反向酵母双杂交系统,以确定哺乳动物核受体残留的互动与配体和/或拮抗剂

1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally
Biology

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Summary

酮康唑结合并拮抗孕烷X受体(PXR)激活。 PXR突变体的酵母高通量筛选定义一个独特的区域为酮康唑约束力。这种酵母为基础的遗传学方法发现与具有表面结合位点相关联的配体小说核受体相互作用。

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Li, H., Dou, W., Padikkala, E., Mani, S. Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists. J. Vis. Exp. (81), e51085, doi:10.3791/51085 (2013).

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Abstract

由于药物代谢和炎症反应的重要调节器,孕烷X受体(PXR),它在疾病的病理生理过程中起重要作用联系起来代谢和炎症( 脂肪肝)1,2。出现了在激动剂配体为PXR的识别很大的进展,但是,也有类药拮抗剂和PXR 3,4,5其结合位点的有限的描述。一个关键的障碍已经无法有效地净化全长蛋白与拮抗剂的结构研究尽管PXR克隆和特征1998。我们实验室开发了一种新的高通量酵母基于双杂交法来定义的拮抗剂,酮康唑的,上PXR 6结合的残基。我们的方法包括创建突变库,将营救的单一突变对PXR的AF-2面有望与酮康唑交互的效果。事态抢救或“功能获得的”塞科第二突变可制成使得关于酮康唑对PXR的遗传相互作用和表面残基的结论是可行的。因此,我们开发PXR突变体及其共激活因子,SRC-1相互作用的高通量双杂交酵母屏幕。使用这种方法,其中的酵母进行了修改,以适应抗真菌药,酮康唑的研究中,我们能够证明对PXR的特定突变富集的克隆不能结合到酮康唑。通过反向逻辑,我们的结论是原来的残留物是直接的互动残酮康唑。此法是一种新型的,听话的基因检测,以屏幕上的核受体拮抗剂的表面结合位点。该测定法可以适用于任何药物,无论其细胞毒性潜力的酵母以及细胞蛋白(s)表示,不能使用标准结构生物学或基于蛋白质组学方法,研究。潜在的缺陷包括解释数据的(互补的方法很有用),可靠ANCE单Y2H的方法,在处理酵母或进行酵母双杂交试验的专业知识,并检测优化。

Introduction

在酵母双杂交(Y2H)法被广泛地用于发现蛋白质-蛋白质相互作用以及最近用于发现新颖的小分子干扰蛋白质-蛋白质相互作用复合体7,8,9,10,11。然而,这种分析的传统方法中,用于药物发现的或“命中”,不允许用于检测的化学品化合物的变构相互作用的残基中的蛋白-蛋白的表面,即改变仍然交互,并允许改变的残基11的询问时。事实上,这样的方法(次),如果制定可行,将使为别构相互作用的残基的蛋白质 - 蛋白质相互作用破坏关键的高通量评价一个听话的酵母系统。在药物发现的背景下,最直接的方式来建立化合物的相互作用与蛋白质会涉及结构测定(蛋白-抑制剂复合物晶化)。这些方法暨bersome,用精心制作的资源和执行的每一个蛋白质结构研究它在技术上并不可行。

听话的基因药物筛选系统已经建立了细菌1,2和类似哺乳动物双杂交等模型系统。然而,这些系统需要最优化和类似Y2H替代系统仍然在药物发现的最测试。有迹象表明,包括灵敏度,并使用单数的方法13的相互作用的可靠性差的限制,然而,一个单一的Y2H测定法可以被修改来回答关于相互作用的残基的具体问题。在核受体的研究领域中,Y2H已被用来定义相互作用蛋白14,然而,这些蛋白质的相互作用很少被用于定义在其中的配体/受体拮抗剂与核受体-蛋白质复合物相互作用的性质。因此,我们的实验室集中精力定义一个方法,尤其是对于受体蛋白质,是不随时服从蛋白质组学为基础的方法,这将发掘新的配体/受体拮抗剂使用基于反向Y2H发现平台交互的残留物。

基于我们以前发现,酮康唑破坏PXR及其活化剂SRC-1,我们开发了一种新的反向酵母双杂交系统,使我们能够对PXR 6定义和查询酮康唑相互作用的残留物。我们的方法是基于酵母的GAL4的蛋白质,它由负责DNA结合和转录激活结构域可分离的属性。的PXR LBD蛋白被表达为融合到LexA的DNA结合结构域(DNA-BD),而全长共活化剂的SRC-1(类固醇受体共激活因子1)的蛋白质表达为融合至GAL4激活结构域(AD )。 PXR和SRC-1融合蛋白之间的相互作用导致的含有报告基因的β-Lac的Ž已整合到酵母染色体组的GAL4结合位点的转录活化Ë。酮康唑,一个PXR受体拮抗剂,扰乱PXR和SRC-1相互作用15,16,17,我们可以检测PXR的相互作用和SRC-1的染色上筛选菌落用于X-gal的活动之后的存在或不存在酮康唑。 Y2H的原理图示于图1和实验过程总结于图2。

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Protocol

1。 PXR和SRC-1融合体在酵母载体的构建

  1. PCR扩增人类PXR LBD(107-434氨基酸)和人类SRC-1全长(1-1401氨基酸)。
    1. 使用pSG5-hPXR 8质粒作为PXR LBD模板,使用PCMX-SRC1质粒为SRC-1的模板。
    2. 解冻PCR SuperMix,DNA模板和引物(见材料),让他们在冰上。
    3. 加0.25微克/微升DNA模板1微升,10毫引物对2微升各自的PCR SuperMix 45微升,并添加H 2 O至使总体积为50微升。
    4. 设置PCR在94℃下一个循环2分钟,20个循环的94℃30秒,55℃30秒,72℃2分钟,然后72℃10分钟延长一个周期。检查PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。
  2. PCR产物克隆到酵母双杂交载体。
    1. 从1%琼脂糖凝胶纯化的PCR产物。摘要PXR,LBD,PCR和Y2H载体pSH2-1BamHI和SalI位;消化SRC-1 PCR和Y2H载体pGADNOT与NotΙ和SalΙ。要做到这一点,加1微克的DNA,3微升10X反应缓冲液,1μL限制性内切酶,最后H 2 O至使总体积为30μL。
    2. 把消解样品在37℃水浴1小时。通过在1%琼脂糖凝胶电泳检查消化。
    3. 纯化消化的样品在1%琼脂糖凝胶上,结扎消化的PCR产物和Y2H载体和转化到DH5α感受态细胞。
    4. 挑殖民地和隔离质粒DNA。
  3. 识别pSH2-1-PXR质粒DNA经BamHI / SalI位消化,找出pGADNOT-SRC-1质粒DNA用NotI位/ SalI位消化。通过测序验证一切积极质粒DNA。

2。酵母双杂交试验

  1. 接种酵母菌株到5ml YPAD孵育过夜通过不断搅拌(220转,30℃)。注意: 酿酒酵母的菌株是CTY10-5D(MAT一个ADE2 TRP 1-901 LEU2-3,112 HIS3-200 GA L4 - GAL80 - URA3 :: LEXA-lacZ的 ),其中包含一个集成的GAL1-lacZ基因与LexA操纵 10。要获得可行的酵母细胞的抗酮康唑,但那些没有进行转运改建为唑类抗18-20的原因,为CTY10-5D酵母新菌株是通过首先删除ERG3(ERG3Δ)获得,然后引入额外的缺失ERG11(ERG3Δ/ ERG11Δ)的基因通过同源重组。建筑细节在以前出版的手稿6被描述。
  2. 第二天(早上),接种酵母(1:20)在5毫升YAPD和孵化通过不断搅拌(220转,30℃)来获取一个外径600〜0.2。
  3. 沉淀细胞在微量离心2分钟2000转,并丢弃上清液。然后洗PELLE吨两次用无菌水,一次用0.1M的醋酸锂。
  4. 最后一次洗涤后,弃去上清液,加入以下试剂,细胞沉淀:240微升PEG 3500 50%重量/体积,36微升1M的醋酸锂,50微升2毫克/毫升的水煮鲑鱼精子单链DNA,H 2 O的34微升。旋涡混匀,加1微克PSH-PXR和1微克pGADNOT-SRC-1的DNA混匀。
  5. 传输组合,聚苯乙烯圆底管,搅动改造,混合(220转,30℃)30分钟。移动管子到42℃水浴中孵育另外的30分钟。
  6. 离心管在2,000 rpm离心2分钟,除去上清液。用无菌水冲洗一次颗粒。
  7. 吸取100微升无菌水进入管,通过手指轻轻重悬细胞攻和移液,然后镀上-His/-Leu降中(配方每升-His/-Leu差中的板材:20 G葡萄糖, 1.7克YNB,0.67克CSM-His/-Leu,5克硫酸铵,1.5%琼脂)和增量ubate在30℃下3-4天以分离转化体。

3。 X-gal的筛选分析

  1. 切硝酸纤维素膜的陪替氏培养皿的部分的大小。标签的硝酸纤维素膜上标记的方向。
  2. 放置在酵母菌落预标记的硝酸纤维素膜,确保该膜是在与板介质的表面相接触。
  3. 取下滤膜,将其放置菌落面朝上3毫米的滤纸,然后将膜和滤纸在-80℃下15分钟。
  4. 让X-gal的解决方案。加50微升20毫克/毫升X-gal和15μl的β-巯基乙醇至5ml的Z-缓冲液(1升缓冲液含有16.1克的Na 2 HPO 4 7H 2 O,5.5克的NaH 2 PO 4·H 2 O,0.75克氯化钾,0.25克硫酸镁4•7H 2 O)。如果Z缓冲区保持在4℃,加入这些试剂之前,把它带到室温。
  5. 将3毫米的滤纸两个圆在培养皿中,并用5毫升X-gal的溶液浸泡其中。排出多余的缓冲液从Petri培养皿并将其放置在硝酸纤维素膜上的菌落的一面朝上。
  6. 盖上盖子,确保膜正与滤纸完全接触,这是完全湿透。包裹培养皿箔和孵化在37℃,30分钟至过夜。

4。液体的β-半乳糖苷酶含量

  1. 酵母生长在-His/-Leu差液体培养基中OD 600 0.7。
  2. 转移1ml培养基至1.5 ml微量离心管中并离心以3,000 rpm持续2分钟。弃上清。
  3. 加入1 ml的Z缓冲器中,以重悬沉淀,离心分离机在3000rpm下再持续2分钟。弃上清。
  4. 加入150μlZ缓存与2ME重悬细胞沉淀,混匀再加入50微升氯仿和20微升0.1%SDS。大力旋涡振荡样品15秒。
  5. 加入700μlONPG溶液(1毫克/毫升Z中的bufFER)。设置定时器,孵育在30℃下足够长的时间以使黄色开发并注意总的反应时间。
  6. 加入500μl的1M的Na 2 CO 3使反应停止,并确定在420nm处的吸光度。空白是700微升ONPG溶液加500微升1米的Na 2 CO 3。

计算米勒单位如下:米勒单位=(A420 * 1,000)/(A600 *分*毫升)

A420:吸光度单位在420纳米; A600:吸光度单位,在600纳米; 分钟 :反应时间(分钟); 毫升 :在毫升反应体积

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Representative Results

我们进行了一个实验,看看我们是否可以检测PXR和类固醇受体共激活因子-1(SRC-1)的协会的比色读数。由于酵母具有显著甾醇的生产,它先前已经表明,在酵母中的lacZ的表达,而不需要额外的外源性配体所诱导。我们发现,lacZ的表达(蓝色菌落)也感应出的酵母菌株转化的PXR和SRC-1,但是,没有诱导LacZ的表达(白色菌落)在酵母转化的空载体,PXR的或单独的SRC-1 ( 图3)。以确定酮康唑(25μM)是否破坏PXR和在酵母中的SRC-1相互作用,含有酮康唑复制品板浸泡硝酸纤维素和X-gal的过滤器,升降机,和β-半乳糖苷酶液体测定法进行。我们表明,酮康唑破坏PXR和SRC-1的相互作用在酵母中,因为从副本过滤器所有的殖民地现在是白色的(这是还示出了由液体酶测定的显著降低β-半乳糖苷酶的活性)( 图4A)。我们已经在哺乳动物测定该PXR突变体(T248E/K277Q)可以通过一个强的配体( 例如利福平)被激活先前示出,但是免疫酮康唑1 7的拮抗作用。同样,当我们工程改造的酵母质粒的PXR双突变体(T248E/K277Q),然后进行酵母转化用的SRC-1,我们能够证明暴露于酮康唑的菌落仍然保留LacZ的表达( 图4B)。

图1
图1。示意性示出了酵母双杂交(Y2H)测定的原理。的酵母检测已被确立为功能测定法,其允许PXR突变体是resistan的隔离吨至酮康唑的SRC-1的相互作用介导的抑制。 ,LexA蛋白-DB-hPXR融合蛋白的利福平诱导与SRC-1融合至GAL4激活结构域(GAL4AC-SRC-1)的双杂交相互作用。的相互作用的结果,因为LacZ报道。B的,在X-gal的检测蓝色菌落,酮康唑的存在扰乱hPXR与SRC-1的利福平诱导的相互作用。 X-gal的检测结果中的白色菌落C,一个突变(用星号表示)中hPXR呈现它不受酮康唑的作用将产生蓝色菌落。D,我们的测定法在将来进一步改进的可能存在加入额外的第二部位抑制突变(示出与半月形)无效化,可能导致的hPXR-SRC-1的相互作用在X-gal的测定中的干扰,因此为白色菌落第一突变的效果。 LexAOp,LexA蛋白操纵子,高浦,Gal4的启动子,lac Z,β-glalactosidase,DB,LexAOp DNA结合Galp公司的域名,交流,行为ivati​​on域; *,突变(S)。 (从参考6转载) 点击此处查看大图

图2
图2。实验流程图。

图3
图3。 X-gal的,电梯检测,β-半乳糖苷酶的液体检测。酵母进行转化,表明质粒和镀菌落进行X-gal的电梯试验(左图)和β-半乳糖苷酶液体含量(右图)。 PSH空载体+ pGADNOT空载体( 泳道1),PSH-PXR + pGADNOT空载体( 泳道2); PSH空载体+ pGADNOT-SRC-1( 第3道 ),PSH-PXR + pGADNOT-SRC-1( 泳道4 </ em>的); 5。 PSH-INI-1 + pGADNOT-c-Myc的(阳性对照, 泳道5)。 (从参考6转载)。

图4
图4。酮康唑破坏野生型而不是突变PXR协会与辅激活因子,SRC-1酵母的菌落复制在含有车辆板(0.2%DMSO中, 泳道1)或酮康唑(25μM, 泳道2)。随后进行X-gal的电梯试验(左图)和β-半乳糖苷酶液体含量(右图)。野生型PXR(A,B 线12)和酮康唑静音突变T248E/K277Q(B 线34)在该图中被示出。 (从参考6转载)。

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Discussion

在我们修改的酵母双杂交实验中,我们已经确定了对PXR 6酮康唑相互作用重要的残留物。因为SRC-1是共活化剂(和克隆到pGADNot矢量),我们还测试了SRC-1是否能当克隆到PSH载体系统激活lacZ的表达,以及是否会改变活动模式和/或影响的泄漏酵母双杂交实验。利用我们在ERG3Δ/ ERG11Δ酵母进行双杂交试验我们重新设计的质粒。和以前一样,我们表明lacZ基因表达(蓝色菌落)也诱导ERG3Δ/ΔERG11酵母菌株转化的PXR和SRC-1,但是,没有诱导LacZ的表达(白色菌落)在酵母转化空载体,PXR或SRC-1单独地(数据未显示)。我们的方法提供了隔离遗传相互作用变构配体 - 蛋白质残基的蛋白质,不受外界conventio一个强大的新方法NAL结构生物学和/或蛋白组学方法5,21。

如描述的协议,有几个陷阱,必须承认。首先,检测的灵敏度,特别是在蛋白质 - 蛋白质相互作用的残基的那些部分拮抗剂作用可以限制该测定的分辨率。比色扫描可能有助于解决一些检测的问题21。第二,蓝色菌落的存在可能并不总是表明酮康唑抗性突变PXR(假阳性)。该lacZ的表达可以在酮康唑存在因突变PXR,使蛋白质组成性激活的SRC-1的相互作用或主动独立的(S)被救出。 PXR的这些突变体可从真酮康唑抗性突变体通过测试的LexA-DB-PXR的能力,自我区分激活lacZ的表达, 这些突变体将产生蓝色菌落在没有GAL4AC-SRC-1。作为一个必然结果,突变体可以人因此使用GAL4AC质粒在没有LexA的DB-SRC-1的进一步描述证据自我激活LacZ基因的导入酵母。第三,它仍然是未知的,如果有其他的Y2H协议/载体,用13相同的结果会得到。四,分子内回复突变的突变体(酮康唑抗性突变体第二个站点抑制突变体)的研究中可以添加拮抗剂通过定义邻近残基的影响药效绑定绑定的理解。与突变体的文库的变型,可以使用酮康唑抗性突变体的诱变模板定义这个更精确。

该方法可以被修改,以结合任意药物,由此在酵母细胞毒性靶是公认的或对药物(s)表示,具有朝向酵母没有潜在的毒性。酵母可以修改的,如我们已经显示6,并仍然是可行的Y2H实验。这种方法的威力还依赖于配套通知从其他实验( 分子对接),该通知网站特异性相互作用振动性。此外,具体的核受体/辅助调节因子的相互作用( nurr77/LKB1; AR/PELP1)可以研究22,23。该系统的易处理性在于它是便携式的,可以在几天内以高通量的方式进行,并且不需要昂贵的试剂或方法。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由卫生研究院(NIH)国家机构支持的补助CA127231及达蒙鲁尼恩基金会临床研究奖(CI 1502)(以SM)。我们要感谢的Zdenek德沃夏克教授帕拉茨基大学奥洛穆茨,捷克共和国的有益见解讨论这个技术移植到他们的机构和协议的标准化。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ Our lab CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 .
YPD Growth Medium BD Biosciences 630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BD Biosciences 233520
Bacto Agar BD Biosciences 214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture MP Biomedicals 4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). Sigma-Aldrich N1127
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Luria Broth (LB) Sigma-Aldrich L3022
X-Gal Fisher BP-1615
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) Life Technology 156-017
Ampicillin Acros Organics 61177
Ketoconazole Sigma-Aldrich K1003
N,N-Dimethylformamide Acros Organics 326871000
Lithium Acetate Sigma-Aldrich L4158
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized Sigma-Aldrich P-3640
Nitrocellulose Membrane Whatman 10402091
10 cm Petri Dish Fisher 875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' our lab PXR LBD forward primer for pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' our lab PXR LBD reverse primer for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' our lab SRC-1 forward primer for pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' our lab SRC-1 reverse primer for pGADNOT
Platinum PCR Supermix Invitrogen 11306-016
BamHI our lab R0136
SalI our lab R0138
NotI our lab R0189

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References

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