ثنائي الفوتون التصوير الكالسيوم في الفئران التنقل إلى هذا الشخص واقع البيئة

* These authors contributed equally
Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نحن هنا وصف الإجراءات التجريبية المشاركة في التصوير ثنائي الفوتون من الماوس القشرة خلال السلوك في بيئة الواقع الافتراضي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في السنوات الأخيرة، أصبح التصوير ثنائي الفوتون أداة لا تقدر بثمن في علم الأعصاب، كما أنه يسمح لقياس مزمن في نشاط الخلايا التي تم تحديدها وراثيا خلال السلوك 1-6. نحن هنا وصف الطرق لأداء اثنين من الفوتون التصوير في الماوس القشرة بينما يتنقل الحيوان بيئة الواقع الافتراضي. ونحن نركز على جوانب الإجراءات التجريبية التي هي مفتاح التصوير في حيوان يتصرف في بيئة افتراضية المضاءة. المشاكل الرئيسية التي تنشأ في هذا الإعداد التجريبية أننا هنا عنوان هي: التقليل من الحركة المتعلقة التحف الدماغ، والتقليل من تسرب الضوء من نظام الإسقاط الواقع الافتراضي، والتقليل من الليزر التي يسببها تلف الأنسجة. كما نقوم بتوفير البرمجيات عينة للسيطرة على البيئة والواقع الافتراضي للقيام تتبع التلميذ. مع هذه الإجراءات والموارد يجب أن يكون من الممكن تحويل التقليدية المجهر ثنائي الفوتون لاستخدامها في التصرف الفئران.

Introduction

برز التصوير ثنائي الفوتون من مؤشرات الكالسيوم (المشفرة وراثيا مثل GCaMP5 7 أو R-8 جيكو، أو الأصباغ الاصطناعية مثل OGB أو Fluo4) كوسيلة من وسائل قوية لقياس نشاط الخلايا العصبية في الفئران يتصرف 1-6. فإنه يمكن قياس وقت واحد لنشاط مئات الخلايا في عمل واحد بالقرب من القرار المحتملة، وتصل إلى ما يقرب من 800 ميكرومتر تحت سطح الدماغ 9،10. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIS) نشاط الخلايا العصبية ويمكن قياس مزمنة 5،11،12، وأنواع الخلايا المحددة وراثيا 13. معا، وهذه الأساليب توفير درجة من الدقة الزمنية والمكانية التي تفتح العديد من الإمكانيات الجديدة في دراسة حساب الخلايا العصبية في الجسم الحي.

التدخل الجراحي ضروري لفضح وتسمية مخ الفأر للتصوير. عادة و transfected الخلايا باستخدام المؤتلف الغدة المرتبطة فير هو مزروع لنا (AAV) نظام للتسليم جيتشي ونافذة في الجمجمة خلال موقع الحقن للوصول البصرية إلى الدماغ. ثم يتم إرفاق شريط الرأس في الجمجمة لتثبيت الرأس تحت المجهر ثنائي الفوتون. تصميم وتنفيذ هذه الخطوات أمر بالغ الأهمية لأن معظم المشاكل مع التصوير مستيقظا تنشأ من عدم الاستقرار في التحضير. مثالي الإجراء الموضح هنا يجب أن تسمح للتصوير المزمن تصل إلى عدة أشهر بعد الجراحة.

لتمكين السلوك الموجهة بصريا أثناء التصوير ثنائي الفوتون، رئيس الماوس ثابتة يجلس على حلقة مفرغة الهواء يؤيد كروية، والتي يمكن استخدامها للتنقل بيئة الواقع الافتراضي. ويقترن تحرك الماوس في حلقة مفرغة للحركة في البيئة الظاهرية التي يتم عرضها على شاشة حلقية المحيطة 14،15 الماوس. المتغيرات السلوكية مثل الحركة والتحفيز البصري، وموقف التلميذ يمكن تسجيل 6.

ر "> ونحن تصف الإجراءات اللازمة في التصوير المزمنة ثنائي الفوتون في الفئران استكشاف بيئة الواقع الافتراضي النقاط الرئيسية التي تناولها هي: الحد من حركة القطع الأثرية، والحد من تسرب الضوء، تعظيم عدد الخلايا سجلت في وقت واحد، والتقليل من الضرر الصورة، ونحن أيضا تقديم تفاصيل حول إعداد حلقة مفرغة المدعومة من الهواء، وتتبع التلميذ، والبيئة الواقع الافتراضي. الإجراءات الموضحة هنا يمكن أن تستخدم لتصوير السكان الخلية fluorescently المسمى في الرأس الفئران ثابتة في مجموعة متنوعة واسعة من النماذج يحتمل السلوكية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية ونفذت وفقا للمبادئ التوجيهية للإدارة البيطرية في كانتون بازل شتات.

1. الأجهزة والبرمجيات الإعداد

  1. ثنائي الفوتون مجهر المسح الإعداد:
    1. استخدام الليزر تحت الحمراء نابض كمصدر للإضاءة (عرض النبضة <120 FSEC).
    2. استخدام مسح الرأس تتألف من الماسح الضوئي الرنانة 8 أو 12 كيلوهرتز ومعيار الجلفانومتر ملاحظة: هذا يتيح معدلات الإطار من 40 أو 60 هرتز عند 750 × 400 بكسل. وارتفاع معدل الإطار أمر بالغ الأهمية للتقليل من حركة الدماغ صورة التشويه المتعمد. علاوة على ذلك، نتائج المسح الرنانة سريع في إشارة العائد العالي ويقلل photobleaching من 16 والضيائية.
    3. استخدام السرعة العالية ض السائر بيزو الكهربائية لبالتسلسل الوقت الحصول على صور معشق في أعماق متعددة ملاحظة: هذا هو اختياري وتستخدم لزيادة العائد البيانات على حساب معدل الإطار.
    4. استخدام صباحافتورا ​​echanical للحد من التعرض الليزر إلى الأنسجة. ضبط عرض فتورا ​​اعتمادا على السعة من الماسح الضوئي الرنانة ملاحظة: نظرا لطبيعة الجيبية من مسار تفحص الماسح الضوئي الرنانة، شعاع الليزر يتحرك بطيئا نسبيا في نقطة تحول المسح الضوئي. لمنع تلف الأنسجة في هذه النقاط تحول حيث التعرض ليزر هو أعظم، يتم إدخال فتورا ​​الميكانيكية في المستوى البؤري بين المسح والعدسات التي توقف أنبوب شعاع الليزر.
    5. للحصول على البيانات استخدام التحويل الرقمي عالي السرعة (800 ميجا هرتز) في تركيبة مع بوابة مجموعة الميدان للبرمجة (FPGA) ملاحظة: إن تمريرة عالية FPGA الفلاتر وصناديق إشارة PMT إلى بكسل. الجمع بين مرشح تمريرة عالية على FPGA وفعالة مرشح تمرير منخفض على نتيجة مكبر للصوت PMT في مرشح تمرير النطاق تركزت تقريبا حول معدل تكرار الليزر (80 ميغاهيرتز). يتم توفير نموذج التعليمات البرمجية FPGA على شكل ملحق.
  2. بدعم الهواء الإعداد مفرغة على أساس تصميم Dombeck والزملاء 2
    1. ربط حامل الكرة إلى خط إمداد الهواء باستخدام أنبوب العرض الجوي لا يقل عن 10 مم القطر الداخلي. تحقيق أقصى قدر من المقطع العرضي للحامل الكرة العرض الجوي مدخل ووضع كمية وافرة من أنابيب بين العرض الجوي الرئيسي وحامل الكرة ملاحظة: زيادة المقطع العرضي وزيادة طول أنابيب إمداد الهواء يقلل من الجيل الضوضاء.
    2. وضع الكرة رغوة البوليسترين (20 سم القطر) في حامل الكرة والمطبوعة 3D-مصمم خصيصا.
    3. إذا كان النموذج السلوكي يتطلب فقط إلى الأمام (أو الخلف) تنقل، وتقييد حركة الكرة إلى الأفقي (الملعب) محور طريق إدخال دبوس (مثل G 19 إبرة تحت الجلد) على جانب الكرة ملاحظة: عادة الحيوانات على التكيف مع الإعداد أسرع بكثير في هذا النموذج انخفاض التناوب.
    4. حركة المسار من الكرة باستخدام واحد أو اثنين من فئران الكمبيوتر الضوئيةلكشف الحركة حول اثنين أو ثلاثة جميع المحاور على التوالي ملاحظة: يجب على فئران الكمبيوتر تعمل بشكل مثالي مع الصمام الثنائي الأشعة تحت الحمراء لأقل تدخلا في التصوير.
  3. إعداد بيئة الواقع الافتراضي
    1. إعداد بيئة الواقع الافتراضي ملاحظة: إن وجود بيئة عينة بناء على Panda3D، محرك اللعبة متاحة مجانا، وتقدم على شكل ملحق. يتم إنشاء الكائنات من بيئة افتراضية باستخدام Wings3D، وهو مصمم نماذج 3D مفتوحة المصدر. نموذج البرنامج يقرأ معلومات الموقع على بطاقة الحصول على البيانات ويترجم هذا في الحركة في بيئة افتراضية. ينفذ التعليمات البرمجية أيضا التحول غير الخطية اللازمة للبيئة إلى أن إسقاطها على الشاشة حلقية. وقد وصفت بناء مفصلة من الشاشة حلقية أماكن أخرى 14،17.
    2. استخدام أجهزة العرض الصمام أو شاشات الكمبيوتر الخلفية LED لعرض بيئة افتراضية. دمج سي آي آر النابضةCUIT عن الخفقان السريع للالمصابيح أثناء التصوير ملاحظة: هناك مشكلة متأصلة في التصوير ثنائي الفوتون خلال التحفيز البصري هو تسرب الضوء القادمة من نظام التحفيز البصري، الذي يمكن الحد من التدريع الهدف. ومع ذلك، تسرب الضوء من نظام التحفيز البصري يمكن أن تلغى بالكامل من خلال مزامنة الناتج ضوء العرض إلى نقطة تحول من الماسح الضوئي الرنانة (عندما لا يتم الحصول على البيانات)، كما هو الحال مع الساحات LED المستخدمة في التحفيز البصري أثناء التصوير في ذبابة الفاكهة 18. هذا يؤدي إلى اختلاف سرعة عالية فعالة من التحفيز البصري والحصول على البيانات (انظر الشكل 2). تردد الخفقان (24 كيلو هرتز) هو أوامر من حجم فوق عتبة ميض الانصهار، أعلاه والتي لم يعد ينظر الخفقان من قبل الحيوان. يظهر الرسم البياني الدوائر الإلكترونية من هذا التعديل لLED ضوئي تجاري في الشكل 3.
  4. جروتتبع ايل
    1. استخدام كاميرا الفيديو CMOS مقرها (30 إطارا في الثانية) لتتبع موقف التلميذ. تأكد من أن الكاميرا لا تحتوي على فلتر حجب الأشعة تحت الحمراء ملاحظة: إن التلميذ مرئيا في التباين العالي خلال التسجيلات بسبب الضوء الشارد من اثنين من الفوتون الإثارة الليزر الخروج من خلال العين. موقف التلميذ ويستخرج قطر في الوقت الحقيقي باستخدام برمجيات مخصصة مبرمجة على أساس تصميم Sakatani وعيسى 19.

2. حقن الكالسيوم المؤشر الوراثية ونافذة زرع

يتم إجراء حقن مؤشر الكالسيوم 20 وغرس النافذة في الجمجمة 21 كما هو موضح سابقا مع الإضافات التالية:

  1. حقن الفيروس في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام ماصة حقن الزجاج ردم حل مع الفيروس وتوصيلها إلى نظام حقن الضغط. ضبط الضغط اعتمادا على ماصة الداخلية،قطر، وعادة تقريبا. 70-140 م بار، لحقن حوالي 100 NL من الحل الفيروس على مدى 1-2 دقيقة. البقول الحقن انخفاض حجم ألقاها في التردد المنخفض (0.05 البقول ثانية في 2 هرتز) وينبغي أن تستخدم من أجل منع امتداد الفيروس على طول ماصة خلال حقن ملاحظة: من أجل رصد حجم الحقن، يمكن أن تكون علامة على ماصة صغيرة ، أطوال متباعدة بشكل متساو (مثل 0.5 ملم) تحت المجهر ستيريو. ويمكن بعد ذلك النزوح من الغضروف المفصلي بين علامات أن تستخدم لتقدير حجم حقن.
  2. عدة أسابيع حقن آخر هذا ينبغي أن يؤدي إلى بلعة من الخلايا المسمى المكتظة التي يبلغ قطرها حوالي 500 ميكرون. فعالية جيتشي التعبير في المنطقة ذات الاهتمام يعتمد على اختيار جيتشي والجمع بين المروج، وكذلك عيار المعدية والنمط المصلي من AAV المؤتلف المستخدمة ملاحظة: وكمثال ممثل، حقن AAV2/1-EF1α-GCaMP5 مع حلمة الثدي الفيروسيةإيه 8 × 10 12 GC / مل في القشرة البصرية الأولية لنتائج الماوس في التعبير مرضية في مدة أسبوعين تقريبا بعد الحقن (الشكل 1).
  3. يجب أن شريط الرأس لا تعيق المجال البصري من الفأرة، ولكن يجب أن تكون جامدة بما يكفي للسماح للتصوير مستقرة خلال السلوك. هذا عادة ما يتطلب نقطتين من المرفقات على جانبي شريط الرأس (انظر الشكل 1). لنعلق بحزم شريط الرأس في الجمجمة، للتأكد من تحقيق أقصى قدر من وتجفيف منطقة الجمجمة يتعرض حيث سيتم إرفاق شريط الرأس. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام مشرط أو حقنة، خدش الجمجمة لإنشاء أخاديد سطحية وبالتالي زيادة المساحة السطحية للالإلتصاق. تغطية العظام بمادة لاصقة الأنسجة فورية الغراء قبل إرفاق شريط الرأس مع الاسمنت الأسنان.

3. الإجراءات التجريبية

  1. أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد الحقن الفيروسات، والتحقق من الجمجمة نافذة زرع للالوضوح والتعبير في إطار برنامج التحصين الموسعإضاءة مضان. حدود واضحة للعيان ومحددة بشكل حاد من الأوعية الدموية السطحية هي مؤشر جيد على أن الإطار زرع مناسبة للتصوير (انظر الشكل 1).
  2. قياس وضبط قوة الليزر إلى قيمة أقل من 50 ميغاواط في العينة.
  3. بدوره على تدفق الهواء إلى حلقة مفرغة كروية.
  4. لتثبيت الرأس تحت المجهر، تخدير لفترة وجيزة مع isoflurane والحيوان للحد من التوتر. وضع الحيوان في وعاء التخدير isoflurane ووالانتظار حتى يتوقف الحيوان يتحرك (حوالي 10 ثانية). إزالة الحيوان ورئيس إصلاحه على الفور تحت المجهر.
  5. وضع نظام العرض البصري في أقرب وقت ممكن للحيوان للا تزال تسمح للوصول إلى الحيوان. الاتصال البصري أقل الحيوان لديه مع المجرب، وأقل شدد سيكون الحيوان خلال المرحلة الأولى من التجربة.
  6. تأكد من أن الجمجمة نافذة زرع خالية من الغبار والأوساخ. نظيفة مع الماءإذا لزم الأمر.
  7. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية واضحة كما الغمر المتوسطة بين النافذة في الجمجمة والهدف الغمر بالمياه. هذا يحل مشاكل بطء تدهور صورة نظرا لتبخر المياه أو تسرب ويخفف من الحاجة لتركيب مخروط على شريط الرأس إلى تصمد ملاحظة: جهاز طرد مركزي الجل قبل الاستخدام لإزالة جميع فقاعات الهواء، والحرص على عدم خلق أي الهواء فقاعات خلال تطبيق هلام. يمكن فقاعات الهواء تتحلل بشدة جودة الصورة.
  8. التفاف قطعة من الشريط الأسود حول شريط الهدف ورئيس لالتدريع الضوء.
  9. تحريك الساحة بيئة افتراضية لموقفها النهائي وضبط كاميرا فيديو لتتبع التلميذ.
  10. تعيين فتورا ​​الليزر لتتناسب مع السعة المسح الضوئي المستخدمة أثناء التجربة.
  11. بدء تسجيل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جودة الصورة في اثنين من الفوتون التصوير الكالسيوم من السكان الخلية المسمى مع جيتشي يعتمد إلى حد كبير على نوعية الجمجمة نافذة الزرع. يجب فحص أسبوعين بعد حقن الفيروس النافذة في الجمجمة من أجل الوضوح. ينبغي أن يكون هناك أي النسيج الحبيبي أو إعادة نمو العظام مرئية (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، ينبغي أن نمط الأوعية الدموية السطحية دون تغيير وحدود الأوعية الدموية يجب أن يتم تعريف بشكل حاد. في نفس الوقت، ويمكن أيضا أن يتم التحقق جيتشي التعبير. يجب بولي من الخلايا المسمى تكون مرئية بوضوح تحت المجهر epifluorescence (الشكل 1B).

إعداد مثالي مستقر بحيث التشوهات من الصور اثنين من الفوتون الناجمة عن تحرك الماوس تكون غير مرئية في الصورة بعد تسجيل الإطار (الشكل 2) بما فيه الكفاية. المسار تفحص الماسح الضوئي الرنانة هو الجيبية مما أدى إلى تشويه صورة غير الخطية. خلال تولا يتم الحصول على نقاط البيانات rnaround بسبب الصورة تمتد في هذا الجزء من مسار المسح الضوئي. إذا كان مصدر ضوء نظام التحفيز البصري، من هنا من المصابيح ضوئي، هو الوقت المناسب بشكل صحيح إلى نقطة تحول، وينبغي أن يكون تسرب الضوء الوحيد الواضح خلال هذه الفترة (الشكل 2). تردد الخفقان من مصدر الضوء يجب أن يكون ضعف تردد المسح الضوئي. المفتاح لجعل هذا العمل هي ارتفاع سريع وسقوط مرة من المصابيح والسيطرة الالكترونيات (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. أعلى نظرا نافذة في الجمجمة في الرأس ثابت الماوس بعد أسبوعين الجراحة. (أ) تم تحسين شريط الرأس في الوزن والشكل لزيادة الاستقرار للسلوك خلال تجارب التصوير، في حين خفض العبء على الحيوان. Tانه يتوجه مصنوع من الألومنيوم وشريط لديه سمك 1 ملم. شريط المقياس هو 5 ملم. (B) Epifluorescence صورة GCaMP5 التعبير بعد أربع حقن (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) ما يقرب من 80 NL. عمق الحقن حوالي 400 ميكرون. شريط النطاق هو 1 مم. (C) الخطط من شريط الرأس. جميع القياسات في مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. تحسين الإشارة إلى الضوضاء عن طريق الحد من تسرب الضوء. يتم مزامنة مصدر ضوء LED ضوئي في البيئة الواقع الافتراضي لالماسح الضوئي الرنانة لتشغيل فقط خلال فترات التحول مسح عندما لا يتم تسجيل البيانات (بو البرتقالXES). تمت إزالة فتورا ​​الليزر من المجهر لهذا المثال لتوضيح تأثير تسرب الضوء الناتجة عن التحفيز البصري. لقد التقطت الصورة (متوسط ​​8 ثانية من البيانات) في الماوس القشرة البصرية transfected مع AAV2/1-EF1α-GCaMP5. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الشكل 3. مخطط الدائرة من الالكترونيات المستخدمة لتومض جهاز عرض LED التقليدية. هو الدافع وراء الدوائر المعزولة من قبل المدخلات TTL لمزامنة الخفقان السريع مع الماسحة الضوئية الرنانة. C1: مكثف 1NF؛ D1، D2: 1N4148 الثنائيات؛ INV1: العاكس HEF40106 (1 من 6 المستخدمة)؛ LED1 - LED من متعاطي المخدرات؛ R1: 47 Ω المقاوم؛ R2: 2.2 أوم المقاوم؛ R3: إعادةsistor 100 Ω؛ T1، T5، T6، T7: الترانزستورات IF9321؛ T2: الترانزستور BC846؛ T3: الترانزستور BC170؛ T4: الترانزستور BC856. لاحظ أن هذه الدائرة لابد من تكرار لجميع قنوات اللون الثلاثة (الأحمر والأخضر والأزرق) من العرض. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المفتاح لنجاح السلوكية التصوير ثنائي الفوتون هو استقرار إعداد بطريقتين:

  1. على مدى أيام آخر نافذة الزرع، يمكن أن الاستجابات الالتهابية في الأنسجة يؤدي إلى تعزيز تشكيل النسيج الحبيبي والغضاريف التي من شأنها أن تعرقل أو حتى منع التصوير.
  2. أثناء التجربة الدماغ يجب أن تكون مستقرة بما فيه الكفاية لمنع الحركة الفنية من إفساد نشاط يتعلق العصبية إشارة مضان.

للحفاظ على الاستجابة المناعية الالتهابية إلى أدنى حد ممكن وينبغي إجراء عملية جراحية في الجمجمة نافذة زرع خارج في أسرع وقت ممكن ومباشرة تلف في خلايا المخ ينبغي تجنبها بأي ثمن. من أهمية قصوى في ضمان أن الجمجمة نافذة زرع يبقى محكم لكامل مدة التجربة لمنع الالتهاب.

للحد من حركة الدماغ التحف التصوير ذات الصلة والحرص على عدم تلف أوإزالة الأم الجافية أثناء الجراحة. يمكن تصحيح المتبقية تحرك بفعل الحركة في الدماغ لأنه عندما يقتصر الاقتراح للطائرة موازية إلى الطائرة التصوير (س / ص الطائرة). الحد الأقصى المسموح الانحراف المعياري الحركة في س / ص هو ما يقرب من 5 ميكرون. للحركة على طول محور ض هذه القيمة هي ما يقرب من 1 ميكرومتر، على ان يكون مدى الحركة هو أصغر من الحد من قرار المجهر.

سرعة منخفضة من الماسح الضوئي الرنانة عند نقاط تحول مسار الفحص يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة التي يسببها الليزر. لمنع هذا، يمكن أن يكون قد تم حظره الليزر في إعادة الهيكلة باستخدام فتورا ​​في تلسكوب المسح الضوئي. إذا تم تعيين هذا فتورا ​​بشكل صحيح ويتم الاحتفاظ متوسط ​​قوة الليزر في إطار الهدف أقل من 50 ميغاواط، والتصوير هو ممكن لفترات طويلة من الوقت أكثر من عدة أيام دون أن تسبب أي ضرر ليزر مرئية. طريقة بديلة لتقطيع الميكانيكية من الليزر هو استخدام خلية Pockels سريع للحد من قوة الليزر في turnarouتفاحة. ولكن هذه الطريقة لها مساوئ التي Pockels الخلايا أعرض عادة التشوهات شعاع غير مرغوب فيها.

جعلت الاستعداد رئيس ثابتة للتنقل القوارض البيئات الافتراضية من الممكن مزمنة السكان الصورة من خلايا القشرة من الفئران في أداء مجموعة واسعة من المهام السلوكية 3،4،6،22. ومع ذلك، فإنه من المفيد أن نلاحظ أن الرأس تثبيت تقيد بطبيعتها السلوك وتنقل في حلقة مفرغة كروية هو في نواح كثيرة لا يعادل تنقل غير المقيد أو السلوك العادي.

في المستقبل، فإن قوة النهج التصوير الواقع الافتراضي وصفها هنا من المحتمل أن تكون مزيجا من التصوير الكالسيوم مع التحفيز optogenetic المستهدفة خلال السلوك. مع هذا كان من الممكن التلاعب بصريا الخلايا قبل المشبكي والصورة أهدافها بعد متشابك في حين رصد التغيرات السلوكية الناتجة. بالإضافة إلى ذلك، كمؤشرات الكالسيوم منتشر بحرية داخل سللتر، وسوف يكون من الممكن أيضا لقياس النشاط انتقائي في مقصورات التحت خلوية خلال السلوك. بسبب الحركة الناجمة عن الحركة في الدماغ، هذه التسجيلات تم محدودة بسبب صعوبة الحصول على التسجيلات مستقرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل معهد فريدريش ميشر للبحوث الطبية الحيوية، وجمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم حدود الإنسان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover slips (diameter = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12 kHz Resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for Piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16X, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03 pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31, (6), 903-912 (2001).
  2. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  3. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13, (11), 1433-1440 (2010).
  4. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484, (7395), 62-68 (2012).
  5. Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484, (7395), 473-478 (2012).
  6. Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74, (5), 809-815 (2012).
  7. Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  8. Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  9. Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14, (8), 1089-1893 (2011).
  10. Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9, (2), 201-208 (2012).
  11. Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5, (9), 805-811 (2008).
  12. Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15, (11), 1539-1546 (2012).
  13. Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32, (9), 3131-3141 (2012).
  14. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, (7266), 941-946 (2009).
  15. Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
  16. Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69, (9), 689-692 (2006).
  17. Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
  18. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
  19. Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
  20. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, (8), 1128-1144 (2009).
  21. Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16, (3), 325-331 (2013).

Comments

1 Comment

  1. Is there anything special about the specific brand of ultrasound gel? Just wondering if a brand like Ultrasonic would suffice? (e.g., https://www.amazon.com/SPECIAL-PACK-3-Aquasonic-8-5oz-Each/dp/B00H4GDK6Y)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2016 - 5:55 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics