الاستشعار من الجدار الأنسجة تعطيل مع الترانزستور العضوي الكهروكيميائية

1Department of Bioelectronics, Ecole Nationale Superieure des Mines, 2Research and Exploratory Development Division, Applied Physics Laboratory, Johns Hopkins University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

تم دمج الترانزستور العضوي الكهروكيميائية مع الخلايا الحية وتستخدم لمراقبة تدفق الأيونات عبر حاجز الظهارية المعوية. في هذه الدراسة، وزيادة في تدفق أيون، تتعلق تعطيل منعطفات ضيقة، الناجم عن وجود EGTA خالب الكالسيوم (جلايكول الإثيلين مكرر (الأثير بيتا aminoethyl)-N، N، N '، الخليك N'رباعي حامض)، ويقاس.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tria, S. A., Ramuz, M., Jimison, L. H., Hama, A., Owens, R. M. Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor. J. Vis. Exp. (84), e51102, doi:10.3791/51102 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الجهاز الهضمي هو مثال على حاجز الأنسجة التي توفر حاجز مادي ضد دخول مسببات الأمراض والسموم، في حين يسمح بمرور الأيونات والجزيئات الضرورية. يمكن أن يكون سبب الاختراق في هذا الحاجز عن طريق انخفاض في تركيز الكالسيوم خارج الخلية. هذا الانخفاض في تركيز الكالسيوم يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي في البروتينات المشاركة في الختم من الجدار، مما أدى إلى زيادة في تدفق paracellular. لتقليد هذا التأثير الكالسيوم خالب جلايكول الإثيلين مكرر (الأثير بيتا aminoethyl)-N، N، N '، وكان يستخدم حمض الخليك N'رباعي (EGTA) على أحادي الطبقة من الخلايا المعروف أن ممثل الجهاز الهضمي. أساليب مختلفة للكشف عن اختلال النسيج حاجز موجودة بالفعل، مثل المناعي ونفاذية المقايسات. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت ومكلفة وغير مناسبة لقياسات الحيوية أو الإنتاجية العالية. الوسائل الإلكترونية لقياس الأنسجة حاجزتوجد أيضا النزاهة لقياس المقاومة بطريق الظهارة (TER)، ولكن هذه غالبا ما تكون مكلفة ومعقدة. هناك حاجة لتطوير طرق سريعة، ورخيصة، وحساسة على وجه السرعة كما على سلامة الأنسجة حاجز معلمة رئيسيا في اكتشاف الأدوية ووسائل التشخيص الممرض / السم. وقد تبين الترانزستور الكهروكيميائية العضوية (OECT) تتكامل مع النسيج حاجز تشكيل خلايا كجهاز جديدة قادرة على رصد حيوي سلامة الأنسجة الحاجز. الجهاز قادر على قياس التغيرات الدقيقة في تدفق الأيونية مع القرار الزماني لم يسبق لها مثيل والحساسية، في الوقت الحقيقي، كمؤشر على سلامة الأنسجة الحاجز. ويستند هذا الأسلوب الجديد على جهاز بسيط يمكن أن تكون متوافقة مع التطبيقات فحص إنتاجية عالية وبتكلفة منخفضة ملفقة.

Introduction

ظهارة المعوية هو مثال على حاجز الأنسجة التي تسيطر على مرور الجزيئات بين مقصورات مختلفة من الجسم. يتكون من خلايا ظهارة عمودية ممدود انضم معا عن طريق المجمعات من البروتينات التي توفر حاجزا ضد مسببات الأمراض الجسدية 1 والسموم، في حين يسمح بمرور الماء والمواد الغذائية اللازمة للحفاظ على الجسم. ويرجع ذلك إلى الاستقطاب من الخلايا الظهارية، مما يخلق اثنين من المجالات المختلفة غشاء هذه الانتقائية: الجانب قمية من الخلايا المعرضة لمعة والجانب القاعدية من الخلايا ترتكز على الأنسجة الكامنة 2،3. منعطفات ضيقة (TJ) هي المجمعات من البروتينات الموجودة في الجزء القمي من الخلايا الظهارية والتي هي جزء من مجمع أكبر يعرف باسم مفترق القمي 4. تدفق أيون عبر حاجز الأنسجة قد تذهب إما عن طريق العابر للخلايا (من خلال الخلية) أو عن طريق paracellular (بين اثنين من الخلايا المجاورة) مسار. مجموعالنقل سواء من خلال مسارات يعرف باسم المقاومة بطريق الظهارة. تقاطع القمي هو المسؤول عن تنظيم الأيونات وجزيئات تمر عبر حاجز 5،6 عبر فتحة محددة وظيفة الإغلاق. وغالبا ما ترتبط خلل أو تعطل هذه المجمعات البروتين لمرض 7-11. بالإضافة إلى ذلك، لا يعرف العديد من مسببات الأمراض المعوية / السموم خصيصا لاستهداف هذا المجمع، وبالتالي تدخل الجسم ويؤدي إلى الإسهال، وعلى الأرجح نتيجة التقلبات الهائلة من تدفق أيون / المياه عبر الحاجز 12-14. ويمكن أيضا أن يتم تعديل الحاجز الأنسجة عن طريق تغيير المكروية خارج الخلية. كادهيرين هو بروتين حاسم لالتصاق خلية خلية، وتشارك في تشكيل تقاطع القمي. مطلوب الكالسيوم عن التشكل الهيكلي الصحيح من كادهيرين، ولقد ثبت انخفاضا في خارج الخلية الكالسيوم أن يؤدي إلى تدمير تقاطع خلية خلية وافتتاح اللاحقة للمسار paracellular بين خلايا 15. في هذه الدراسة، EGTA (الإيثيلين جليكول مكرر (بيتا aminoethyl الأثير)-N، N، N '، وحامض الخليك N'رباعي)، وخالب الكالسيوم محددة، وكان يستخدم للحث على خرق الحاجز في الأنسجة، كما أن لديها وقد تبين أن يكون لها تأثير سريع وجذري على paracellular أيون تدفق 16،17. وقد استخدم هذا خالب الكالسيوم على متكدسة وأحادي الطبقة متباينة من خط الخلية كاتشو-2. مثقف في إدراج خلية ثقافة، ويعرف هذا الخط الخلية لتطوير خصائص الجهاز الهضمي، ويستخدم على نطاق واسع من جانب الصناعة الصيدلانية لاختبار امتصاص الأدوية 18،19.

أساليب لمراقبة سلامة الأنسجة الحاجز وفيرة. هذه الأساليب هي في كثير من الأحيان البصرية، والاعتماد على تلطيخ المناعي للبروتينات خاصة من المعروف أن عند تقاطع قمي 20، أو الاعتماد على القياس الكمي للجزيء التتبع الفلورسنت التي عادة غير منفذ للأنسجة حاجز21،22. ومع ذلك، وأساليب خالية من التسمية (أي بدون fluorophore / حامل اللون) هي الأفضل مثل استخدام تسمية يمكن أن تحمل الأعمال الفنية، وغالبا ما يزيد من تكلفة الفحص والوقت. وقد برزت، ورصد تسمية خالية من الأنسجة الكهربائية حاجز مؤخرا كوسيلة من وسائل الرصد الحيوي 23. على سبيل المثال سمحت التطورات التكنولوجية الحديثة في مقاومة الكهربائية الطيفي تطوير جهاز المسح الضوئي المتوفرة تجاريا 24،25 التي يمكن قياس المقاومة بطريق الظهارة (TER)، وهو قياس تصرف أيون عبر طبقة الخلايا.

وقد خلق الالكترونيات العضوية فرصة فريدة للتواصل في عالم الالكترونيات وعلم الأحياء 26،27 28،29 باستخدام إجراء البوليمرات التي يمكن إجراء كل من الناقلين الالكترونية والأيونية. تم استحداث تقنية جديدة للكشف عن المخالفات في الأنسجة حاجز باستخدام OECT 30-32 مؤخرا. والتحقق من صحة هذا الجهاز ضد التقنيات القائمة بناإد لتقييم سلامة حاجز الأنسجة، بما في ذلك المناعي، فحوصات النفاذية باستخدام وسيفر الصفراء، ومقاومة التحليل الطيفي باستخدام Cellzscope. في حالة جميع المركبات السامة اختبارها، تم العثور على OECT للعمل مع حساسية مساوية أو أفضل، مع زيادة والقرار الزماني، بالمقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه. في هذا الجهاز، PEDOT: جهاز الأمن الوقائي، وإجراء البوليمر التي قد تظهر لتكون مستقرة وحيويا 33،34، ويستخدم كمادة نشطة في القناة الترانزستور. يتكون OECT هجرة ومصدر أقطاب كهربائية على جانبي قناة البوليمر التوصيلي. ثم يتم وضع هذا في اتصال مع المنحل بالكهرباء، والتي تشكل جزءا لا يتجزأ من الجهاز. هي مغمورة A القطب البوابة في الكهارل (الشكل 1)، وعندما يتم تطبيق الجهد بوابة إيجابية عند البوابة، يضطر الكاتيونات من بالكهرباء في القناة، وبالتالي dedoping البوليمر وإجراء يؤدي إلى تغيير في مصدر استنزاف الحالية. دevice بالتالي حساسة للغاية لتغييرات في اللحظة في تدفق الأيونية بسبب التضخيم من الترانزستور. وضعت طبقة الخلايا نمت على إدراج ثقافة الخلية بين القطب البوابة والقناة الموصلة البوليمر. وجود طبقة الخلايا سليمة بمثابة حاجز للالكاتيونات الدخول في البوليمر إجراء، وبالتالي، في وجود أحادي الطبقة سليمة، والانخفاضات الحالية هجرة (الشكل 2: الانتقال من المنطقة لب). في وجود مركب سام، فإن الأنسجة حاجز تفقد تدريجيا سلامتها، والسماح للالكاتيونات دخول في فيلم البوليمر وزيادة استنزاف الحالية (الشكل 2: المنطقة ج). مع هذا الأسلوب، يعتبر خرق في الأنسجة حاجز من التشكيل الحالي للهجرة، الموافق للتعديل للتدفق عبر أحادي الطبقة. هذا الجهاز قادر على قياس التغيرات الدقيقة في تدفق الأيونية مع القرار الزماني غير مسبوقة وحساسية في الزمن الحقيقي. هذا فيل التكنولوجيال تكون ذات فائدة في مجال علم السموم لاختبار المخدرات، وتشخيص الأمراض أو البحوث الأساسية كنموذج حاجز يمكن تكييفها بسهولة. وهذا الأسلوب يساعد أيضا على الحد من التجارب على الحيوانات، كما أنه يتيح التحقق من صحة نماذج في المختبر ليحل محل اختبار في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PEDOT: PSS إعداد الحل

  1. إلى 50 مل من PEDOT: جهاز الأمن الوقائي، إضافة جلايكول الإيثيلين (يزيد الموصلية) في نسبة حجم 1:4 (جلايكول الإثيلين لPEDOT: PSS)، و 0.5 ميكرولتر / مل من حمض Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) كما السطحي، و 10 ملغ / مل 3 glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) باعتبارها رابط عبر لتعزيز التصاق البوليمر إجراء لشريحة زجاجية.

2. OECT التصنيع (الشكل 3)

  1. تحديد تبخرت حراريا الاتصالات ومصدر استنزاف الذهب عن طريق رفع قبالة الطباعة الحجرية:
    1. تدور معطف مقاوم الضوء على شريحة زجاجية نظيفة العادي في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. أبعاد الزجاج هي 3 × 1 في فيه.
    2. تحديد أنماط بواسطة ضوئيه. يجوز تغيير أبعاد، ومع ذلك عرضت أبعاد المدرجة هنا أن تؤدي إلى حساسية الأمثل. ثم استخدام المطور.
    3. تتبخر 5 نانومتر و 100 نانومتر من الكروم والذهب، على التوالي.
    4. رفع قبالة مقاومة للضوء في ميلانحمام ايتون لمدة 1 ساعة، وترك الركيزة مع مصدر واستنزاف منطقة الاتحاد الافريقي الاتصالات فقط.
  2. الطول المطلوب من PEDOT: قناة PSS هو 1 مم. ويتحقق ذلك من خلال الزخرفة باستخدام parylene-C (PA-C) تقشر التقنية:
    1. تحميل 3.5 غرام من باسكال-C في الإعداد الطلاء. موحد تتبخر 2 ميكرون من parylene-C على رأس الركيزة مع جهات الاتصال الاتحاد الافريقي.
    2. نمط القناة التي كتبها ضوئيه:
      1. تدور معطف مقاوم الضوء على 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
      2. استخدام قناع لتسليط الضوء على قناة اتصال والذهب و 20 ثانية للأشعة فوق البنفسجية، ومقاومة للضوء يتعرض تصبح قابلة للذوبان في المطور.
      3. استخدام المطور لفتح منطقة القناة على مقاومة للضوء.
    3. حفر باسكال-C في منطقة القناة من خلال خطوة البلازما 15 دقيقة (O 2 (50 SCCM) وCHF 4 (3 SCCM) في البلازما 160 W) من أجل فتح قناة اتصال والذهب.
  3. إيداع PEDOT: PSS حل الخليط بواسطة طلاء تدور في500 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. تخبز لمدة 30 ثانية في 110 درجة مئوية.
  4. قشر قبالة باسكال-C للكشف عن PEDOT: PSS قناة الركيزة تحتها. هذه القناة يجب أن تتداخل قليلا مع اتصالات الاتحاد الافريقي المحرز في البروتوكول 1.
  5. عينات خبز لمدة 1 ساعة في 140 درجة مئوية في ظل ظروف الغلاف الجوي.

3. الجمعية الجهاز

  1. جعل PDMS عن طريق خلط اثنين من الحلول (عادة الموردة معا في عدة) في 1:10 نسبة علاج الحل في الحل القاعدة. خبز لمدة 1 ساعة في 120 درجة مئوية.
  2. تصميم جيدا باستخدام لكمة ثقب وقطع مربع حول المنطقة المطلوبة.
  3. الغراء PDMS جيدا على قمة القناة، لينتج في منطقة القناة من حوالي 6 مم 2. ضمان أن الاتصالات ومصدر استنزاف لا تغطيها.
  4. جعل الدعم البلاستيك مع وجود ثقب في ذلك (يمكن استخدام حامل لإدراج ثقافة الخلية) ثم الغراء على أعلى PDMS. السماح لها بين عشية وضحاها الجافة.
  5. اختبار البئر عن تسريب من قبل بريفيللينغ مع واتإيه.
  6. لحام الأسلاك الكهربائية على اتصال ومصدر استنزاف مع القصدير.

4. الثقافة الخلية

  1. إعداد الخلايا سائل الإعلام والثقافة على النحو التالي:
    1. في DMEM، إضافة 1٪ الجلوتامين، و 10٪ مصل بقري جنيني، 0.5٪ البنسلين الستربتوميسين، و 0.1٪ جنتاميسين.
    2. تعقيم وسائل الإعلام ثقافة الخلية باستخدام جهاز تصفية العقيمة.
  2. الحفاظ على كاتشو-2 خلايا مرور بين 49 و 68 عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO في الخلية سائل الإعلام والثقافة.
  3. تقسيم الخلايا مرة واحدة في الأسبوع باستخدام التربسين والبذور في 1.5 × 10 4 خلية / إدراج.
  4. تغيير الخلية سائل الإعلام والثقافة مرتين في الأسبوع على مدى 3 أسابيع.

5. القياسات مع OECT

  1. توصيل الأسلاك حج / أجكل إلى sourcemeter للاستخدام كبوابة القطب. تزج طرف في وسائل الإعلام ثقافة الخلية، والذي يستخدم مثل بالكهرباء، كما هو موضح في الشكل 1A.
  2. ربط الأسلاك من مصدر واستنزاف لرانه sourcemeter (الإعداد قناة مزدوجة).
  3. تطبيق نبضة الجهد التربيعي الموجب (V ع) بين البوابة والمصدر (تستخدم الإلكترود المرجعي: الأرض). يتم تطبيق الجهد المستمر سلبية بين هجرة ومصدر (V DS) ويتم قياس المناظرة الحالية (I DS).
  4. استخدام جمع البيانات برنامج PC التوالي. يجب المعلمات OECT دخلت في برنامج اكتساب مخصصة على النحو التالي: V = -0.2 V DS، V = 0.3 V GS، GS V في الوقت المحدد = 2 ثانية، من الوقت = 28 ثانية.
  5. تلا مصدر استنزاف الحالي (I DS) والبوابة الحالية (I GS). تنفيذ القياس لعدة دقائق لضمان إشارة خط الأساس مستقرة.

6. دمج الخلايا مع OECT للقياس

ملاحظة: قبل التجربة، وسلامة طبقة الخلايا يمكن التحقق من خلال قياس TER مع جهاز المعاوقة التحليل الطيفي. TER كل 3 أسابيع من العمر كاتشو-2 INSE الخليةغ يجب أن يكون فوق 400 Ω. سم 2.

  1. خلال إجازة القياس OECT: إزالة القطب من بوابة بالكهرباء، إدراج إدراج خلية ثقافة، واستبدال البوابة الكهربائي داخل الخلية إدراج الثقافة.
  2. إجراء قياس خط الأساس مع الخلايا لعدة دقائق لضمان إشارة مستقرة. سيتم استخدام هذا خط الأساس بالنسبة لحساب قيمة تطبيع المقابلة لأحادي الطبقة سليمة (0).

7. إعداد ومقدمة من مجمع السامة

  1. إعداد 1 M حل EGTA في الماء DI، وتعديل لأول مرة الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.4 مع قاعدة تريس،
  2. إضافة حل EGTA في حجم مناسب للحصول على التركيز المطلوب (على سبيل المثال بين 5 ملم و 100 ملم) مع الأخذ بعين الاعتبار وحدة التخزين. ينبغي إضافة EGTA في غرفة القاعدية خلال إجازة.
  3. قياس مستمر لمدة 90 دقيقة كما في البروتوكول 5. إذا كان القياس هو بايقامت نانوغرام في درجة حرارة الغرفة، فإن استقرار الخلايا لا تظل ثابتة بعد 90 دقائق.
  4. في نهاية المدى، خدش طبقة الخلايا أن يؤدي إلى التدمير الكامل للطبقة الحاجز والتدبير لمدة 15 دقيقة، ويمكن أن يتم هذه النقطة عن طريق إزالة الفلتر وتخبط القطب البوابة في وسائل الإعلام. سيتم استخدام هذا خط الأساس بالنسبة لاحتساب القيمة المقابلة لتطبيع أحادي الطبقة تدميرها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلال الخطوة الأولى من القياس، واستنزاف الحالي قد تختلف إلى حد ما، ولكن في معظم الحالات، ينبغي أن تظل مستقرة (الشكل 2، القسم). إذا كانت إشارة غير مستقرة، يجب التخلص من الترانزستور واستبدالها. يضمن هذا الاختيار الاستقرار أيضا أن أي خسائر الأولي في التوصيل من الجهاز لا يؤثر على القياس اللاحق. بعد عدة دقائق من القياس، يتم وضع إدراج مع خلايا الأنسجة تشكيل حاجز على الجزء العلوي من القناة. استنزاف الحالية يجب أن تنخفض فورا (الشكل 2، القسم ب). إذا لا تقلل من استنزاف الحالي، وهذا يمكن أن يعني أن الخلايا لم تشكل حاجزا بشكل صحيح، أو تضررت خلال التلاعب، ويجب التخلص من مرشح واستبدالها. بإضافة مركب سام للأنسجة الحاجز، وينبغي أن التشكيل الحالي للهجرة تزيد تدريجيا أو فورا، اعتمادا على مركب يستخدم وتركيز (الشكل 2،القسم ج).

وقد تم جمع البيانات باستخدام sourcemeter وبرنامج اكتساب حسب الطلب. هذا البرنامج من تم الحصول على معايير مختلفة، والتي يتم تشغيلها في برنامج تحليل البيانات للحصول على منتصف تعديل المقابلة لكل نبضة البوابة. منتصف التشكيل يتوافق مع قيمة الحالية في منتصف ذروة (الشكل 4). تم تطبيع القيم منتصف التشكيل تم الحصول عليها خلال الاستشعار من أحادي الطبقة سليمة إلى 0 بينما كان التشكيل منتصف الحصول عليها بعد تطبيع الصفر إلى 1. وتستخدم نتائج طبيعية لمقارنة البيانات من أجهزة مختلفة (الشكل 5). من هذه البيانات يمكن أن ينظر إلى الاستجابة للجرعة من تركيزات الفرق من مجمع السامة مع مرور الوقت.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي من العضوية الكهروكيميائية الترانزستور متكاملة مع خلية ثقافة إدراج و) من وجهة نظر الجانب. ب) أعلى نظرا لقناة (الرمادي) والاتصال (الصفراء) الأبعاد على شريحة زجاجية بطول قناة 6MM و عرض القناة من 1 ملم . تم تعديل هذا الرقم من Jimison 30.

الرقم 2
. الشكل 2 نظرة عامة على القياس الميداني للاستجابة لاستنزاف الحالية البقول بوابة مربع مع ​​مرور الوقت في ظل ظروف القياس هي: V DS = -0.2 V، V = 0.3 V GS، GS V في الوقت المحدد = 2 ثانية، من الوقت = 28 ثانية. أ) يتوافق مع OECT تشغيلها قبل الاندماج مع خلايا، وضمان استقرار الجهاز. ب) يتوافق مع وINTEGالتموينية من الأنسجة حاجز تشكيل الخلايا، وضمان إشارة مستقرة من جديد قبل بدء اختبار مركب سام. ج) يتوافق مع إضافة EGTA إلى خلايا الأنسجة الحاجز، لاحظ تطور إشارة مرور الوقت.

الرقم 3
الرقم 3. عمليات التصنيع من OECT. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. OECT استنزاف الاستجابة الراهنة لواحد مربع بوابة النبض. قياس شروط منة هي كما يلي: V DS = -0.2 V، V = 0.3 V GS، GS V في الوقت المحدد = 2 ثانية، قبالة الوقت = خلايا 28 ثانية. أ) OECT استجابة عابرة قبل (خط متقطع) وبعد (الخط الأزرق) إضافة الأنسجة حاجز تشكيل نمت على مرشح. ب) OECT استجابة عابرة بعد إضافة مركب سام على الأنسجة الحاجز (الخط البرتقالي) ودون حاجز الأنسجة (خط متقطع).

الرقم 5
الرقم 5. نتيجة طبيعية نموذجية من OECT.، طبقة الخلايا (الصليب الأسود)، 5 ملي EGTA (دائرة زرقاء داكنة) و 10 ملي EGTA (السماوي دائرة) قدم استجابة طبيعية للOECT على إدخال الجهاز (دائرة فارغة) في تم قياس ر = 0، على مدى فترة 50 دقيقة.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا الأسلوب طريقة جديدة لدمج الترانزستور الكهروكيميائية العضوية مع الخلايا الحية لقياس سلامة الأنسجة الحاجز. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي سرعة وحساسية، ولكن أيضا انخفاض تكلفة الجهاز لرصد دينامية من الأنسجة الحاجز.

كما يستخدم هذا الأسلوب الخلايا الحية، وهي النقطة الحرجة هي أن تتأكد من أن استخدام أحادي الطبقة، وهو ما يمثل طبقة الحاجز سليمة. يجب أن يتم تعريف المعلمات من الجدار خلال توصيف خط الخلية. ولذا فمن الأهمية بمكان عدم تلف طبقة الخلايا عند البوابة مغمورة في القطب بالكهرباء على أعلى من طبقة الخلايا.

نقطة أخرى مهمة هي تصنيع الجهاز، وينبغي أن يحدث أي تسرب بين حافة PDMS وحامل البلاستيك لتجنب تباين حجم السائل. من أجل تحقيق نتائج قابلة للتكرار، وينبغي إيلاء اهتمام أيضا لحام من الأسلاك، وسوف حرق القطب الذهبية يؤدي ذلك إلى ضعف / لا اتصال مع قناة البوليمر إجراء وحتى الفقراء / لا إشارة.

لتسهيل التحليل والحصول على نتائج أفضل وينبغي أن يسمح دقائق قليلة من التأخير بين كل خطوة من هذه التجربة للجهاز لتحقيق الاستقرار بين الخطوات. كما لوحظ الاختلاف في إشارة من جهاز إلى جهاز، مطلوب تطبيع النتائج لتكون قادرة على مقارنة نتائج كل تجربة. ومع ذلك، في المستقبل الإنتاج على نطاق أكبر من الجهاز سيسمح أكبر جهاز استنساخ الجهاز.

القيد الرئيسي من هذه التقنية هو الشكل، كما في الوقت الحاضر يمكن قياس عينة واحدة فقط. وسيتم حلها قريبا هذا من خلال تطوير جهاز استشعار multiacquisition وفي المستقبل إنشاء شكل لوحة 96 جيدا. سيؤدي هذا إلى فتح الطريق لهذه التقنية لاستخدامها في فحص إنتاجية عالية من الأنسجة الحاجز. في موازاة ذلك، الأجهزة المستوية هي أيضا تحت ر التنميةس تسمح قياسات البصرية والإلكترونية في وقت واحد.

باختصار، لقد تم تطوير جهاز الرواية التي يمكن ملفقة بتكلفة منخفضة التي هي قادرة على رصد تسمية خالية من الأنسجة الحاجز. ويبين هذا الجهاز حساسية أكبر والقرار الزماني أعلى من الأساليب القائمة. دمج نماذج في المختبر مع الأجهزة مثل OECT يمكن أن يكون بديلا رائعا لحيوانات التجارب لاكتشاف المخدرات والسموم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويدعم هذا المشروع من قبل FP7-الشعبية-2009-RG، مشروع ماري كوري رقم 256367 (CELLTOX) واقتراح مجلس البحوث الأوروبي ERC-2010-258966 جنيها استرلينيا لا (IONOSENSE)، فضلا عن منحة مشتركة من CONSEIL الإقليمي دي بروفانس ألب كوت دازور وCDL فارما للST. نشكر جورج Malliaras لإجراء مناقشات مفيدة تتعلق تصميم OECT وظيفة.

Acknowledgements

واضعو هذه الدراسة لم يكن لديك أي مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clevios pH 1000 Heraus Clevios
AZ9260 resin Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore Dominique Dutscher 51705
24-well Cell culture plate BD Falcon Dominique Dutscher 51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM Dominique Dutscher 51246
Advanced DMEM Marque GIBCO Fisher Scientific E3434T
FBS Heat Inact. Fisher Scientific E3387M
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific E3470C
GlutaMAX Fisher Scientific E3524T
Trypsin 0.05% EDTA Fisher Scientific E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma Aldrich E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%, Sigma Aldrich
Caco-2 cells ATCC
PDMS Dow Corning SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%) NEYCO AU3X6
Chromium (99.95%) NEYCO
Parylene C Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire Harvard Apparatus
Photoresist Cipec Specialties

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
  3. Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
  4. Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
  5. Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
  6. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
  7. Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
  8. Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
  9. Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
  10. Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
  11. Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
  12. Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex--news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
  13. Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
  14. Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
  15. Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
  16. Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
  17. Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
  18. Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
  19. Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
  20. Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
  21. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
  22. Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
  23. Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
  24. Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
  25. Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
  26. Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. (2010).
  27. Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
  28. White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole - Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
  29. Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
  30. Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
  31. Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
  32. Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
  33. Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. 1556-1557 (2004).
  34. Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics