. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. (2011).
  18. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J. Immunol. 188, 29-36 (2012).
  19. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).
  20. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).
  21. Baumert, B. G., et al. A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).
  22. Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. The biology of metastasis to a sanctuary site. Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).
  23. Pukrop, T., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58, 1477-1489 (2010).
  24. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics