Оценка Миогенный ответ и вазоактивности В Сопротивление брыжеечных артерий, используя миография давления

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Миография давления используется для оценки вазоактивности из мелких артерий, которые развиваются длительное сужение, когда под давлением. Эта рукопись содержит подробный протокол оценки в отдельных сегментах малого брыжеечных артерий от крыс, вазоактивности и влияния внутриполостной давление на сосудистой диаметре.

Cite this Article

Copy Citation

Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мелких артерий сопротивления сужают и расширяют, соответственно, в ответ на повышенной или пониженной внутрипросветный давление; Это явление известно как миогенного ответ является ключевым регулятором локального кровотока. В изобарических условиях мелкие артерии сопротивления развиваются устойчивый сужение известный как миогенной тон (МТ), который является основным фактором, определяющим системного сосудистого сопротивления (СВР). Следовательно, экс естественных условиях под давлением препараты мелких артерий сопротивления являются основными инструментами для изучения функции микрососудов в почти физиологических состояниях. Чтобы достичь этого, свежевыделенные нетронутыми сегмент малое сопротивление артерии (диаметр ~ 260 мкм) установлен на двух небольших стеклянных канюли и давлением. Эти препараты артериальных сохранить большинство в естественных характеристик и оценки разрешения сосудистого тонуса в режиме реального времени. Здесь мы предлагаем подробный протокол для оценки вазоактивности в небольших давлением сопротивление брыжеечных артерий от крыс; эти артерии развиваютсяустойчивый вазоконстрикции - примерно 25% от максимального диаметра - при обработке давлением при 70 мм рт. Эти препараты артериальных могут быть использованы для изучения влияния исследуемых соединений на отношения между внутри-артериального давления и вазоактивности и определить изменения в функции микрососудов в животных моделях различных заболеваний.

Introduction

Мелких артерий сопротивления являются основными факторами, определяющими СВР и играют важную роль в патофизиологии многих заболеваний 1,2. Условия такие, как диабет, беременность 3 4 ишемии 5, ожирение и гипертония 6,7 часто ассоциируется с измененной функции микрососудов. Сосудистая миография может не только обеспечить важную информацию в изменения функции микрососудов в различных заболеваний, но также поможет определить терапевтические цели и оценивать эффективность вазоактивных соединений. Сосудистая функция была изучена с использованием выделенных мелкие артерии в изометрических или изобарических условиях сосудов 8. Подробное описание изометрической миографии приводятся в других 9. Однако есть различия в данных, полученных от изометрической против изобарических препаратов 10-12. С давлением артериальные препараты позволяют исследование функции микрососудов в ближнем физиологических условиях,Полученные данные могут коррелировать с поведением в естественных условиях сосудистого русла 8,13 лучше.

В 1902 году Бейлиса впервые описал эффект трансмурального давления на сосудистую диаметром 14. Он отметил, в небольших артерий сопротивления от различных сосудистых руслах кроликов, кошек и собак, которые были затем снижение давления вазодилатация и повышение давления последовало вазоконстрикции. Это явление известно как миогенной ответ. Бейлиса и последующие исследователи отметили, что в условиях изобарических малое сопротивление артерий развивать устойчивый сужение известный как МТ 15,16. Оба миогенной ответ и МТ может быть оценены с помощью миография давление (ПМ) метод. PM используется в основном для определения вазоактивности малых артерий, вен и других судов. В дополнение к оценке влияния вазоактивных соединений на сосудистой диаметре, ЛС - как следует из названия - используется для оценки внутрисосудистого давления опосредованной чАнж на сосудистой диаметре. За последние несколько десятилетий прогресс в программном обеспечении компьютера, который улучшенной видео микроскопии и стеклянной пипетки вытягивать, сделали ПМ легче выполнять. Тем не менее, рассечение жизнеспособных неповрежденных сегментах мелких кровеносных сосудов остается утомительным, а иногда и сложной задачей. Здесь мы приводим подробный протокол для изучения миогенную ответ в небольших брыжеечных артерий сопротивления, выделенных из крыс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примеры, показанные здесь, из экспериментов, утвержденными IACUC в Грузии Риджентс университет - Протокола №: # 2011-0408

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка рассечение решение запас: Для 500 мл фондового рассечение раствора (5x), растворить 21,18 г NaCl, 0,875 г KCl, 0,739 г MgSO 4, 1,049 г швабры и 0,019 г ЭДТА в 450 мл Milli-Q воды. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 500 мл с Milli-Q воды. Исходный раствор может храниться до 7-10 дней. В таблице 1 приведен список химических веществ и их производителей. В таблице 2 концентрации в мм.
  2. Подготовить рабочий раствор рассечение Подготовка свежий раствор рабочий рассечение каждый день. Для 100 мл рабочего раствора, растворить 0,091 г глюкозы, 0,016 г NaH 2 PO 4 и 0,022 г пирувата натрия в 79,8 мл Milli-Q воды. Добавить 0,2 мл 1М CaCl 2 и 20 мл рассечение решение запас, чтобы принести võluмне 100 мл.
  3. Подготовка физиологический солевой раствор (PSS): Для того, чтобы подготовить 1000 мл PSS, растворяются 0,365 г KCl, NaCl 6,545 г, 0,296 г MgSO 4, 0,163 г KH 2 PO 4, 2.072 г глюкозы, 2.184 г NaHCO 3 и 2,383 г HEPES в 950 мл Милли-Q водой. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 1000 мл с Milli-Q воды. Удалите 2 мл раствора и заменить его с 2 мл 1 М CaCl 2. (Свежий PSS должен быть готов ежедневно)
  4. Подготовка кальция (Ca 2+) бесплатно PSS: Для 100 мл PSS без Ca 2+, растворить 0,036 г KCl, NaCl 0,654 г, 0,029 г MgSO 4, 0,016 г KH 2 PO 4, 0,207 г глюкозы, 0,218 г NaHCO 3 0,238 г HEPES, 0,015 г ЭГТА и 0,0026 г натрия нитропруссид (SNP) в 95 мл Milli-Q воды. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 100 мл с Milli-Q воды.

2. Подготовка стекла канюли

  1. Потяните стеклянных пипетокдля генерации 100-150 мкм наконечником канюли с помощью пипетки съемник как за производителя с руководящими принципами.
  2. Конические кончики стекло канюли, используя микроэлектродного Кромкорез, огонь полировать их и согнуть советы стекло канюли от ~ 45 ° при помощи нагревателя зонда.
  3. Загрузите канюли в держатель микропипетки и прикрепить держатель микропипетки на перфузии камеры.

3. Подготовка перфузии палаты

  1. Промыть перфузии камера с Milli-Q водой с последующим рассечение раствора в течение 5 мин каждый. Загрузите камеру с 2 мл рассечение решения.
  2. Всасывания рассечение решение через канюли, используя 10 мл шприц и заполнить внимательно весь канюли и прилагаемый трубки без каких-либо пузырьков. Применение всасывание осторожно, чтобы предотвратить образование пузырьков.
  3. Приготовьте два швов с пол-узла друг тупыми щипцами. Так глазных швов мононити нейлона (10-0, 0,2 метрической) используются для подготовки узлов, которые только1-2 мм в диаметре, рассечение микроскоп могут быть необходимы.
  4. Визуализация при вскрытии микроскопом, использовать рассечение пинцет, чтобы загрузить оба канюли с частично закрытыми шовных узлов немного далеко от кончика. Позже эти узлы будут скользнул тщательно на канюлированного артериальных концов и полностью закрыты.

4. Сбор брыжеечной артерии аркада от Спрэг Dawley крыс

  1. Ищите одобрение местных институциональных уходу и использованию комитета животных (IACUC) до проведения этих экспериментов. Дом животные вивария с контролируемой температурой и освещением и обеспечить свободный доступ к воде и коммерческой корм для грызунов.
  2. Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Подтвердите глубокого наркоза по схождения крайнем случае и, если необходимо администрировать дополнительные анестетиков.
  3. После подтверждения хирургической анестезии, эвтаназии животного путем обезглавливания. Следуйте AAALAC руководящие принципы для ИМПзующих соответствующие методы для эвтаназии животных.
  4. Используйте рассечение ножницами и щипцами для выполнения середине строки лапаротомии от таза к грудине. Это делается в два этапа: сначала, надрезать кожу и во-вторых, надрезать основной слой мышц. Уход должны быть приняты, чтобы не травмировать внутри брюшной полости.
  5. Вырезать проксимальный конец кишки близко к привратника и дистального конца вблизи подвздошно-слепой кишки перехода. Свяжите оба конца отдельно, чтобы предотвратить утечку химуса и фекалий, таким образом, избежать загрязнения внеклеточного раствора для купания. Надрезать брыжейки у ее основания около подачи сосудистой т.е. верхней брыжеечной артерии и передавать весь тонкого кишечника брыжеечной кровать в 50 мл химический стакан, содержащий охлажденному льдом раствору рассечение.
  6. Разрешить ПРОМЫСЛОВЫЕ ткани, чтобы остаться в ледяной решения рассечение в течение 5 мин и смойте свежим раствором рассечение, чтобы избавиться от крови.

5. Выделение и катетеризация 4-го

  1. Придавить проксимальный конец кишки на правой стороне в Sylgard покрытием блюдо. Продлить оставшуюся кишку в пути против часовой стрелки, прижимая сегмент вниз, чтобы распространить брыжейки и подвергая кровеносные сосуды (рисунок 1). Примечание: Мы изолировать артериальных сегментов при комнатной температуре. В противном случае мы размещаем брыжеечной аркады, содержащий блюдо на льду. Некоторые лаборатории, в том числе в нашем учреждении, использовать чиллеры рассекать артерии при 4 ° С.
  2. Под микроскопом стерео зум рассекать из 3-й и 4-го порядка мелких артерий брыжейки (~ 260 мкм) параллельно тонкой кишки с помощью небольших ножниц. Во-первых отсечь все сопроводительное жира. Затем рассекают из вены и артерии изоляции с V-образным точки ветвления. Будьте осторожны, чтобы не проколоть выбранный сегмент. Начните рассекает жир возле 2-го отделения заказа и найти путь к 3-й или 4-й Ordэр судов.
    1. Примечание: Артерии и вены можно отличить на основе их толщины стенки - артериальной стенки толще, чем вены годов. Более того, когда прилегающей соединительной ткани тянут мягко перпендикулярно к краху суда, в то время как вен легко артерии делать нет. Так артерий с диаметром просвета <400 мкм крупные сайты системного сосудистого сопротивления, для этого протокола мы использовали 4-й брыжеечных артерий порядок крыс (диаметра просвета <300 мкм).
  3. Изолировать 4-5 мм разрез параллельно артерии в в тонкую кишку. Представьте все 5 филиалов го порядка вложения в тонком кишечнике и сократить их немного в стороне от происхождения филиалов и сохранить часть. Эти сохранившиеся части ветвей служить проведение сайты (с рассечение пинцет) для передачи артериальных сегментов перфузии камеры, а впоследствии направлять их катетеризации.
  4. Затем вырежьте артериальных сегментов путем 2 разрезы дистальнее5-й ветки порядка на каждой стороне артерии и перенести его на камеру перфузии (рис 1С и легенды).
  5. Иглу один конец судна, на одном из стекла микропипетки (диаметром 100-150 мкм:) с использованием рассечение пинцет, держа кончики артериального сегмента с рассечение пинцет. Слайд предварительно загруженный частично закрытую шов на канюлированного конца и закрепите его. Примечание: проксимальный конец артерии может быть канюлю на стеклянную канюлю, который подключен к регулирования давления устройства с сервоуправлением, чтобы имитировать на месте среды.
  6. Приложить раствор рассечение загружен 10 мл шприц с краном, подключенного к этой канюли таким образом, что вскрытие раствор в трубке, соединяющей канюли и кран сливается с, что в шприце. Осторожно поднимите шприц. Сила тяжести на решение будет удалить интра сосудов кровь из открытого конца сосуда. После удаления внутриартериальный кровьЗакройте кран.
    Примечание: В качестве альтернативы, прикрепить кран с регулятором давления, включить его и плавно увеличивают давление до 5-10 мм рт.ст., чтобы достичь того же результата.
  7. Tie дистальный конец сосудов на второй стеклянной канюли тщательно чего другой канюли как можно ближе к несвязанной конце сегмента артерии. Слайд предварительно загруженный частично закрытую шов на канюлированного конца и закрепите его. Уход должны быть приняты не тащить или тянуть на артериальных сегментов. Убедитесь, что краны, прикрепленные к обеим канюли закрыты.
  8. Перевести перфузии камеру на стадии инвертированного микроскопа, оснащенного живой записи видео.
  9. Подключение кран канюли, привязанной к проксимальному концу сегмента артерии к регулирования давления устройства с сервоуправлением и убедитесь, что кран прикреплен к другой канюли остается закрытым, чтобы поддерживать стабильное давление в просвете.
  10. Далее, присоедините вакуумный шланг к всасывающему отверстию ай перфузии трубки к порту перфузии камеры.
    Примечание: Скошенные иглы порт используется для всасывания и тупой иглы для порта перфузии.
  11. Начало перфузии судна теплой PSS через один нагреватель встроенный раствора (37 ° С, уравновешивали газовой смеси: 5% СО 2, 5% O 2 и 90% N для поддержания нейтрального рН и адекватной оксигенации 17) в 2 мл / мин с использованием перистальтический насос. Поверните вакуум на, а также. Поставьте термистор в камере для мониторинга температуры непрерывно.
  12. Как температура PSS в камере приближается ~ 37 ° C (обычно в течение 5 мин), медленно увеличивать давление в просвете от 20 до 100 мм рт.ст. и проверить сосуды на герметичность. Это делается с помощью параметра автоматической давления регулятора давления. Откажитесь сосуды с утечкой и заменить другой сегмент. Сосуды с утечками не сможет провести давление.
  13. Оценка артериальной сегмент для колен, поддерживая давление на 100 мм рт.ст..Использование винтовой рычаг, переместите канюли выпрямить артериальное сегмент. Не более растянуть артериальных сегментов; цель, чтобы имитировать в естественных условиях длина артериального сегмента.
  14. Уменьшите давление до 70 мм рт.ст. (чтобы имитировать в естественных условиях давления в брыжеечной аркады 18) и позволяют артериального сегмента, чтобы стабилизировать и развивать миогенную тон. Артерии может находиться под давлением переменно (40-70 мм рт.ст.) в соответствии с экспериментальной стратегии и сосудистого русла. Ранее опубликована обзор дает отличный обзор изменчивости в МТ в артериальных сегментов из различных сосудистых 8 спальных мест.

6. Измерение артериального Диаметр

  1. Посмотреть артерии в 10 раз цель на микроскоп оснащен камерой монохромный видео прибор с зарядовой связью. Измерьте диаметр просвета с помощью захвата видеокадра и в режиме реального времени система обнаружения края. Перечень оборудования, используемого приведены в таблице 3.
  2. Мониторинг и запись судно гiameter непрерывно.
  3. Соблюдайте для развития МП. Примечание: Мы наблюдали, что у крыс брыжеечных артерий сопротивления, при 70 мм рт.ст., развитие МТ характеризуется ~ 20% уменьшением диаметра. МТ изменяется в соответствии с сосудистыми слоем и животных.
  4. Подтвердите сосудистой жизнеспособность по оценке сосудосуживающие и сосудорасширяющие ответов 1 мкМ фенилэфрина (Phe) и 1 мкМ ацетилхолина (АХ).
  5. В конце каждого эксперимента, определить пассивный диаметр (PD) путем инкубации в артерии Ca 2+ -бесплатно PSS в течение 20 мин.

7. Миогенный Ответ

  1. Снизить давление до 20 мм ртутного столба и позволяют диаметр стабилизироваться. Увеличение внутрипросветного давление поэтапно (20, 40, 60, 80 и 100) и на каждом шаге давления позволяют артерий для достижения стабильной диаметр (обычно в течение 5 мин).
  2. Уменьшите давление в просвете до 20 мм рт.ст. и инкубировать артериального сегмента в Ca 2+ -бесплатно PSS, содержащий 0,39 мМEGTA и 0,1 мМ SNP. Разрешить диаметр артерий для стабилизации (обычно 15 мин).
  3. Повторите давления шаг ответ в Ca 2+ -свободных PSS, содержащего 0,39 мМ EGTA и 0.1 мМ SNP.

8. Интерпретация результатов и расчет данных

  1. Рассчитайте MT, как разница процентов в диаметре, наблюдаемой для Ca 2+ -содержащего против Ca 2+ -бесплатно PSS на каждом давления в соответствии с следующим расчетом:
    Уравнение 1
  2. Для артерий, проходящих сосудодвигательная реакция диаметра может быть рассчитана путем усреднения фазы плато в течение 1 мин. Экспресс собранные данные в процентах от максимальной релаксации (% Pd) в соответствии с соотношением:% Pd = 100 х [ΔD / PD]; ΔD разница между диаметром до и после добавления любого исследуемого соединения (например, Phe); PD является пассивным диаметр (такжеМаксимальный диаметр).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематическое изображение миографа типичный давление настройке показано на рисунке 1. Два конца сосуда канюлируют со стеклянной микропипетки и закрепляется швами с обеих сторон. Через трубки и открытым краном, один канюли соединен с сервоуправлением регулятора давления; с другой канюли соединен с закрытой краном. Камера перфузию PSS и сосудистой диаметра изменений, наблюдаемых с помощью инвертированного микроскопа, соединенного с ПЗС-камерой.

Артериальное давление на сегмент 70 мм рт.ст. инкубируют в свежеприготовленного теплого PSS, который течет через артериальной камере при температуре 2-4 мл / мин и всасываемого из. Артериальная диаметр контролируется и записывается с помощью видеомикроскопии и обнаружения края программное обеспечение. После ~ 40 мин, артериальное сегменты сжимают спонтанно на 20-40% от их начальной диаметра (рис 2А). В наших руках артерий сопротивления небольшой крысы сужают на 25-30% (в среднем ВариES в соответствии с настройками, оператора, и артериального русла). Затем функциональный жизнеспособности оценивается сосудорасширяющих и сосудосуживающих реакций на АХ (1 мкМ) и Phe (1 мкМ), соответственно (Фигура 2А). В то время как могут быть использованы другие вазодилататоры, АХ индуцирует эндотелий-зависимую вазодилатацию и, таким образом, полезно при оценке эндотелиальных, а также сосудистой гладкой мышцы жизнеспособность. Впоследствии артериального сегмента повторно инкубировали в PSS и когда диаметр стабилизируется, он готов к эксперименту. В конце каждого эксперимента, артериальные сегменты инкубировали в Са 2+ свободный PSS для измерения PD (фиг.2В). Диаметры записанные на фиг.2А и приведены в фиг.2С. Абсолютная МТ разница между ПД и стабильной диаметром достигается при спонтанном вазоконстрикции в 70 мм рт. Следовательно, МТ наблюдается из трассировки, показанной на 33% ПД. Как видно здесь, ответ на АХ (1 мкм) GE nerally аналогичный наблюдаемому для Ca 2+ бесплатно PSS. Следует отметить, что в экспериментах, оценивающих вазодилатацию, предварительное добавление вазоконстриктора могут быть необходимы.

Чтобы определить миогенный реакцию, крысы брыжеечных артериальные сегменты подвергаются увеличению шаги внутрипросветного давления от 20 до 100 мм рт. Пример показан на фигуре 3А. Артерии могут достичь стабильного диаметр после каждого шага (~ 5 мин; пунктирные линии). Впоследствии, артериальная же сегмент подвергается давлению-ответ в Ca 2+ -бесплатно PSS с 0,39 мМ EGTA и 0.1 мм SNP (рис 3А). Диаметр достигнуто в конце каждого шага давления могут быть показаны в виде линейного графика (фиг.3В). МТ рассчитывается как Разница в диаметре процентов для Ca 2+ -содержащего против Ca 2+ -бесплатно PSS на каждом давления может быть показано как линия или гистограммы (рис 3C).

нт "FO: Keep-together.within-странице =" всегда "> Фигура 1
Рисунок 1: Иллюстрация миографа давление настройке () Основные компоненты указаны.. Таблицу 3 для списка всего оборудования. (Б) Собранные брыжеечной кровать возлагали на Sylgard покрытием блюдо показано. (С) мультфильм брыжеечные артерии аркады показано. Черные точки представляют контактов позиции. Пунктирная раздел представляет артериальной сегмент будет расчлененный. Маленькие зеленые полоски указывают на разрез сайты в артерии. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Рисунок 2: (А) Как показано в трассировки, диаметр мелких брыжеечных артерий у крыс, когда давление в 70 мм рт.ст., уменьшается спонтанно. Добавление АХ (1 мкМ) увеличили диаметр (почти до начала диаметре). Добавление Phe (1 мкМ), чтобы ткани ванны уменьшается артериальное диаметр. (B), инкубирование в Ca 2+ -бесплатно PSS увеличивает артериальное диаметр. (С) Диаметр одного артериального сегмента под давлением в различных perfusates показанных на А и В таблицу.

Рисунок 3
Рисунок 3: (А) Артериальное диаметр записываются последовательно во время повышения внутрипросветного давление постепенно в присутствии PSS и Ca 2+ -FreePSS. (Б) Линия кривой артериального диаметра, достигнутого на этапе каждая давления. (С) Гистограмма MT достигается при каждом шаге давления. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги, устранение неисправностей и модификации

В типичной изобарической подготовки сосуда, артерии давлением на 70 мм рт.ст. между двумя стеклянными канюли перфузии теплой (37 ° C) PSS. После 30-45 мин, артерии развивать MT, характеризуется спонтанным уменьшением диаметра, что стабилизирует в 20-30 мин. Сопротивление артерии от различных сосудистых бассейнах развивать переменной MT. Например сопротивления крыс брыжейки артерии развивать MT ~ 25% PD, в то время как cremastric артерии может достичь МТ ~ 40% PD. Артерии, которые не развиваются MT в течение 60 мин должны быть уничтожены; Эта длительность может варьироваться в зависимости от сосудистого русла и видов. Артерии с неадекватным ответом на Phe и АЧ также должны быть отброшены.

рН и температура PSS оказывают существенное влияние на развитие МТ. рН PSS, который сидит в течение длительных периодов без аэрации, может увеличить. Кроме того, при комнатной температуре в артерии вряд ли Develop МТ. Следовательно PSS должен быть газированные как можно быстрее с помощью газовой смеси, указанный в разделе протокола и температуры перфузионного камеры должны быть постоянно контролировать и выдерживают при ~ 37 ° C с использованием нагревателя потока.

Так как эти эксперименты 3-5 ч в продолжительности, перфузии камеры и связанные трубки подвергаются PSS в течение длительных периодов; соль-осадки могут накапливаться в обоих камеры и трубки, которые могут мешать последующих экспериментах. Отсюда важно тщательно мыть перфузии камеру и промыть трубки с деионизированной водой после каждого эксперимента. Точно так же, необходимо позаботиться, чтобы тщательно очистить Sylgard покрытием блюдо используется для вскрытия деионизированной водой после каждого вскрытия.

Ограничения

Несмотря на важность ЛС имеет различные ограничения. Во-первых, коллектив стоимость закупки оборудования вечера высокая (~ $ 22000) и может быть непомерно наверняка лаBS; Подробный список оборудования показано в таблице 3 Во-вторых, свежие сосуды необходимы для большинства экспериментов. следовательно, новое животное эвтаназии для каждого эксперимента, добавив к общей стоимости. В-третьих, вскрытие мелких артерий брыжейки утомительно и требует других инструментов, таких как рассечение микроскопа и микродиссекции инструментов, которые склонны к повреждениям. В-четвертых, есть кривая обучения; набирает опыт в создании и ТЧ в лаборатории требуется специальный персонал, время и усилия.

Значение по отношению к другим методам и будущих приложений

Изобарической и изометрические экспериментальные протоколы два основных подхода, используемые для определения сосудистую реактивность. В отличие от изобарических препаратов, вазоактивности в изометрических препаратов определяется путем измерения гладких мышцах сосудов напряжение с помощью системы проводной миографа. В дополнение к различиям в оборудовании, необходимых для этих двух экспериментальных протоколов, агонист-яnduced сокращение отличается среди этих экспериментальных подходов в отношении величины, времени цикла и направления сосудистой стенки напряженности 11,19. Из-за технических ограничений удобствами и оба препарата выполняют важные роли. Например, потому что это легче поддерживать микроскопическое внимание на изометрических препаратов, они часто используются для одновременного измерения реактивности сосудов и изменений в гладких мышцах сосудов Ca 2+. С другой стороны, миогенной деятельность лучше всего оценивать в герметичных препаратов, которые считаются имитировать физиологическое состояние в естественных условиях тесно. Подробный обзор различий между этими препаратами осуществляется ранее 19.

В заключение, миография давление надежная техника для изучения миогенную ответ в мелких сосудах сопротивления при почти физиологических условиях. Несмотря на свои ограничения, премьер уже внес значительный вклад в понимание изменений всосудистая функция в нормальных и патологических условиях 3-7,20-23. Регулирование системного сосудистого тонуса является весьма сложным и включает в себя местные и нейро-гормональные факторы, следовательно, отделители роль конкретных механизмов, регулирующих тонус сосудов мест в естественных условиях очень трудно. В связи с этим, экс виво давлением артериальные препараты служат превосходными суррогаты. Те, кто заинтересован в трансдукции механизмов МТ и миогенной ответ называют ранее опубликованных отличные отзывы 15,19. В будущем мы можем увидеть прогресс в интеграции оборудования, оценку миогенной ответ и изменений в последующих посланников, такие как Ca 2+, хотя это очень маловероятно, что мы хотели бы видеть снижение затрат на оборудование. Однако, как эта техника, принятая учеными с различной фоне, мы, вероятно, увидеть его применение для оценки изменения функции микрососудов при заболеваниях, кроме гипертонии, сахарного диабета и шока, такие как цирроз печени, DEmentia т.д.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов.

Acknowledgements

Сандип Хурана поддерживается NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda поддерживается (T32DK067872).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
  2. Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
  3. Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
  4. Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
  5. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
  6. Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
  7. Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
  8. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
  9. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. (2011).
  10. Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
  11. Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  12. Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
  13. Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
  14. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
  15. Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
  16. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  17. Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
  18. Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488, (Pt 3), 753-760 (1995).
  19. Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
  20. Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
  21. Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
  22. Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
  23. Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats