गिरहदार और फली संयंत्र के विकास के लिए एकल संयंत्र, बाँझ लघु * These authors contributed equally

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Summary

मानक प्रयोगशाला प्लेटों से बना व्यक्ति, बाँझ लघु में नाइट्रोजन फिक्सिंग बैक्टीरिया Sinorhizobium meliloti साथ सहजीवन में Medicago truncatula पौधों के विकास में कोई समझौता बाँझपन बिना जड़ प्रणालियों और पिंड की लगातार परीक्षा परमिट. संयंत्र स्थापित करने के लिए 9 सप्ताह के लिए इन विकास कक्षों में रखा जा सकता है.

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Jones, K. M., Mendis, H. C., Queiroux, C. Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti . J. Vis. Exp. (80), e50916, doi:10.3791/50916 (2013).

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Abstract

Rhizobial बैक्टीरिया संगत मेजबान फली पौधों की जड़ों पर सहजीवी, नाइट्रोजन फिक्सिंग पिंड के रूप में. इन मुलाकातों के अध्ययन के लिए सबसे अच्छी तरह से विकसित मॉडल प्रणालियों में से एक है Medicago CV truncatula संयंत्र है. Jemalong A17 और rhizobial जीवाणु Sinorhizobium 1021 meliloti. पौधे की जड़ों और सहजीवी phenotypes की स्कोरिंग की दोहराया इमेजिंग पौधों या बैक्टीरिया या तो गैर विनाशकारी हैं कि तरीकों की आवश्यकता है. कुछ संयंत्र और बैक्टीरियल म्यूटेंट की सहजीवी phenotypes विकास की अपेक्षाकृत कम समय के बाद स्पष्ट हो गया है, और मेजबान / symbiont बातचीत की लंबी अवधि के अवलोकन की आवश्यकता नहीं है. वे रन बनाए जा सकते हैं हालांकि, इससे पहले गिरहदार प्रक्रिया के प्रारंभिक दौर में स्पष्ट नहीं हैं कि सहजीवी दक्षता और गुत्थी वार्धक्य phenotypes में सूक्ष्म अंतर अपेक्षाकृत लंबे समय तक विकास समय की आवश्यकता. कई तरीकों लंबी अवधि के विकास और इस मेजबान / symbiont जोड़ी के अवलोकन के लिए विकसित किया गया है.हालांकि, इन तरीकों से कई अन्य रोगाणुओं के संक्रमण की संभावना बढ़ जाती है, जो दोहराया पानी की आवश्यकता होती है. अन्य तरीकों पौधों की बड़ी संख्या के विकास के लिए एक अपेक्षाकृत बड़ी जगह की आवश्यकता होती है. विधि, यहां एम. के सहजीवी विकास वर्णित truncatula / एस बाँझ, एकल संयंत्र लघु में meliloti, कई फायदे हैं. इन लघु में पौधे कि पानी में पानी के दौरान पार संदूषण को रोकने, अप करने के लिए 9 सप्ताह के लिए आवश्यक नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त नमी और पोषक तत्वों है. इस phenotypes ऐसी गुत्थी विकास और जल्दी गुत्थी वार्धक्य में सूक्ष्म देरी के रूप में अल्पकालिक वृद्धि प्रणाली, में याद किया जा सकता है कि मात्रा निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है. ऊपर से पक्ष अवलोकन के लिए पौधों की आवश्यकता नहीं है तो भी, सूक्ष्म जगत में जड़ों और पिंड आसानी से, थाली ढक्कन के माध्यम से देखा जाता है.

Introduction

फली मेजबान संयंत्र Medicago truncatula A17 और Sinorhizobium 1021 meliloti rhizobial जीवाणु के बीच बातचीत जड़ गुत्थी विकास और नाइट्रोजन फिक्सिंग सहजीवन के अध्ययन के लिए सबसे विनयशील मॉडल प्रणालियों में से एक है. दोनों सहजीवी भागीदारों के जीनोम 1,2 अनुक्रम निर्धारण किया गया है और संयंत्र और जीवाणु दोनों आनुवंशिक हेरफेर 3,4 करने के लिए उत्तरदायी हैं. संयंत्र और बैक्टीरियल म्यूटेंट दोनों के phenotypes का विश्लेषण गुत्थी विकास के चरणों का पालन करने के लिए और समय के साथ सहजीवी उत्पादकता यों की क्षमता की आवश्यकता है. यहाँ हम एम. के रूट गुत्थी विकास के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन CV truncatula. एस के साथ inoculated Jemalong A17 मानक, गोल 100 मिमी व्यास, 15 मिमी गहरी प्रयोगशाला प्लेट (चित्रा 1 ए) से बने व्यक्ति लघु भीतर meliloti 1021. शूटिंग के प्लेट के पक्ष में एक नोकदार पोर्टल (के माध्यम से संपर्क में है और बढ़ता है Figurतों 1 बी, 1C, और 1E). जड़ें लघु भीतर निहित और प्लेट (चित्रा -1) के ढक्कन के माध्यम से अवलोकन की अनुमति है, जबकि बाँझ रखा जाता है. शूटिंग के लिए सुलभ है, इसके विकास के लिए विवश नहीं किया जाता है और इसे जड़ से बाँझपन समझौता किए बिना आवधिक अंतराल पर मापा जा सकता है. नोकदार प्लेट लघु बनाने की विधि मूल रूप से अल्फला पौधे उगाने के लिए लेह, एट अल. 5 द्वारा विकसित किया गया था, लेकिन यह व्यापक रूप से अन्य तरीकों पर इसके कई फायदे के बावजूद नहीं अपनाया गया था. इस विधि पर एक बदलाव भी पौधे की जड़ों और mycorrhizae 6 के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था. अब हम एम के विकास के लिए अनुकूल है और इस विधि अनुकूलित है truncatula पौधों. और आमतौर पर इस्तेमाल के तरीकों पर इस प्रोटोकॉल का लाभ नीचे वर्णित हैं.

एम. के गिरहदार अध्ययन के लिए व्यापक प्रयोग में है कि कई तरीके हैं truncatula inocuएस के साथ lated meliloti 7. गांठदार जड़ों की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि aeroponic caissons 7 में वृद्धि है. इस विधि में, पौधों के एक बड़े पोत पर निलंबित कर रहे हैं और जड़ों एस का एक मिश्रण के साथ वातित कर रहे हैं meliloti और पोषक तत्व समाधान 7. इस विधि व्यावहारिक है अगर एस के ही एक जीनोटाइप meliloti परीक्षण किया जाना है. यह बैक्टीरिया की उच्च सांद्रता के aerosolization की आवश्यकता है, विभिन्न जीवाणु उपभेदों के साथ inoculated caissons के बीच पार संदूषण की प्रबल संभावना है. अक्सर टीका पौधों की बड़ी मात्रा में तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक अन्य विधि के टब या perlite, vermiculite, रेत या पोषक तत्व समाधान के साथ संचार और एस के साथ inoculated हैं कि कैलक्लाइंड मिट्टी के बर्तन में वृद्धि है meliloti 7. इस विधि खुला टब या बर्तन का उपयोग आवश्यक है, और पोषक तत्व समाधान के पानी और पुनःपूर्ति की आवश्यकता है. बर्तन का एक और नुकसान है कि पौधोंजड़ों और पिंड की परीक्षा के लिए इस कण मैट्रिक्स से हटा दिया जाना चाहिए. इस पद्धति का एक और दोष जब कई अलग अलग एस इनक्यूबेटर अंतरिक्ष के एक बड़े क्षेत्र के लिए आवश्यक है कि है meliloti जीनोटाइप एक अलग बर्तन प्रत्येक बैक्टीरियल जीनोटाइप के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि तुलना में किया जाना है. "लियोनार्ड जार" इस विधि 8,9 पर एक भिन्नता है. एक लियोनार्ड जार दूसरे के ऊपर एक खड़ी है और एक बाती से जुड़े दो निष्फल जहाजों से बना है. मध्यम विकास कम पोत में रखा और perlite, vermiculite, रेत या ऊपरी पोत में कैलक्लाइंड मिट्टी की वृद्धि मैट्रिक्स में केशिका क्रिया द्वारा बाती के माध्यम से तैयार किया जाता है. अंकुर (ओं) विकास मैट्रिक्स में रखा और एस के साथ inoculated हैं meliloti. इस विधि में पानी की आवश्यकता नहीं है, लेकिन जड़ों और पिंड की परीक्षा अंकुर कण विकास मैट्रिक्स से हटा दिया जाना चाहिए.

Roo के लिए आसान परीक्षा की अनुमति नहीं देते कि कई तरीके हैंटीएस. इनमें से एक पारदर्शी प्लास्टिक "विकास थैली" 7 है. इस पद्धति का एक नुकसान यह है कि लगातार पानी तरल माध्यम एम. उगाने के लिए इष्टतम है केवल ≤ 10 मिलीलीटर के बाद आवश्यक है पाउच 7 में truncatula. पाउच प्रयोगों को भी आमतौर पर कारण थैली के भीतर कागज बाती के टूटने के लिए, ~ 2 सप्ताह 7 तक सीमित हैं. आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं कि दो अन्य विधियों पौधों अगर पर हो और जड़ों दिखाई दे रहे हैं जो में हमारे विधि के समान हैं, लेकिन इन तरीकों में भी हमारे प्रक्रिया से बचा जाता है कि नुकसान है. इन तरीकों में, पौधों को पूरी तरह से 24.5 सेमी झरझरा सर्जिकल टेप के साथ ऊपर चारों ओर से सील या कपास प्लग या प्लास्टिक की टोपियां 7 के साथ stoppered अग्रवाल तिरछा ट्यूबों में उगाई X 24.5 सेमी अगर प्लेटों के भीतर समाहित कर रहे हैं. इन दोनों पद्धतियों के जड़ों की आसान परीक्षा की अनुमति और बाँझ रखा जा सकता है. हालांकि, अगर तिरछा ट्यूब आमतौर पर मध्यम 7 अगर केवल 20 मिलीग्राम के साथ बड़े हो रहे हैं और पानी और पोषक तत्व एक आवश्यकतापौधों की लंबी अवधि के विकास के लिए ddition. 24.5 सेमी भीतर बड़े पौधों 24.5 सेमी अगर प्लेट लघु पर्याप्त नमी और दीर्घकालिक विकास के लिए पोषक तत्वों है, लेकिन बढ़ती शूट जल्दी से संलग्न थाली सूक्ष्म जगत और ethylene गैस गिरहदार 7 बाधा का निर्माण कर सकते हैं के भीतर विवश हो जाता है एक्स. यहाँ वर्णित प्रक्रिया में, शूटिंग के संपर्क में है और लंबी अवधि के विकास की अनुमति, ~ मीडिया के 70 मिलीलीटर होता है जो सूक्ष्म जगत के बाहर स्वतंत्र रूप से बढ़ता है.

यहाँ वर्णित प्रक्रिया फली पौधों की गिरहदार के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी अन्य मध्य आकार के पौधों की जड़ phenotypes के अध्ययन के लिए न केवल उपयोगी हो सकता है. इन लघु और एक पारंपरिक पॉली कार्बोनेट संयंत्र ऊतक संस्कृति जार के बीच अंतर यहाँ वर्णित थाली लघु में जड़ें नीचे जार के तल पर अगर की एक क्षैतिज परत में अगर की ऊर्ध्वाधर सतह पर बढ़ने के बजाय है. इस रूट न्यूनतम डी के साथ अगर सतह के बंद उठाया जा करने की अनुमति देताजड़ बाल और माइक्रोस्कोपी द्वारा जड़ बाल की परीक्षा की सुविधा जो जड़ सतह, अगर की न्यूनतम आसंजन को amage.

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Protocol

चरणों का प्रदर्शन 1, 2, 4, और एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में 6 की सिफारिश की है.

1. एम. की तैयारी truncatula A17 Seedlings

नोट: एम. इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया truncatula A17 बीज 22 डिग्री सेल्सियस ~ पर, या ~ 150-400 mmol / एम -2 एस -1 प्रकाश के साथ 22-26 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक संयंत्र के विकास के कमरे में ठंडा ग्रीनहाउस शर्तों के तहत उत्पादित कर रहे हैं.

  1. बीज अंकुरण प्लेटें डालो: 100 मिमी वर्ग प्लेट (गहरी 15 मिमी) का उपयोग करें और 3-5 मिमी की गहराई तक 10 अगर शुद्ध किया V / डब्ल्यू autoclaved 1.1-1.2% डालना. प्रत्येक प्लेट (63-125 बीज / प्लेट के बराबर) बीज की ~ 0.25-0.5 ग्राम अंकुरित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्लेटों के लिए संयंत्र सेल संस्कृति का परीक्षण किया, शुद्ध अगर उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. अगर के लिए विक्रेता और सूची संख्या जानकारी विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका में सूचीबद्ध है.
  2. धमकी देना / एम. बाँझ truncatula A17 बीजएस: पौधों की वांछित संख्या के लिए पर्याप्त बीज वजन. (; इस ~ 63-125 बीज है 0.25-0.5 ग्राम बीज / फ्लास्क) और पिपेट केंद्रित (96%) का 20 मिलीलीटर बाँझ पन्नी कवर के साथ बाँझ 125 मिलीलीटर बोतल में रखें बीज (एम. A17 बीज प्रत्येक ~ 4 मिलीग्राम हैं truncatula) एच 2 एसओ कुप्पी के पक्ष के साथ 4.
    नोट: एसिड प्रच्छान बीज बाँझ जाएगा. इसके अलावा, फ्लास्क के पक्ष के साथ एसिड pipetting द्वारा, यह unsterilized बीज के साथ संपर्क में आ गया है कि कुप्पी के अंदर फिर से बाँझ जाएगा.
  3. एक बाँझ कांच विंदुक के साथ बीज के clumps को तोड़ने. 10-12 मिनट के लिए अक्सर प्रत्येक कुप्पी भंवर. छोटे, भूरे रंग के गड्ढों बीज पर दिखाई हो जाएगा. ये बीज कोट 11 में छोटे छेद होते हैं.
    नोट: 4 अतः केंद्रित एच 2 के साथ कार्य करते समय आंखों की सुरक्षा और दस्ताने पहनते हैं.
  4. अतः 4 एच 2 निकालें और बीज कुल्ला: बीज की कम से कम 10% छोटे भूरे गड्ढ़े, या 12 मिनट है जब बीत चुके हैं, इनमें से जो भीसबसे पहले आता है, एक बाँझ कांच विंदुक के साथ बोतल से सब एसिड हटा दें. (कम से कम 300 मिलीलीटर पानी के नल युक्त 1-2 एल बीकर में जगह कचरे एसिड. यह एसिड पतला और overheating रोकने. जाएगा) कुप्पी की अवस्था में शेष एसिड एकत्र करने के लिए फ्लास्क झुकाव और एक छोटा गिलास विंदुक का उपयोग शेष सभी एसिड हटा दें. अवशिष्ट एसिड रहता है, तो यह कुल्ला पानी के साथ प्रतिक्रिया बीज गर्मी और उन्हें मार डालेगा.
    1. जल्दी से प्रत्येक कुप्पी में बाँझ ultrapure पानी की 100 मिलीलीटर गिरने से बीज कुल्ला. पानी की अतिरिक्त मात्रा एसिड पतला और पानी के साथ एसिड की प्रतिक्रिया के दौरान overheating और बीज की क्षति को रोकने जाएगा. पानी डालो और कुप्पी के होंठ फ्लेम बाँझ.
    2. बाँझ ultrapure पानी की 50 मिलीलीटर के साथ बीज 8-10x कुल्ला. प्रत्येक कुल्ला के दौरान कुप्पी भंवर. कुप्पी इस बिंदु पर बाँझ विचार किया जाना चाहिए और कुप्पी के होंठ प्रत्येक कुल्ला करने से पहले flamed किया जाना चाहिए.
  5. बीज रातोंरात आत्मसात करते हैं: के बादपिछले कुल्ला, अंधेरे में रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक फ्लास्क और जगह पर बाँझ पन्नी कवर की जगह, प्रत्येक कुप्पी में 50 मिलीलीटर बाँझ ultrapure पानी डालना.
  6. अंकुरण थाली पर प्लेस के बीज: दे बीज रातोंरात आत्मसात करने के बाद, बीज resuspend और से एक 1.1-1.2% अगर अंकुरण की थाली पर उन्हें डाल करने के लिए 20 मिलीलीटर बाँझ ultrapure पानी, भंवर जोड़ने तो, ~ 25 मिलीलीटर ultrapure पानी के साथ 2x कुल्ला, पानी टपकना 1.1 कदम. बीज कुप्पी में रहते हैं, तो अधिक पानी जोड़ने के लिए और फिर से डालना. प्रत्येक कुप्पी से एक प्लेट (63-125 बीज / प्लेट) को बीज वितरित करें.
    1. बीज वितरित करने के लिए थाली ज़ुल्फ़. बीज थाली के एक छोर पर एक 4-5 सेमी बैंड में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए. इस थाली की "ऊपर" हो जाएगा. "नीचे" 5-6 सेमी (2A चित्रा) के बीज से मुक्त रखा जाना चाहिए.
    2. एक बाँझ विंदुक के साथ बंद पानी खींचना. प्लेट के नीचे करने के लिए शेष पानी निकास के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर थाली झुकाएँ. तिल पर ढक्कन बदलेंटेड प्लेट और प्रकाश से बचाने के लिए. प्लेट्स 10-20 मिनट के निकास के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. (चित्रा 2 बी).
  7. अंकुरण स्थापनाः एक बाँझ विंदुक के साथ झुका प्लेट के नीचे में एकत्र किया है कि सभी पानी निकाल दें.
    1. ढक्कन बदलें और parafilm के साथ थाली मुहर. दस्ताने पहनें और (चित्रा -2) बाँझ रखना.
    2. अंकुरण प्लेटें ढेर और फिर एक 90 डिग्री के कोण पर उन सभी को बारी. बीज अगर की ऊर्ध्वाधर सतह पर झूठ बोल रही हो जाएगा. पूरी तरह से आत्मसात बीज आसानी से अगर का पालन करना चाहिए. जड़ों नीचे (चित्रा 2 डी) विकसित होगा.
    3. प्रकाश ब्लॉक और 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए पन्नी में अंकुरण प्लेटों के ढेर लपेटें.

नोट: कम से कम 3 दिनों के लिए अंकुरण आय हैं, जड़ों लघु में अगर तक पहुंचने के लिए बहुत छोटा हो सकता है. अंकुरण से अधिक 4 दिनों सूक्ष्म जगत प्लेटों के स्थानांतरण से पहले आय हैं, पौधों की उत्तरजीविता होगागरीब हो. यदि एम. धीमी अंकुरण दर के साथ truncatula ecotypes या म्यूटेंट तुलना में जा रहे हैं, धीरे धीरे germinating ecotype 3 दिनों से अधिक समय उगना की अनुमति दी जानी चाहिए.

2. व्यक्तिगत प्लेट लघु की तैयारी

  1. प्रत्येक मनुष्य का सूक्ष्म दर्शन के लिए जेन्सेन मध्यम 12 (रचना के लिए 1 टेबल देखें) की अनुमति ~ 70 मिलीलीटर मध्यम तैयार. के लिए सुविधाजनक हैं कि pitchers या बोतल में तैयार करें तेजी से डालने का कार्य (पिचर प्रति कोई 1-2 से एल) और वाष्पदावी दौरान घड़े में एक चुंबकीय हलचल बार छोड़ दें.
    1. मध्यम ~ 55-65 डिग्री सेल्सियस, पूरक जोड़ दिया गया है ठंडा है, और पीएच (1 ​​टेबल देखें) की जाँच की गई है, के बाद, गोल 100 मिमी व्यास में 15 मिमी गहरी प्लेटें डाल देना. प्लेट्स ~ 0.9-1 सेमी गहरा (~ 70 मिलीग्राम / प्लेट) डाला जाना चाहिए.
    2. जेन्सेन मध्यम के घटक एक बादल वेग फार्म कर सकते हैं, तो इसे बाहर बसने से घटकों को रोकने के लिए समय - समय चुंबकीय हलचल प्लेट को घड़ा लौटने के लिए महत्वपूर्ण है. अवक्षेप विज़ हो सकता हैवे जमना के बाद थाली में ible, और जब तक वे समान रूप से प्लेटों के बीच वितरित कर रहे हैं के रूप में प्रदर्शन को प्रभावित नहीं करते.
    3. थाली lids पर संक्षेपण के गठन को रोकने के लिए डालने का कार्य के दौरान प्लेटों हो चुकी है.
  2. जेन्सेन प्लेटें जम जाने के बाद, एक U-आकार 5 (चित्रा 3) में तुला किया गया है कि एक वजन रंग के साथ दोनों प्लेटों और lids निशान. रेड हॉट, पायदान 5-6 प्लेटों तक एक बर्नर के साथ रंग के मोड़ गर्मी और उसके बाद फिर से गर्मी. नोकदार ढक्कन नोकदार थाली पर रखा जाता है, यह अंकुर के शूट (3B चित्रा) विकसित होगा जिसके माध्यम से एक अंडाकार पोर्टल पैदा करेगा. नोकदार प्लेटें जमा करने के लिए कर रहे हैं, आयल फिल्म के साथ व्यक्तिगत रूप से लपेट ..

3. Sinorhizobium की तैयारी संस्कृति meliloti

दो दिन संयंत्र inoculations पहले, सभी एस की संस्कृतियों शुरू meliloti seedlings पर टीका जा उपभेदों. Cultuजोड़कर LBMC 2.5 मिमी MgSO 4, 2.5 मिमी 2 CaCl, और उचित एंटीबायोटिक दवाओं (Ty मध्यम भी अच्छी तरह से काम करता है) के साथ पूरक (Luria-Bertani [मिलर]) मध्यम 13 में विकसित किया जाना चाहिए. प्रत्येक संस्कृति के रूप में छोटे रूप में 2-3 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त होगा.

  1. कोशिकाओं घने हैं जब तक 2 दिन के लिए झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
  2. सबसे संयंत्र inoculations के लिए, एस के विकास के चरण meliloti महत्वपूर्ण नहीं है. आमतौर पर, देर करें या जल्दी स्थिर चरण कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं.

4. एम. बाहर बिछाने व्यक्तिगत लघु पर truncatula Seedlings

  1. 3 दिनों के बाद, (चरण 1 में तैयार) एक अंकुरण प्लेट खुला और तुरंत बाँझ ultrapure पानी के साथ बाढ़. डुबकी इथेनॉल और बाँझ लौ संक्षेप में संदंश. धीरे सुखाने को रोकने के लिए पानी के नीचे सभी पौधों की जड़ सुझावों पुश करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें. जड़ें लंबे 2-6 सेमी से लेकर जाएगा. बहुमत 3-4 सेमी हो जाएगा. सीधे जड़ों और कोई स्पष्ट साथ seedlings का चयन करेंदोष.
  2. संघनन के निर्माण में सहयोग के लिए जेन्सेन मध्यम लघु की पलकों की जाँच करें. संक्षेपण हटाने या एक नया नोकदार ढक्कन के साथ इसे बदलना ढक्कन झटका. ढक्कन पर संघनन की एक अतिरिक्त है, तो अंकुर जड़ ढक्कन का पालन करना हो सकता है और संक्षेपण dries के बाद फिर मर जाते हैं.
  3. संदंश का प्रयोग, धीरे cotyledons द्वारा अंकुरण थाली से एक अंकुर लेने और एक जेन्सेन मध्यम सूक्ष्म जगत पर रूट रखना. जड़ टिप अगर साथ संपर्क में है सुनिश्चित करें.
  4. यह अभी भी मौजूद है, तो धीरे बीज कोट हटा दें. बीज कोट 5-10 मिनट के लिए पानी में भिगोने के बाद ढीला होना चाहिए. धीरे यह रास्ता देती है जब तक संदंश के साथ बीज कोट तंग, और त्यागें. शूटिंग के cotyledons और लगभग 0.5 सेमी प्लेट (चित्रा -4 ए) में यू पायदान से बाहर फैलाना चाहिए. ध्यान से अंकुर (चित्रा 4 बी) के लिए एक पोर्टल बनाने, अंकुर के ऊपर ढक्कन का यू निशान के साथ थाली के ढक्कन की जगह.सभी seedlings लघु पर रखा गया है जब तक क्षैतिज ढेर में अलग प्लेटों सेट करें.
  5. व्यवहार्य लग रही है और एक सीधे जड़ है कि प्रत्येक अंकुरण थाली से सभी seedlings का प्रयोग करें. (यदि संभव हो तो, सिर्फ टीका से पहले हुई seedlings के लिए प्रतिस्थापन के रूप में उपयोग करने के लिए नहीं खोले गए पौधों की एक प्लेट में छोड़ दें.)
  6. सभी seedlings के बाहर बिछाने के बाद, उन्हें क्षैतिज जेन्सेन लघु पर बैठने की अनुमति है, जबकि एस meliloti inoculum निलंबन तैयार किया जा रहा है.

5. एस की तैयारी meliloti inoculum निलंबन

  1. एस जाँचें वे बढ़ रहे हैं यकीन है कि समय समय पर टीका के बाद संस्कृतियों meliloti. 2 दिन वृद्धि के बाद, आयुध डिपो के 600 2 और 4 के बीच होना चाहिए.
  2. पिपेट एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और गोली अपकेंद्रित्र में प्रत्येक संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  3. 0.85% बाँझ NaCl या बाँझ ultrapure पानी में या तो कोशिकाओं दो बार धोएं. 0.5 मिलीलीटर 0.85% काएं में कोशिकाओं ResuspendNaCl या ultrapure पानी चिढ़ाना.
  4. Resuspended एस के एक 1/10 कमजोर पड़ने के 600 आयुध डिपो उपाय 5.3 कदम से संस्कृतियों meliloti. यह पढ़ने के आधार पर, 600 आयुध डिपो = 0.05 पर बाँझ ultrapure पानी में प्रत्येक संस्कृति का एक निलंबन बनाने. सेल घनत्व बहुत अधिक है, गिरहदार हिचकते जा सकता है. 100 μl प्रत्येक अंकुर पर टीका किया जा सकता है कि इतना पतला निलंबन के लिए पर्याप्त बनाने. आयुध डिपो 600 = 0.05 निलंबन के बादल छाए हुए आंखों से अभी मुश्किल से प्रत्याक्ष होना चाहिए.

6. टीका और लघु की सील

  1. तुरंत पहले शुरुआत inoculations के लिए, जेन्सेन मध्यम लघु करने के लिए स्थानांतरण नहीं बच गया है कि wilted seedlings के लिए जाँच करें. अंकुरण प्लेटों से ताजा seedlings के साथ उन seedlings बदलें.
  2. प्रत्येक मनुष्य का सूक्ष्म दर्शन को खोलें और उचित एस के 100 μl टीका लगाना अंकुर रूट पर निलंबन meliloti. ढक्कन बदलें और क्षैतिज STAC में अलग सेट6-10 लघु के एस. प्रत्येक एस के लिए meliloti तनाव तुलना में किया जा करने के लिए, कम से कम 15 पौधों टीका लगाना. सहजीवी उत्पादकता में सूक्ष्म अंतर है कि उपभेदों के लिए, 30-35 पौधों टीका लगाना. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में uninoculated कम से कम 10 पौधों छोड़ दें. एस के साथ 30-35 पौधों टीका लगाना meliloti 1021 या अन्य उपयुक्त जंगली प्रकार तनाव सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए.
  3. बाद एस meliloti निलंबन जड़ की सतह पर सोखना के लिए समय दिया गया है और निलंबन तरल अगर (कम से कम 20 मिनट.) में भिगो दिया है, आयल फिल्म के साथ व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक थाली लपेटो. प्लेट्स निशान के बहुत किनारे करने के लिए लिपटे किया जाना चाहिए, लेकिन आयल फिल्म अंकुर (चित्रा 4C) की वृद्धि ब्लॉक नहीं होना चाहिए.
  4. रैपिंग के समय, थाली ढक्कन के अंदर का पालन जड़ों के लिए एक अंतिम जांच करते हैं. , ढक्कन से पालन जड़ों को निकालने के बेंच पर फ्लैट प्लेट रख दी है और अगर सु पर वापस नीचे जड़ दस्तक को ढकने के नल या झटकाrface.
  5. 6-10 प्लेटों के प्रत्येक ढेर के अंकुर पोर्टल्स लाइन. Seedlings (चित्रा 4D) ऊपर की ओर इशारा करते हुए के साथ एक 90 डिग्री के कोण पर ढेर निर्धारित करना. आयल फिल्म की चिपचिपाहट seedlings (चित्रा 4E) उभरने जहां unwrapped एक 1-2 सेमी पट्टी छोड़ने, पन्नी में पूरे ढेर रैप करने के लिए काफी देर तक जगह में प्लेटों का आयोजन करेगा. पन्नी प्रकाश से जड़ों की रक्षा करेगा.
  6. (एक 16 घंटा प्रकाश / 8 घंटा अंधेरे चक्र पर 21-25 डिग्री सेल्सियस, 60-70% सापेक्ष आर्द्रता और 100-175 μmol / एम -2 एस -1 प्रकाश में प्रकाशित एक विकास कक्ष या विकास कक्ष में पन्नी लिपटे ढेर रखें चित्रा 1 ए). इन विकास शर्तों के तहत, प्रकाश के स्तर पर लंबे समय तक ऊष्मायन अधिक से अधिक 200 μmol / एम -2 एस -1 पौधों की वृद्धि पर एक हानिकारक प्रभाव हो सकता है.

7. रूट सिस्टम और सहजीवी phenotypes के quantitation की परीक्षा

संयंत्रों में बनाए रखा जा सकताअप करने के लिए 9 सप्ताह के लिए लघु.

  1. गुत्थी संख्या प्रत्येक ढेर से पन्नी unwrapping और पिंड की गणना के द्वारा समय अंक की एक श्रृंखला में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. एस के साथ inoculated पौधों पर पिंड का विकास meliloti 1021 जंगली प्रकार टीका के बाद 10-14 दिनों से स्पष्ट कर रहे हैं.
  2. सहजीवी उत्पादकता भी उभरते शूटिंग की लंबाई मापने के द्वारा हर समय बिंदु पर मापा जा सकता है.
  3. सहजीवी उत्पादकता के अंतिम quantitation आमतौर पर गोली मार detaching और शूटिंग के ताजा वजन को मापने के द्वारा टीका के बाद 7 सप्ताह में किया जाता है. अब विकास के वांछित है, तो यह कदम के रूप में देर से 9 सप्ताह के रूप में किया जा सकता है.

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Representative Results

इन थाली लघु की तैयारी और टीका परिचय में वर्णित अधिकांश अन्य तरीकों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल है. इन लघु का प्रयोग भी पानी या पोषक पूरकता, जड़ बाँझपन का रखरखाव, दोनों जड़ों और प्रकाश से जड़ों की सुरक्षा के लिए आसान परीक्षा के बिना (9 सप्ताह के लिए) लंबे समय तक पौधों की वृद्धि के लिए परमिट, संयंत्र की स्वेच्छापूर्ण विकास के लिए शूट करने के लिए, आसान पहुँच गोली मारता है लंबाई माप, और जड़ बाल करने के लिए कम से कम नुकसान के साथ लघु से पौधों को हटाने. चित्रा 1 ए एक मशीन में लघु में बढ़ रही युवा seedlings से पता चलता है. आंकड़े 1B-1E शो में छवियों एम. युक्त लघु के कई अलग अलग विचार जंगली प्रकार एस के साथ inoculated truncatula A17 पौधों meliloti 1021. कसकर बांध है,> 220 लघु X 67.5 सेमी इनक्यूबेटर शेल्फ एक 73.8 सेमी पर फिट होगा. एक में 1B और 1C शो लघु आंकड़ेपन्नी लिपटे लघु में पोर्टलों से उभरते पौधों के साथ हो चुकी है. चित्रा -1 हटा पन्नी और जड़ और थाली के सामने के माध्यम से दिखा पिंड के साथ एक एकल सूक्ष्म जगत से पता चलता है. चित्रा 1E एक ही सूक्ष्म जगत से उभरते संयंत्र के साथ फ्लैट झूठ बोल से पता चलता है थाली में पोर्टल. शूट लंबाई संयंत्र परेशान बिना सूक्ष्म जगत (चित्रा 1C) से उद्भव की बात से मापा जा सकता है. चित्रा 5A एम. के लिए गोली मार लंबाई डेटा से पता चलता है जंगली प्रकार एस के साथ inoculated truncatula A17 पौधों meliloti 1021 uninoculated 7 सप्ताह में पौधों और 9 सप्ताह बाद टीका के साथ तुलना में. लघु में ग्रोथ गुत्थी विकास और गोली मार लंबाई की timepoints की एक श्रृंखला इकट्ठा करने के लिए आदर्श है. अंतिम timepoint पर शूटिंग शूटिंग के ताजा वजन (चित्रा 5 ब) की माप के लिए बंद काटा जाता है. 6 7 सप्ताह स्थिति में 3 सहजीवी phenotypes के उदाहरण से पता चलता हैटी टीका. एम. के रिश्तेदार सहजीवी उत्पादकता विभिन्न एस के साथ inoculated truncatula A17 पौधों meliloti उपभेदों शूट लम्बाई (चित्रा 6A) द्वारा मात्रा और ताजा वजन (चित्रा 6B) को गोली मार रहा है. इन उपभेदों के साथ inoculated पौधों पर जड़ पिंड की संख्या चित्रा 6C में दिखाया गया है. Leghemoglobin के उत्पादन की वजह से एक गुलाबी रंग छोटे सफेद पिंड आमतौर पर nonfunctional और / या निरस्त कर रहे हैं और भूरे रंग के पिंड वृद्ध होनेवाला और 14-18 परिगलित हैं, जबकि पिंड, कार्यात्मक और नाइट्रोजन स्थिरीकरण में सक्षम हैं कि इंगित करता है. चित्रा 6 में तुलना से पता चलता है कि एम. के सहजीवी उत्पादकता एस के साथ inoculated truncatula A17 पौधों meliloti 1021 ExoY undecaprenyl फॉस्फेट गैलेक्टोज phosphotransferase overexpresses जो pstb-LAFR5-exoY प्लाज्मिड, ले जाने, जंगली प्रकार एस की तुलना में अधिक है meliloti 1021 और नकारात्मक सी ले जाने उपभेदों ontrol pstb-LAFR5 प्लाज्मिड. ये ExoY अधिक व्यक्त उपभेदों नियंत्रण उपभेदों से succinoglycan सहजीवी exopolysaccharide के अधिक उत्पादन. प्रकट करने के लिए कई सप्ताह लग कि सहजीवी phenotypes में मतभेद यों क्षमता इस पद्धति का एक बड़ा फायदा है. एम. पर सहजीवी उत्पादकता के सभी उपायों के लिए truncatula A17, Sinorhizobium medicae उपभेदों WSM419 और ABS7 एस की तुलना में बेहतर प्रदर्शन meliloti 1021 (आंकड़े 6A-6C). (चित्रा 6 से डेटा मूल रूप से 19) 2012 (जोन्स में दिखाई दिया.) सूक्ष्म जगत disassembled और ताजा भार गोली मार रहा है उस समय जड़ें भी माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है, मापा जाता है. आंकड़ा 7 एम. के प्रतिनिधि विचारों से पता चलता है लघु से हटाने के बाद truncatula A17 जड़ों. जड़ों अगर की सतह पर लेट गया और ऊपर जड़ें अगर की एक क्षैतिज परत से नहीं कर रहे हैं के बाद से जड़ बाल न्यूनतम क्षति का अनुभव किया है.

थाली में अगर विकास माध्यम की ~ 70 मिलीलीटर है क्योंकि वहाँ _content "> पौधे इन लघु में अप करने के लिए 9 सप्ताह के लिए बनाए रखा जा सकता है. अब विकास की अवधि के बाद, कुछ पौधे सूखे के लिए शुरू हो सकता है. विकास के सात सप्ताह के सहजीवन के लिए इष्टतम है एस 1021 meliloti साथ. एम. के अधिक कुशल सहजीवन के लिए एस medicae WSM419 या एस medicae ABS7, 4-5 हफ्तों की एक छोटी विकास की अवधि के साथ A17 truncatula इष्टतम है.

एल प्रति अंतिम एकाग्रता शेयर समाधान की मात्रा शेयर एकाग्रता
1 ग्राम CaHPO 4 एनए एनए
0.2 जी 4 MgSO · 7 2 0 1 मिलीलीटर 0.2 मिलीग्राम / छ
0.2 ग्राम कश्मीर 2 HP0 4 1 मिलीलीटर 0.2 मिलीग्राम / छ
0.2 छ NaCl 1 मिलीलीटर 0.2ग्राम / मिलीलीटर
0.1 जी FeCl 3 · 6H20 1 मिलीलीटर 0.1 मिलीग्राम / छ
11.5 ग्राम अगर शुद्ध (अगर विनिर्देशों के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें)
milliQ एच 2 0 1 एल

तालिका 1. थाली लघु के लिए जेन्सेन मध्यम अगर प्रोटोकॉल. जेन्सेन माध्यम के लिए तैयार करने के निर्देश.

चरण:

  1. सामग्री ऊपर जोड़ें, और चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ मिश्रण.
  2. घड़े में हलचल पट्टी के साथ आटोक्लेव 45 मिनट, तरल चक्र,.
    नोट: CaHPO 4 और FeCl 3 वाष्पदावी दौरान बाहर वेग होगा. निलंबन में उन्हें वापस पाने के लिए हिलाओ, मीडिया अभी भी बादल छाए रहेंगे रहेगा
  3. यह अपने हाथों से घड़ा लेने के लिए दर्द नहीं है, जब तक सरगर्मी के साथ शांत.
  4. 1 क (नुस्खा के लिए नीचे देखें) एल प्रति खनिजों का पता लगाने एमएल जोड़ेंइले सरगर्मी
    नोट: वितरण से पहले खनिजों का पता लगाने में वेग resuspend सुनिश्चित करें.
  5. क्रियाशीलता जबकि, एल प्रति 0.25 मिलीलीटर 4 एन NaOH जोड़ें.
  6. बाँझ विंदुक के साथ ~ 100 μl मीडिया को दूर करने और पीएच पेपर को लागू करने से पीएच की जाँच करें
    नोट: पीएच 5-10 रेंज कागज में अच्छी तरह से काम करता है. पीएच ~ 7 पूर्ण रंग के विकास के लिए कुछ सेकंड की अनुमति चाहिए. पीएच सही नहीं है, तो एक तैयारी में त्रुटि हो सकती है.
  7. चुंबकीय हलचल थाली की ओर लौटने से कुप्पी remixing, संभव के रूप में मोटी प्लेटें डालो
    नोट: एक थाली overfilled जाता है (यानी तरल ढक्कन के नीचे पर बेकार है),
    नोट: ~ प्रति लीटर 15 प्लेटें प्राप्त करने की उम्मीद.

खनिज शेयर 1 एल ट्रेस (autoclaving द्वारा बाँझ)

1 जी एच 3 बो 3
1 ग्राम ZnSO 4 · 7 2 0
0.5 ग्राम CuSO 4 · 5H 2 0
0.5 ग्राम MnCl 2 · 4H 2 0
1 ग्राम NaMoO 4 · 2H 2 0
फौजी क्यू एच 2 0 एल 1 को

चित्रा 1
चित्रा 1. एस के साथ inoculated संयंत्रों युक्त लघु का दृश्य meliloti 1021 ए) एक मशीन में बढ़ रही सूक्ष्म जगत प्लेटों में पौधे. बी) एम. एस के साथ inoculated truncatula A17 पौधों जड़ के साथ बी और सी से सूक्ष्म जगत प्लेटों में से एक लघु. डी में notches के माध्यम से बढ़ पौधों) दिखा बी में प्लेटों के जेन्सेन अगर लघु के शीर्ष में पायदान के माध्यम से बढ़ रही meliloti 1021 जंगली प्रकार. सी) अपर बंद हुआ देखें ढक्कन के माध्यम से imaged पिंड. ई) fro थालीएम डी पायदान से उभरते शूटिंग के साथ फ्लैट झूठ बोल रही है.

चित्रा 2
चित्रा 2. बीज अंकुरण थाली सेट अप. ए) बीज एक 100 मिमी वर्ग की थाली. में से एक से डेढ़ भर में वितरित कर रहे हैं) अग्रवाल सतही जल झुका प्लेट के नीचे पर इकट्ठा करने की अनुमति से सूखा है. सी) प्लेट्स ढेर), आयल फिल्म में लिपटे खड़ी है और विकास कर रहे हैं एक 90 कोण में बदल गया और पन्नी में लपेटा.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक तुला रंग के साथ जेन्सेन प्लेटें निशाना साधना द्वारा लघु का निर्माण. ए) एक अंडाकार फार्म करने के लिए आमादा किया गया है कि एक धातु वजन रंग लौ गरम किया जाता है और के पक्ष में एक यू के आकार का छेद पायदान इस्तेमाल कियाथाली और ढक्कन के पक्ष में. थाली में यू निशान के नीचे अगर सतह के शीर्ष पर होना चाहिए. ढक्कन में यू निशान के नीचे अंकुर बहर कर सकते हैं जिसके माध्यम से एक अंडाकार आकार पोर्टल बनाता थाली पर ढक्कन की जगह) के लिए सभी तरह ढकने. बी के शीर्ष पर होना चाहिए.

चित्रा 4
चित्रा 4. लघु में पौधों की प्रविष्टि. ए) दो दृश्य अंकुर रूट लाइन में खड़ा notches के साथ थाली पर ढक्कन रखने) की गोली मार थाली. बी) और सी में यू पायदान के बाहर फैला हुआ की cotyledons और ~ 0.5 सेमी के साथ अगर सतह पर रखना चाहिए कि कैसे दिखाने अंकुर के लिए एक अंडाकार पोर्टल पैदा करेगा. आयल फिल्म के साथ मजबूती से थाली लपेटकर बढ़ने से ढक्कन रखने और सुखाने को रोकने जाएगा. डी) प्लेट्स फिर एक साथ खड़ी की जा सकती है 6-10 के समूहों, और ई) में पन्नी के साथ लिपटे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि सहजीवी phenotypes 7 सप्ताह वृद्धि और एम. के 9 सप्ताह वृद्धि के बाद एस के साथ inoculated पौधों की truncatula व्यक्ति लघु में A17. ए) को गोली मार लंबाई meliloti 1021, और uninoculated पौधों की गोली मार लंबाई लघु से पौधों को हटाने के बिना 7 सप्ताह में मापा गया. 9 सप्ताह में बाद टीका, गोली मार लम्बाई (ए) मापा गया था, और फिर गोली मारता है काटा गया और (बी) तौला गया.

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चित्रा 6. प्रतिनिधि सहजीवी phenotypes एम. के 7 सप्ताह वृद्धि के बाद truncatula A17 व्यक्ति लघु में. एस के उपभेदों exoY-overexpressing meliloti 1021 मेजबान संयंत्र Medicago truncatula A17 पर सहजीवन में वृद्धि की है. एस के सहजीवी उत्पादकता meliloti 1021 एम. पर truncatula A17 exoY द्वारा इनकोडिंग undecaprenyl फॉस्फेट गैलेक्टोज phosphotransferase overexpress कि उपभेदों में सुधार हुआ है. सहजीवी उत्पादकता सेमी (क) में शूट की लंबाई के रूप में मापा जाता है और (बी) ग्राम में ताजा वजन गोली मार रहा है. सफेद, अप्रभावी पिंड (मध्य ग्राफ बार); गुलाबी, कार्यात्मक पिंड (नीचे ग्राफ बार) का नंबर और ब्राउन, परिगलित पिंड (ऊपर ग्राफ बार) (सी) में दिखाया गया. एस के साथ inoculated पौधों की सहजीवी उत्पादकता और गुत्थी संख्या medicae उपभेदों WSM419 और ABS7 भी दिखाए जाते हैं. ग्राफ सलाखों पर सितारे एक सांख्यिकीय निरूपितएक unpaired टी परीक्षण में 1,021 जंगली प्रकार संदर्भ तनाव से ly महत्वपूर्ण अंतर है. किसी भी succinoglycan उत्पादन नहीं करता है कि एक exoY :: TN5 अशक्त उत्परिवर्ती साथ inoculated संयंत्रों uninoculated पौधों के समान गोली मार लंबाई और ताजा वजन था, और केवल सफेद, अप्रभावी पिंड का उत्पादन किया. (ए) में और (बी) मूल रूप से 19 में प्रकाशित किए गए थे रेखांकन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. वे अगर की सतह पर झूठ क्योंकि लघु से हटाए जाने के बाद एक विदारक माइक्रोस्कोप पर imaged जड़ें. जड़ें आसानी से जड़ बाल करने के लिए कम से कम नुकसान के साथ इमेजिंग के लिए लघु से हटाया जा सकता है. छवियाँ एम. की जड़ों को दिखाने 10 दिनों के बाद टीका (ए, बी) में truncatula A17 (सी). पता चला जड़ों एस के साथ inoculated थे meliloti 1021 जंगली प्रकार (ए), एक एस meliloti एक eglC :: गस संलयन (बी) ले जाने तनाव, और एक एस एक SMc00911 :: गस फ्यूजन 20 (सी) ले जाने meliloti तनाव. एस के गस धुंधला SMc00911 :: गस फ्यूजन ले जाने meliloti कोशिकाओं जड़ बाल पर दिख रहा है और ई. बार में जड़ सतह से 100 माइक्रोन से मेल खाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रोटोकॉल के कई चरण हैं: 1) शुद्ध, संयंत्र सेल संस्कृति का उपयोग करने की आवश्यकता अगर overemphasized नहीं किया जा सकता का परीक्षण किया. इस अल्फला seedlings के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन यह एम. के विकास के लिए महत्वपूर्ण है truncatula A17. 2) यह कदम 1 में वर्णित के रूप में खड़ी अगर प्लेटों पर seedlings उगना के लिए महत्वपूर्ण है. अंकुर जड़ों सीधे भी कम और / या नहीं होगा क्योंकि एक 15 मिमी गहरी प्लेट 7 में एक औंधा क्षैतिज सतह पर seedlings germinating का व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक इस प्रोटोकॉल के लिए सलाह नहीं दी है. लंबाई में 2-4 सेमी की सीधे उगाने जड़ों के साथ seedlings लघु करने के अंकुरण प्लेटों से स्थानांतरण के लिए आदर्श होते हैं. खड़ी अंकुरण प्लेटों में विकास के तीन दिनों के इस लंबाई प्राप्त करने के लिए आमतौर पर जड़ों के लिए आदर्श है. 3) यह पिछले टीका करने rhizobia साथ पौधों के संक्रमण से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है. Microco को अंकुरण प्लेटों से पौधों को हस्तांतरण करने से पहलेएसएमएस, कार्य क्षेत्र को अच्छी तरह से इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए और स्थानांतरण में इस्तेमाल सभी उपकरणों अक्सर निष्फल लौ होना चाहिए. संदूषण का एक अन्य संभावित स्रोत एस तैयारी से बचा जा सकता है तैयारी अंकुर के लिए इस्तेमाल किया उस से एक अलग कार्य क्षेत्र में लघु का टीका के लिए meliloti तनाव निलंबन. कवक spores कोट में एम्बेड किया जा सकता है के बाद से लघु के फफूंद संदूषण भी, सूक्ष्म जगत के इंटीरियर से बीज कोट के सभी अवशेष हटाने से बचा जा सकता है. 4) अंकुर अस्तित्व हस्तांतरण के दौरान हर समय नम और अगर साथ संपर्क में अंकुर जड़ों रखने, और बहुत कोमल उपचार द्वारा द्वारा बड़ी की जा सकती. अंकुरण थाली में अगर में फंस जड़ के साथ किसी भी अंकुर जड़ को नुकसान से बचने के लिए सावधानी से excised किया जाना चाहिए. व्यवहार्य पौधों की एक उच्च उपज शुरुआत inoculations पहले लघु के ढेर में हुई seedlings के लिए एक अंतिम जांच कर रही है, और उन्हें बुद्धि की जगह से प्राप्त किया जा सकता हैज नया seedlings. Seedlings अच्छी हालत में हैं और थाली ढक्कन के अंदर का पालन नहीं किया है, पौधों की कम से कम 5% इस स्तर पर जगह की आवश्यकता चाहिए. सूक्ष्म जगत से शूट विकास की बाधा यकीन बीज कोट का कोई अवशेष cotyledons बाधा रहे हैं और सूक्ष्म जगत parafilm लिपटे शूट बाधित नहीं होगा कि इतने ध्यान से है कि बनाकर रोका जा सकता है.

हम नियमित रूप से मेजबान पौधों में सहजीवन का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग एम. truncatula A17 और अल्फला, और हम वर्तमान में अन्य एम. के विकास के लिए तकनीक का अनुकूलन कर रहे हैं truncatula खेती, Medicago के अन्य प्रजातियों और Melilotus (sweetclovers) की प्रजातियों. हम अभी तक एम. के साथ इस पद्धति का परीक्षण नहीं किया है A17 के साथ एक आनुवंशिक मानचित्रण भागीदार के रूप में प्रयोग किया जाता है कि एक ecotype है जो truncatula A20,. हमने पाया है कि एम. CV truncatula. R108 शुद्ध संयंत्र सेल संस्कृति का परीक्षण किया एजी पर अच्छी तरह से विकसित नहीं हैहम वर्तमान में उपयोग कर रहे हैं और हम एक और अगर तैयारी या इस फसल के लिए एक सूक्ष्म जगत वृद्धि सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल के लिए एक अग्रवाल स्थानापन्न की पहचान करने की कोशिश कर रहे हैं कि एआर.

एम. के विश्लेषण के लिए अन्य आमतौर पर इस्तेमाल के तरीकों के साथ यहाँ वर्णित विधि की तुलना में truncatula A17 / एस सहजीवन meliloti, हम इस एक साथ एस की एक बड़ी संख्या के सहजीवी प्रदर्शन की तुलना के लिए अब तक का सबसे अच्छा तरीका से हो पाया है उपभेदों meliloti. हम नियमित तौर पर एक समय में 250 लघु सेट अप (एस meliloti 25 पौधों प्रत्येक पर टीका के 10 अलग अलग उपभेदों.) जब एस के ही एक जीनोटाइप meliloti या एस medicae इस्तेमाल किया जा रहा है, और पार संदूषण एक जोखिम नहीं है, aeroponic caissons या विकास के पाउच एक अधिक उपयुक्त तरीका हो सकता है. यह प्लेट सूक्ष्म जगत विधि भी एक लंबी अवधि के खत्म गुत्थी विकास और सहजीवी उत्पादकता की प्रगति की आवधिक अवलोकन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका हैसमय. ऐसी गुत्थी वार्धक्य के रूप में सहजीवन के बाद के चरणों में प्रकट कि phenotypes, अन्य प्रोटोकॉल के साथ तुलना में इस विधि के साथ और अधिक आसानी से अध्ययन किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए ब्रायन के वॉशबर्न धन्यवाद एम जे के लिए 20,582 - यह काम यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य एवं कृषि संस्थान, कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल अनुदान 2,010-65,108 द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar purified, plant cell culture-tested Sigma A7921

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