दबाव Myography का प्रयोग प्रतिरोध mesenteric धमनियों में myogenic रिस्पांस और Vasoactivity का आकलन

1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University
Published 7/06/2015
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Medicine

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Summary

दबाव myography दबाव जब निरंतर कसना है कि विकसित छोटी धमनियों की vasoactivity का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पांडुलिपि चूहे, vasoactivity और नाड़ी व्यास पर intraluminal दबाव के प्रभाव से छोटे mesenteric धमनियों के अलग खंडों में आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J. Vis. Exp. (101), e50997, doi:10.3791/50997 (2015).

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Abstract

छोटे प्रतिरोध धमनियों कसना और वृद्धि या intraluminal दबाव में कमी आई के जवाब में क्रमशः चौड़ा करना; myogenic प्रतिक्रिया के रूप में जाना जाता है इस घटना स्थानीय रक्त प्रवाह की एक प्रमुख नियामक है। समदाब रेखीय परिस्थितियों में छोटे प्रतिरोध धमनियों प्रणालीगत संवहनी प्रतिरोध (आर) के एक प्रमुख निर्धारक है जो myogenic टोन (एमटी), के रूप में जाना कसना निरंतर विकास। इसलिए, छोटे प्रतिरोध धमनियों की पूर्व vivo दबाव तैयारियों के पास शारीरिक राज्यों में microvascular समारोह का अध्ययन करने के लिए प्रमुख साधन है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक छोटे से प्रतिरोध धमनी (व्यास ~ 260 माइक्रोन) के एक हौसले से अलग बरकरार खंड दो छोटे गिलास cannulas और दबाव पर मुहिम शुरू की है। इन धमनियों की तैयारियों विवो विशेषताओं और वास्तविक समय में संवहनी स्वर का परमिट मूल्यांकन में सबसे बरकरार रहती है। यहाँ हम चूहों से दबाव छोटे प्रतिरोध mesenteric धमनियों में vasoactivity का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं; इन धमनियों का विकासनिरंतर वाहिकासंकीर्णन - अधिक से अधिक व्यास का लगभग 25% - 70 एमएमएचजी पर दबाव है। इन धमनियों की तैयारी के विभिन्न रोगों के पशु मॉडल में microvascular समारोह में परिवर्तन इंट्रा-धमनी दबाव और vasoactivity के बीच संबंधों पर अनुसंधानात्मक यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने और निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

छोटे प्रतिरोध धमनियों आर के प्रमुख निर्धारक हैं और कई बीमारियों 1,2 के pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस तरह के मधुमेह 3, गर्भावस्था 4, ischemia-reperfusion 5, मोटापा और उच्च रक्तचाप 6,7 के रूप में स्थितियां अक्सर बदल माइक्रोवैस्कुलर समारोह के साथ जुड़े रहे हैं। संवहनी myography विभिन्न रोगों में microvascular समारोह में परिवर्तन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान में मदद मिलेगी और vasoactive यौगिकों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन कर सकते हैं न केवल। नाड़ी समारोह सममितीय या समदाब रेखीय पोत शर्तों 8 के तहत पृथक छोटी धमनियों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। Isometric myography का विस्तृत विवरण कहीं और 9 प्रदान की जाती है। हालांकि समदाब रेखीय तैयारियों 10-12 बनाम सममितीय से प्राप्त आंकड़ों में मतभेद हैं। दबाव धमनी की तैयारी के पास शारीरिक स्थितियों में microvascular समारोह के अध्ययन की अनुमति देने के बाद से,प्राप्त निष्कर्षों संवहनी बिस्तर 8,13 के vivo व्यवहार के साथ बेहतर सहसंबंधी सकता है।

1902 में Bayliss पहले संवहनी व्यास 14 पर transmural दबाव के प्रभाव का वर्णन किया। उन्होंने कहा कि दबाव में कमी वाहिकाप्रसरण द्वारा पीछा किया गया था कि खरगोश, बिल्लियों और कुत्तों के विभिन्न संवहनी बेड से छोटे प्रतिरोध धमनियों में मनाया, और दबाव में वृद्धि वाहिकासंकीर्णन द्वारा पीछा किया गया था। इस घटना myogenic प्रतिक्रिया के रूप में जाना जाता है। Bayliss और बाद में जांचकर्ताओं समदाब रेखीय परिस्थितियों में छोटे प्रतिरोध धमनियों मीट्रिक टन 15,16 के रूप में जाना निरंतर कसना है कि विकास मनाया। Myogenic प्रतिक्रिया और मीट्रिक टन दोनों दबाव myography (प्रधानमंत्री) तकनीक का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रधानमंत्री छोटी धमनियों, नसों और अन्य जहाजों की vasoactivity निर्धारित करने के लिए मुख्य रूप से प्रयोग किया जाता है। नाम इंगित करता है - - संवहनी व्यास पर vasoactive यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इसके अलावा, प्रधानमंत्री intravascular दबाव की मध्यस्थता चर्चा का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैसंवहनी व्यास पर anges। पिछले कुछ दशकों में वीडियो माइक्रोस्कोपी और कांच पिपेट, प्रधानमंत्री प्रदर्शन करने के लिए आसान बना दिया है खींच बढ़ाया जो कंप्यूटर सॉफ्टवेयर, में अग्रिम। हालांकि, छोटे रक्त वाहिकाओं के व्यवहार्य बरकरार क्षेत्रों के विच्छेदन कठिन और कभी कभी चुनौती बनी हुई है। यहाँ हम चूहों से अलग छोटे mesenteric प्रतिरोध धमनियों में myogenic प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार।

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Protocol

यहाँ दिखाए गए उदाहरण जॉर्जिया राज्य प्रतिनिधियों विश्वविद्यालय में IACUC द्वारा मंजूरी दे दी प्रयोगों से कर रहे हैं - प्रोटोकॉल नहीं: # 2011-0408

अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. विच्छेदन समाधान स्टॉक तैयार: शेयर विच्छेदन समाधान (5x) के 500 एमएल के लिए, 21.18 छ NaCl, 0.875 छ KCl, 0.739 छ MgSO 4, 1.049 छ mops और मिल्ली क्यू पानी की 450 मिलीलीटर में 0.019 छ EDTA के भंग। 1 एन NaOH का उपयोग कर 7.3-7.4 पीएच को समायोजित करें। मिल्ली क्यू पानी के साथ 500 मिलीलीटर मात्रा अप करें। स्टॉक समाधान 7-10 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। रसायन और उनके विक्रेताओं की एक सूची के लिए 1 टेबल देखें। मिमी में एकाग्रता के लिए 2 तालिका देखें।
  2. काम कर विच्छेदन समाधान तैयार: हर दिन नए सिरे से काम कर विच्छेदन समाधान तैयार है। 100 मिलीलीटर काम कर समाधान के लिए, 0.091 छ ग्लूकोज, मिल्ली क्यू पानी की 79.8 मिलीलीटर में 0.016 जी नाह 2 पीओ 4 और 0.022 ग्राम सोडियम पाइरूवेट भंग। Volu लाने के लिए 0.2 मिलीलीटर 1M 2 CaCl और 20 मिलीलीटर विच्छेदन समाधान शेयर जोड़ें100 मिलीलीटर के लिए मुझे।
  3. शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) तैयार: 950 मिलीलीटर में, 1000 मिलीलीटर पीएसएस तैयार करने के लिए 0.365 जी KCl, 6.545 छ NaCl, 0.296 छ MgSO 4, 0.163 छ के.एच. 2 पीओ 4 भंग, 2.072 छ ग्लूकोज, 2.184 छ 3 NaHCO और 2.383 जी HEPES मिल्ली क्यू पानी की। 1 एन NaOH का उपयोग कर 7.3-7.4 पीएच को समायोजित करें। मिल्ली क्यू पानी के साथ 1,000 मिलीलीटर मात्रा अप करें। समाधान के 2 मिलीलीटर निकालें और 1 एम 2 CaCl के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें। (ताजा पीएसएस दैनिक तैयार रहने की जरूरत है)
  4. , सीए 2 + बिना 100 मिलीलीटर पीएसएस के लिए 0.036 जी KCl, 0.654 छ NaCl, 0.029 छ MgSO 4, 0.016 छ के.एच. 2 पीओ 4, 0.207 छ ग्लूकोज, 0.218 छ 3 NaHCO, 0.238 भंग: कैल्शियम (सीए 2 +) मुफ्त पीएसएस की तैयारी जी HEPES, 0.015 छ EGTA और 0.0026 ग्राम सोडियम nitroprusside (एसएनपी) मिल्ली क्यू पानी की 95 मिलीलीटर में। 1 एन NaOH का उपयोग कर 7.3-7.4 पीएच को समायोजित करें। मिल्ली क्यू पानी के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा अप करें।

ग्लास Cannulas की 2. तैयारी

  1. कांच pipettes खींचोनिर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार एक विंदुक खींचने का उपयोग 100-150 माइक्रोन इत्तला दे दी cannulas उत्पन्न करने के लिए।
  2. बेवल एक microelectrode beveller का उपयोग कर गिलास प्रवेशनी टिप्स, आग उन्हें पॉलिश और एक हीटर जांच का उपयोग ~ 45 डिग्री से गिलास प्रवेशनी सुझावों मोड़।
  3. Micropipette धारक में cannulas लोड और छिड़काव चैम्बर पर micropipette धारक देते हैं।

छिड़काव कक्ष 3. तैयारी

  1. 5 मिनट प्रत्येक के लिए विच्छेदन समाधान द्वारा पीछा मिल्ली क्यू पानी से कुल्ला छिड़काव चैम्बर। विच्छेदन समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ चैम्बर लोड करें।
  2. प्रवेशनी के माध्यम से सक्शन विच्छेदन समाधान 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर और ध्यान से किसी भी बुलबुले के बिना पूरे प्रवेशनी और संलग्न ट्यूबिंग भरें। बुलबुले की पीढ़ी को रोकने के लिए धीरे चूषण लागू करें।
  3. प्रत्येक कुंद संदंश का उपयोग कर एक आधा-गाँठ के साथ दो टांके तैयार करें। नेत्र monofilament नायलॉन टांके के बाद से (10-0, 0.2 मीट्रिक) ही कर रहे हैं कि समुद्री मील तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंव्यास में 1-2 मिमी, विच्छेदन माइक्रोस्कोप की जरूरत हो सकती है।
  4. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे Visualizing, थोड़ा दूर सिरे से आंशिक रूप से बंद सिवनी गांठ के साथ दोनों cannulas लोड करने के लिए विच्छेदन संदंश का उपयोग करें। बाद में इन समुद्री मील cannulated धमनी समाप्त होता है पर ध्यान से खिसक कर दिया जाएगा और पूरी तरह से बंद कर दिया।

Sprague-Dawley चूहों से Mesenteric धमनी आर्केड 4. संग्रह

  1. इन प्रयोगों का आयोजन करने से पहले स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की मंजूरी लेने। नियंत्रित तापमान और प्रकाश व्यवस्था और पानी के लिए मुफ्त का उपयोग की अनुमति है और एक वाणिज्यिक कृंतक चाउ के साथ जानवरों की सुविधा में घर पशुओं।
  2. Intraperitoneal ketamine का इंजेक्शन (80 मिग्रा / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) ने चूहों anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा और जरूरत प्रशासन अतिरिक्त एनेस्थेटिक्स अगर गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  3. शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण की पुष्टि के बाद, कत्ल के द्वारा पशु euthanize। यूटीआई के लिए AAALAC दिशानिर्देशों का पालन करेंपशु इच्छामृत्यु के लिए उचित तरीके lizing।
  4. उरोस्थि को श्रोणि से एक मध्य रेखा laparotomy प्रदर्शन करने के लिए एक विच्छेदन कैंची और एक संदंश का प्रयोग करें। यह दो चरणों में किया जाता है: पहला, त्वचा काटकर अलग कर देना और दूसरा, अंतर्निहित मांसपेशियों परत काटकर अलग कर देना। केयर अंतर पेट अंगों घायल नहीं लिया जाना चाहिए।
  5. जठरनिर्गम को आंत करीब है और ileo-cecal जंक्शन के करीब बाहर का अंत के समीपस्थ अंत कट। दोनों काइम और इस प्रकार बाह्य स्नान समाधान के प्रदूषण से बचने के मल के रिसाव को रोकने के लिए अलग से समाप्त होता है बाँधो। खिला वैसक्यूलेचर यानी, बेहतर mesenteric धमनी के पास इसके आधार पर अन्त्रपेशी काटकर अलग कर देना और ठंडा विच्छेदन समाधान युक्त एक 50 मिलीलीटर बीकर करने के लिए पूरे छोटी आंतों mesenteric बिस्तर हस्तांतरण।
  6. काटा ऊतक 5 मिनट के लिए बर्फ का ठंडा विच्छेदन समाधान में रहने के लिए और खून से छुटकारा पाने के लिए ताजा विच्छेदन समाधान के साथ कुल्ला करने की अनुमति दें।

5. अलगाव और 4 वें के केन्युलेशन

  1. एक Sylgard लेपित पकवान में दाहिने हाथ की ओर आंत के समीपस्थ अंत नीचे पिन। (चित्रा 1) अन्त्रपेशी प्रसार करने के लिए नीचे खंड लगाए और रक्त वाहिकाओं को प्रकाश में लाने, एक काउंटर दक्षिणावर्त पथ में शेष आंत बढ़ाएँ। नोट: हम कमरे के तापमान पर धमनी खंडों को अलग। अन्यथा हम बर्फ पर पकवान युक्त mesenteric आर्केड जगह है। हमारी संस्था में उन सहित कुछ प्रयोगशालाओं, 4 डिग्री सेल्सियस पर धमनियों काटना चिलर इकाइयों का उपयोग करें।
  2. एक स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप के तहत आदेश छोटा mesenteric धमनियों वें 3 और 4 छोटे कैंची का उपयोग कर छोटी आंत के लिए (~ 260 माइक्रोन) समानांतर बाहर काटना। सबसे पहले सभी को कवर वसा दूर काटना। फिर नस काटना और वी के आकार शाखा बिंदु के साथ धमनी अलग। चयनित खंड पंचर करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। एक 2 एन डी क्रम शाखा के पास वसा विदारक शुरू करो और 3 या 4 वें ORD के लिए रास्ता खोजनेएर वाहिकाओं।
    1. नोट: धमनियों और नसों उनकी दीवार मोटाई के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है - धमनियों की दीवार नस की तुलना में मोटा है। इसके अलावा, संयोजी ऊतक सटे जब धमनियों नहीं कर आसानी से समय बर्तन, नसों पतन के लिए धीरे सीधा खींच लिया है। लुमेन व्यास के साथ धमनियों के बाद से <400 माइक्रोन हम (व्यास <300 माइक्रोन लुमेन) आदेश चूहे mesenteric धमनियों वें 4 का इस्तेमाल किया इस प्रोटोकॉल के लिए प्रणालीगत संवहनी प्रतिरोध के प्रमुख स्थलों, कर रहे हैं।
  3. छोटी आंत को धमनी समानांतर के 4-5 मिमी अनुभाग अलग। छोटी आंत में embedding सभी 5 वें क्रम शाखाओं कल्पना और थोड़ा दूर शाखाओं की उत्पत्ति से उन्हें काटा और एक हिस्से को रक्षा करता है। शाखाओं के इन संरक्षित अंश बाद में उनके केन्युलेशन गाइड, एक छिड़काव चैम्बर के लिए धमनी खंडों में परिवर्तित करने के लिए (विच्छेदन संदंश के साथ) साइटों पकड़े और के रूप में सेवा करते हैं।
  4. फिर करने के लिए 2 चीरों बाहर का बनाकर धमनी खंडों में कटौती5 वें क्रम धमनी के प्रत्येक पक्ष पर शाखाओं और छिड़काव चैम्बर को हस्तांतरण (चित्रा 1C और कथा देखें)।
  5. (: 100-150 माइक्रोन व्यास) विच्छेदन संदंश के साथ धमनी खंड के सुझावों धारण करके विच्छेदन संदंश का उपयोग कांच micropipette में से एक पर जहाजों में से एक अंत cannulate। Cannulated अंत पर पहले से भरी हुई आंशिक रूप से बंद सिवनी स्लाइड और यह सुरक्षित है। नोट: धमनी के समीपस्थ अंत सीटू के माहौल में नकल करने के लिए सहायक नियंत्रित दबाव विनियमन डिवाइस से जुड़ा है कि कांच प्रवेशनी पर cannulated जा सकता है।
  6. एक विच्छेदन समाधान प्रवेशनी और पानी निकलने की टोंटी को जोड़ने ट्यूबिंग में विच्छेदन समाधान सिरिंज में उस के साथ विलीन हो जाती है कि इस तरह के इस प्रवेशनी से जुड़ा पानी निकलने की टोंटी को 10 मिलीलीटर सिरिंज लोड कर देते हैं। धीरे सिरिंज बढ़ा। समाधान पर गुरुत्वाकर्षण बल पोत के खुले अंत से इंट्रा संवहनी खून निकाल देंगे। इंट्रा-रक्त धमनियों को हटाने के बाद, पानी निकलने की टोंटी बंद कर दें।
    वैकल्पिक रूप से, दबाव नियंत्रक से पानी निकलने की टोंटी देते हैं यह मोड़ पर है और धीरे ही परिणाम प्राप्त करने के लिए 5-10 एमएम एचजी करने के लिए दबाव बढ़ाने के लिए: ध्यान दें।
  7. ध्यान से धमनी खंड के खुल अंत करने के लिए संभव के रूप में बंद अन्य प्रवेशनी लाकर एक दूसरा गिलास प्रवेशनी पर जहाजों के बाहर का अंत टाई। Cannulated अंत पर पहले से भरी हुई आंशिक रूप से बंद सिवनी स्लाइड और यह सुरक्षित है। केयर tug या धमनी खंडों पर पुल नहीं लिया जाना चाहिए। दोनों cannulas से जुड़ी stopcocks बंद हो जाती हैं कि सुनिश्चित करें।
  8. लाइव वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ सुसज्जित औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर छिड़काव चैम्बर स्थानांतरण।
  9. एक सहायक नियंत्रित दबाव विनियमन डिवाइस के लिए धमनी खंड के समीपस्थ अंत करने के लिए बंधे प्रवेशनी का पानी निकलने की टोंटी कनेक्ट और स्थिर intraluminal दबाव बनाए रखने के लिए बंद रहता है पानी निकलने की टोंटी अन्य प्रवेशनी से जुड़ी है सुनिश्चित करें।
  10. अगला, चूषण बंदरगाह एक वैक्यूम करने के लिए ट्यूबिंग देते हैंएन डी छिड़काव चैम्बर के छिड़काव बंदरगाह के लिए ट्यूबिंग।
    नोट: Beveled सुई बंदरगाह छिड़काव के लिए सक्शन और कुंद सुई बंदरगाह के लिए प्रयोग किया जाता है।
  11. एकल इनलाइन समाधान हीटर के माध्यम से गर्म पी एस एस के साथ पोत का छिड़काव प्रारंभ (37 डिग्री सेल्सियस, गैस मिश्रण के साथ equilibrated: तटस्थ पीएच और पर्याप्त ऑक्सीजन 17 बनाए रखने के लिए 5% सीओ 2, 5% 2 हे और 90% एन) 2 मिलीलीटर में उपयोग करते हुए / मिनट एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप। के रूप में अच्छी तरह पर वैक्यूम कर दें। लगातार तापमान पर नजर रखने के लिए कक्ष में एक thermistor रखें।
  12. कक्ष में पी एस एस के तापमान nears के रूप में ~ 37 डिग्री सेल्सियस (आमतौर पर 5 मिनट के भीतर), धीरे-धीरे 20 से 100 एमएमएचजी से intraluminal दबाव बढ़ाने के लिए और लीक के लिए जहाजों की जाँच करें। इस दबाव नियामक का स्वत: दबाव सेटिंग का उपयोग किया जाता है। रिसाव के साथ जहाजों त्यागें और एक अन्य वर्ग के साथ की जगह। लीक के साथ जहाजों दबाव आयोजित करने में सक्षम नहीं होगा।
  13. 100 एमएमएचजी पर दबाव बनाए रखते हुए झुकता के लिए धमनी खंड का आकलन करें।पेंच लीवर का प्रयोग, धमनी खंड सीधा करने के लिए प्रवेशनी चाल है। अधिक धमनी खंडों खिंचाव नहीं है; लक्ष्य विवो धमनी खंड लंबाई में नकल करने के लिए है।
  14. 70 एमएमएचजी करने के लिए दबाव कम (mesenteric आर्केड 18 में विवो दबाव में नकल करने के लिए) और धमनी खंड को स्थिर करने और myogenic स्वर विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। धमनियों (40-70 एमएमएचजी) प्रयोगात्मक रणनीति और संवहनी बिस्तर के अनुसार अस्थायित्व से दबाव हो सकता है। एक पहले प्रकाशित की समीक्षा के विभिन्न संवहनी बेड 8 से धमनी क्षेत्रों में मीट्रिक टन में परिवर्तनशीलता का एक उत्कृष्ट समीक्षा प्रदान करता है।

धमनी व्यास 6. मापन

  1. एक मोनोक्रोम वीडियो आरोप डिवाइस युग्मित कैमरे से लैस एक खुर्दबीन पर 10X उद्देश्य पर देखें धमनियों। वीडियो फ्रेम धरनेवाला और वास्तविक समय में बढ़त का पता लगाने प्रणाली का उपयोग कर luminal व्यास उपाय। इस्तेमाल किया उपकरणों की एक सूची तालिका 3 में प्रदान की जाती है।
  2. मॉनिटर और रिकार्ड पोत घलगातार iameter।
  3. मीट्रिक टन के विकास के लिए ध्यान से देखें। नोट: हम चूहे mesenteric प्रतिरोध धमनियों में, 70 एमएमएचजी पर, मीट्रिक टन के विकास के व्यास में 20% कमी ~ की विशेषता है कि मनाया। मीट्रिक टन संवहनी बिस्तर और जानवरों की प्रजातियों के अनुसार बदलता रहता है।
  4. 1 माइक्रोन phenylephrine (Phe) और 1 माइक्रोन एसीटाइलकोलीन (ACH) को vasoconstrictor और वाहिकाविस्फारक प्रतिक्रियाओं का आकलन करने से नाड़ी व्यवहार्यता की पुष्टि करें।
  5. प्रत्येक प्रयोग के अंत में, 20 मिनट के लिए मुक्त पीएसएस सीए 2 + में धमनियों incubating द्वारा निष्क्रिय व्यास (पीडी) निर्धारित करते हैं।

7. myogenic रिस्पांस

  1. 20 एमएम एचजी करने के दबाव को कम करने और व्यास को स्थिर करने की अनुमति देते हैं। वृद्धिशील कदम (20, 40, 60, 80 और 100) में intraluminal दबाव बढ़ाने के लिए और प्रत्येक दबाव कदम पर धमनियों (आमतौर पर 5 मिनट के भीतर) एक स्थिर व्यास प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. 20 एमएमएचजी को intraluminal दबाव में कमी और 2 + मुक्त पीएसएस 0.39 मिमी युक्त CA में धमनी खंड सेतेEGTA और 0.1 मिमी एसएनपी। धमनी व्यास (आमतौर पर 15 मिनट) को स्थिर करने की अनुमति दें।
  3. 0.39 मिमी EGTA और 0.1 मिमी एसएनपी युक्त सीए 2 + मुक्त पीएसएस में दबाव के कदम की प्रतिक्रिया को दोहराएँ।

डाटा के परिणामों और गणना की 8. व्याख्या

  1. सीए 2 + के लिए मनाया व्यास में प्रतिशत के अंतर को निम्नलिखित गणना के अनुसार प्रत्येक दबाव में 2 + मुक्त पीएसएस सीए बनाम युक्त रूप मीट्रिक टन की गणना:
    1 समीकरण
  2. व्यास vasomotion के दौर से गुजर धमनियों के लिए 1 मिनट के लिए पठार चरण के औसत से गणना की जा सकती है। रिश्ते के अनुसार अधिक से अधिक छूट (% पीडी) के प्रतिशत के रूप में एकत्र डेटा एक्सप्रेस:% पीडी = 100 एक्स [ΔD / पीडी]; ΔD से पहले और किसी भी अनुसंधानात्मक यौगिक (जैसे Phe) के अलावा के बाद व्यास के बीच का अंतर है; पीडी भी निष्क्रिय व्यास (हैअधिक से अधिक व्यास)।

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Representative Results

एक ठेठ दबाव myograph सेट-अप की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1 में दिखाया गया है। पोत के दोनों सिरों को एक गिलास micropipette के साथ cannulated और दोनों पक्षों पर टांके के साथ सुरक्षित हैं। ट्यूबिंग और एक खुले पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से, एक प्रवेशनी एक सहायक नियंत्रित दबाव नियामक से जुड़ा है; अन्य प्रवेशनी एक बंद पानी निकलने की टोंटी से जुड़ा है। चैम्बर एक सीसीडी कैमरे से जुड़ा एक औंधा माइक्रोस्कोप के द्वारा मनाया जाता है पीएसएस और नाड़ी व्यास परिवर्तन के साथ perfused है।

70 एमएमएचजी पर दबाव धमनी खंड 2-4 मिलीग्राम / मिनट पर धमनी कक्ष के माध्यम से बहती है और बाहर suctioned जो हौसले से तैयार गर्म पीएसएस में incubated है। धमनी व्यास नजर रखी और videomicroscopy और बढ़त का पता लगाने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज की गई है। ~ 40 मिनट के बाद, धमनी खंडों उनकी प्रारंभिक व्यास (2A चित्रा) के 20-40% से अनायास कसना। हमारे हाथ में छोटा सा चूहा प्रतिरोध धमनियों में 25-30% (औसत vari के द्वारा कसनातों सेटिंग्स, ऑपरेटर, और धमनी बिस्तर के अनुसार)। फिर, कार्यात्मक व्यवहार्यता ach (1 माइक्रोन) और Phe (1 माइक्रोन), क्रमशः (2A चित्रा) के लिए vasodilator है और vasoconstrictor प्रतिक्रियाओं द्वारा मूल्यांकन किया है। अन्य vasodilators के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ach अन्तःचूचुक निर्भर वाहिकाप्रसरण लाती है और इस प्रकार दोनों एन्दोथेलिअल के साथ-साथ संवहनी चिकनी पेशी व्यवहार्यता का आकलन करने में उपयोगी है। इसके बाद धमनी खंड पीएसएस में फिर से incubated और व्यास स्थिर है, एक बार यह प्रयोग के लिए तैयार है। प्रत्येक प्रयोग के अंत में, धमनी खंडों पीडी (चित्रा 2 बी) को मापने के लिए सीए 2 + मुक्त पीएसएस में incubated हैं। 2A चित्रा और 2 बी में दर्ज व्यास चित्रा -2 में सारणीबद्ध रहे हैं। निरपेक्ष मीट्रिक टन पीडी और 70 एमएमएचजी पर सहज वाहिकासंकीर्णन पर हासिल स्थिर व्यास के बीच का अंतर है। इसलिए, दिखाया ट्रेसिंग से मनाया मीट्रिक टन पीडी का 33% है। यहाँ देखा के रूप में, ach (1 माइक्रोन) के जवाब जीई है सीए 2 + मुक्त पीएसएस के लिए मनाया कि करने के लिए nerally इसी तरह की। वाहिकाप्रसरण का आकलन करने के प्रयोगों में, एक vasoconstrictor की पूर्व अलावा जरूरत हो सकती है कि ध्यान दें।

Myogenic प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए, चूहे mesenteric धमनी खंडों में 20 और 100 एमएमएचजी के बीच intraluminal दबाव चरणों में वृद्धि के अधीन हैं। एक उदाहरण चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। धमनियों हर कदम (; धराशायी लाइनों ~ 5 मिनट) के बाद एक स्थिर व्यास प्राप्त करने के लिए अनुमति दी जाती है। बाद में, एक ही धमनी खंड 0.39 मिमी EGTA और 0.1 मिमी एसएनपी (चित्रा 3) के साथ मुक्त पीएसएस सीए 2 + में दबाव प्रतिक्रिया के अधीन है। प्रत्येक दबाव कदम के अंत में हासिल व्यास एक पंक्ति ग्राफ (3B चित्रा) के रूप में दिखाया जा सकता है। मीट्रिक टन के रूप में गणना कैरियर के लिए व्यास में प्रतिशत के अंतर को 2 + युक्त सीए बनाम प्रत्येक दबाव में 2 + मुक्त पीएसएस लाइन या बार ग्राफ (चित्रा -3 सी) के रूप में दिखाया जा सकता है।

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चित्रा 1: दबाव myograph सेट-अप का एक उदाहरण (ए) के प्रमुख घटक संकेत कर रहे हैं।। सभी उपकरणों की एक सूची के लिए 3 टेबल देखें। एक Sylgard लेपित पकवान पर टिकी (बी) काटा mesenteric बिस्तर दिखाया गया है। Mesenteric धमनी आर्केड (सी) एक कार्टून में दिखाया गया है। काले बिंदु पिन पदों का प्रतिनिधित्व करते हैं। धराशायी खंड विच्छेदित किए जाने की एक धमनी खंड का प्रतिनिधित्व करता है। छोटे हरे सलाखों के धमनी पर चीरा साइटों से संकेत मिलता है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें

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चित्रा 2: 70 एमएमएचजी पर दबाव जब (ए) अनुरेखण द्वारा संकेत दिया है, चूहों से छोटे mesenteric धमनियों के व्यास, अनायास घट जाती है। Ach (1 माइक्रोन) के अलावा (के पास से शुरू व्यास के लिए) व्यास में वृद्धि हुई। ऊतक स्नान करने के लिए Phe (1 माइक्रोन) के अलावा धमनी व्यास कम हो जाती है। सीए 2 + (ख) ऊष्मायन मुक्त पीएसएस धमनी व्यास बढ़ जाती है। (सी) विभिन्न ए में दिखाया गया perfusates और बी में एक भी दबाव धमनी खंड के व्यास सारणीबद्ध है।

चित्र तीन
चित्रा 3: पी एस एस की उपस्थिति और सीए 2 + मुक्त में संवर्द्धित intraluminal दबाव बढ़ाते हुए (ए) धमनी व्यास लगातार दर्ज की गई हैपी एस एस। प्रत्येक दबाव कदम पर हासिल की धमनी व्यास (बी) रेखा वक्र। मीट्रिक टन (सी) बार ग्राफ प्रत्येक दबाव कदम पर हासिल की। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

महत्वपूर्ण कदम, समस्या निवारण और संशोधनों

एक ठेठ समदाब रेखीय पोत तैयार करने में, धमनी गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीएसएस के साथ perfused दो गिलास cannulas के बीच 70 एमएमएचजी पर दबाव है। 30-45 मिनट के बाद, धमनियों 20-30 मिनट में है कि स्थिर व्यास में सहज कमी की विशेषता है, मीट्रिक टन का विकास। विभिन्न संवहनी बेड से प्रतिरोध धमनियों चर मीट्रिक टन का विकास। Cremastric धमनियों पीडी के मीट्रिक टन ~ 40% को प्राप्त हो सकता है, जबकि उदाहरण चूहे प्रतिरोध के लिए mesenteric धमनियों, ~ पीडी के 25% मीट्रिक टन का विकास। 60 मिनट के भीतर मीट्रिक टन विकसित नहीं है कि धमनियों को खारिज किया जाना चाहिए; इस अवधि संवहनी बिस्तर और प्रजातियों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। अपर्याप्त प्रतिक्रिया के साथ धमनियों पीएचई के लिए और ach भी खारिज किया जाना चाहिए।

पीएच और पी एस एस के तापमान मीट्रिक टन के विकास पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। वेंटिलेशन के बिना लंबी अवधि के लिए बैठता है, जो पी एस एस, के पीएच वृद्धि हो सकती है। साथ ही, कमरे के तापमान पर धमनियों डी की संभावना नहींevelop मीट्रिक टन। इसलिए पीएसएस लगातार नजर रखी और एक प्रवाह हीटर का उपयोग कर ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए छिड़काव चैम्बर के प्रोटोकॉल अनुभाग और तापमान में संकेत गैस मिश्रण का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में जल्द ही वातित किया जाना चाहिए।

इन प्रयोगों की अवधि में 3-5 घंटा कर रहे हैं, छिड़काव कक्षों और संबद्ध ट्यूबिंग लंबी अवधि के लिए पी एस एस को उजागर कर रहे हैं; नमक का अवक्षेप बाद के प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो कक्ष और ट्यूबिंग दोनों में निर्माण कर सकते हैं। इसलिए यह अच्छी तरह से छिड़काव कक्ष धोने और प्रत्येक प्रयोग के बाद de-ionized पानी के साथ ट्यूबिंग कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, देखभाल अच्छी तरह से प्रत्येक विच्छेदन के बाद de-ionized पानी के साथ विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया Sylgard लेपित पकवान साफ ​​करने के लिए लिया जाना चाहिए।

सीमाएं

इसके महत्व के बावजूद, प्रधानमंत्री विभिन्न सीमाएं हैं। सबसे पहले, सामूहिक लागत की खरीद के लिए प्रधानमंत्री उपकरण अधिक है (~ $ 22,000) और ला कुछ के लिए निषेधात्मक हो सकता हैबी एस; उपकरणों की एक विस्तृत सूची तालिका 3 में दिखाया गया है दूसरा, ताजा जहाजों सबसे प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं। इसलिए एक नया पशु कुल लागत में जोड़ने, एक प्रयोग के लिए euthanized है। छोटे mesenteric धमनियों का तीसरा, विच्छेदन कठिन है और इस तरह के नुकसान होने का खतरा है जो विच्छेदन माइक्रोस्कोप और microdissection के औजार के रूप में अन्य उपकरणों की आवश्यकता है। चौथा, एक सीखने की अवस्था है; में विशेषज्ञता प्राप्त है और एक प्रयोगशाला में प्रधानमंत्री की स्थापना समर्पित स्टाफ, समय और प्रयास की आवश्यकता है।

अन्य तरीकों और भविष्य के आवेदनों के संबंध में महत्व

समदाब रेखीय और सममितीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल संवहनी जेट का निर्धारण किया जाता दो प्रमुख दृष्टिकोण हैं। समदाब रेखीय तैयारियों के विपरीत, सममितीय तैयारी में vasoactivity एक तार myograph प्रणाली का उपयोग कर संवहनी चिकनी मांसपेशियों में तनाव को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। इन दो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक उपकरणों में मतभेद के अलावा, एगोनिस्ट-मैंnduced संकुचन परिमाण, समय पाठ्यक्रम और नाड़ी की दीवार तनाव 11,19 की दिशा के संबंध में इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के बीच अलग है। क्योंकि तकनीकी उपयुक्तता और सीमाओं के कारण, दोनों की तैयारियों महत्वपूर्ण भूमिकाओं में सेवा करते हैं। यह सममितीय तैयारियों पर सूक्ष्म ध्यान बनाए रखने के लिए आसान है क्योंकि उदाहरण के लिए, वे अक्सर संवहनी जेट और संवहनी चिकनी पेशी सीए 2 + में परिवर्तन का एक साथ माप के लिए उपयोग किया जाता है। दूसरी ओर, myogenic गतिविधि सबसे अच्छा बारीकी से इन विवो शारीरिक स्थिति की नकल करने के लिए माना जाता है कि दबाव की तैयारी में मूल्यांकन किया है। इन तैयारियों के बीच मतभेद की एक विस्तृत समीक्षा की पहले से 19 प्रदान की जाती है।

अंत में, दबाव myography पास शारीरिक स्थितियों में छोटे प्रतिरोध वाहिकाओं में myogenic प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है। अपनी सीमाओं के बावजूद, प्रधानमंत्री परिवर्तन की समझ में महत्वपूर्ण योगदान के लिए प्रदान की गई हैसामान्य और वैकृत शर्तों 3-7,20-23 में नाड़ी समारोह। प्रणालीगत संवहनी टोन के नियमन के अत्यधिक जटिल है और इसलिए vivo में संवहनी बेड के स्वर को विनियमित करने के लिए विशिष्ट तंत्र की भूमिका को अलग करने के लिए स्थानीय और न्यूरो हार्मोनल कारकों मुश्किल है शामिल है। इस संबंध में पूर्व vivo दबाव धमनी की तैयारी के रूप में उत्कृष्ट surrogates के काम करते हैं। लाख टन और myogenic प्रतिक्रिया के पारगमन तंत्र में जो दिलचस्पी पहले प्रकाशित उत्कृष्ट समीक्षा 15,19 करने के लिए भेजा जाता है। भविष्य में हम myogenic प्रतिक्रिया और इस तरह के CA के रूप में नीचे की ओर दूतों में परिवर्तन का आकलन है कि एकीकृत 2 + यह है कि हम उपकरणों की लागत में कमी देखना होगा कि अत्यधिक संभावना नहीं है, हालांकि उपकरणों के क्षेत्र में प्रगति देख सकते हैं। इस तकनीक को विभिन्न पृष्ठभूमि के साथ वैज्ञानिकों द्वारा अपनाई गई है लेकिन, जैसा कि हम इस तरह की संभावना सिरोसिस, डे के रूप में उच्च रक्तचाप, मधुमेह और आघात के अलावा अन्य रोगों में microvascular समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए अपने आवेदन देखेंगेmentia आदि

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Disclosures

लेखक कोई वित्तीय संघर्ष किया है।

Acknowledgements

संदीप खुराना एनआईएच (K08DKO81479) द्वारा समर्थित है। विक्रांत Rachakonda (T32DK067872) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 223506
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) Sigma Aldrich E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884
HEPES Sigma Aldrich H3784
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma Aldrich M7506
MOPS Sigma Aldrich M5162
Phenylephrine Sigma Aldrich P6126
Potassium chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) Sigma Aldrich S6014
Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881
Sodium nitroprusside Sigma Aldrich 13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma Aldrich S9638
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P8574
Table 1.
Physiological salt solution (1,000 ml) mM
KCl 4.9 0.365 g
NaCl 112 6.545 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g
KH2PO4 1.2 0.163 g
Glucose 11.5 2.072 g
NaHCO3 26 2.184 g
HEPES 10 2.383 g
CaCl2 2 2 ml (1M stock)
De-ionized water 998 ml
Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM
KCl 4.9 0.036 g
NaCl 112 0.645 g
MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucose 11.5 0.207 g
NaHCO3 26 0.218 g
HEPES 10 0.238 g
EGTA 0.39 0.015 g
Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g
De-ionized water 100 ml
Dissection solution, stock (500 ml) mM
NaCl 145 21.18 g
KCl 4.7 0.875 g
MgSO4 1.2 0.739 g
MOPS 2 1.049 g
EDTA 0.02 0.019 g
De-ionized water 500 ml
Working dissection solution (100 ml) mM
Dissection solution stock 20 ml
Glucose 1.2 0.091 g
NaH2PO4 5 0.016 g
Sodium pyruvate 2 0.022 g
CaCl2 2 0.2 ml (1M stock)
De-ionized water 79.8 ml
Table 2. Composition of Experimetnal solutions
Equipment
CCD Monochrome Camera The imaging Source DMK 21AU04
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
Thermistor Warner Instruments 64-0108
Dual automatic temperature controller Warner Instruments TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instruments P-97
Fluorescence System Interface IonOptix model FSI-700
Forceps and scissors World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis IonOptix Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing Silastic 508-005
Male Sprague Dawley rat Harlan Laboratories
Master flex console drive Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System Millipore ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture Ethicon 9007G
Photometry and Dimensioning Microscope Motic AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer Living Systems Instrumentation PS-200
Stereomicroscope Nikon Instruments Inc SMZ660
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1
Dissection dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW120-6
Microforge Stoelting 51550
Table 3.

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References

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