חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

1Department of Bioelectronics, Ecole Nationale Superieure des Mines, 2Research and Exploratory Development Division, Applied Physics Laboratory, Johns Hopkins University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני משולב עם תאי חיים ומשמש לניטור שטף יונים על פני מחסום האפיתל במערכת העיכול. במחקר זה, עלייה בשטף יונים, הקשורים להפרעה בצומת הדוקים, הנגרמת על ידי הנוכחות של EGTA chelator סידן (גליקול-BIS אתילן (אתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', אצטית N'-טטרה חומצה), הוא נמדדה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tria, S. A., Ramuz, M., Jimison, L. H., Hama, A., Owens, R. M. Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor. J. Vis. Exp. (84), e51102, doi:10.3791/51102 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מערכת העיכול היא דוגמא של רקמת מחסום המספקת מכשול פיזי מפני כניסה של פתוגנים ורעלים, תוך מתן אפשרות למעבר של יונים ומולקולות הדרושים. פרצה בגדר זה יכול להיגרם על ידי ירידה בריכוז הסידן תאי. ירידה בריכוז סידן זה גורמת לשינוי קונפורמציה בחלבונים המעורבים באיטום של הגדר, מה שמוביל לעלייה של שטף paracellular. כדי לחקות את האפקט הזה סידן chelator אתילן גליקול-BIS (האתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', חומצת N'-טטרה אצטית (EGTA) שימשה בmonolayer של תאים הידועים להיות נציג של מערכת העיכול. שיטות שונות כדי לזהות את ההפרעה של רקמת המכשול שכבר קיימות, כגון מבחני immunofluorescence וחדירות. עם זאת, שיטות אלו גוזלות זמן ויקר ואינו מתאימים למדידות דינמיות או תפוקה גבוהה. שיטות אלקטרוניות למדידת רקמות מחסוםשלמות קיימת גם למדידת התנגדות transepithelial (TER), אולם אלה הם בדרך כלל יקרים ומורכבים. פיתוח שיטות מהירים, זולות, ורגישות יש צורך דחוף בשלמות רקמת מכשול הוא פרמטר מרכזי בגילוי סמים ואבחון הפתוגן / רעלן. טרנזיסטור האורגני אלקטרוכימיים (OECT) משולב עם רקמת מחסום יוצרת תאים הוכח כמכשיר חדש מסוגל דינמי ניטור שלמות רקמות מכשול. המכשיר הוא מסוגל למדוד וריאציות דקות בשטף היוני עם רזולוציה של זמן חסר תקדים וברגישות, בזמן אמת, כמדד לשלמות רקמות מכשול. שיטה חדשה זה מבוססת על מכשיר פשוט שיכול להיות תואם עם יישומי הקרנת תפוקה גבוהה ומפוברקות בעלות נמוכה.

Introduction

אפיתל במערכת העיכול הוא דוגמא של רקמת מכשול, אשר שולטת במעבר של מולקולות בין תאים שונים בגוף. האפיתל מורכב מתאי עמודים מוארכים חברו יחד על ידי קומפלקסים של חלבונים המספקים מכשול פיזי 1 נגד פתוגנים ורעלים, תוך מתן אפשרות למעבר של מים וחומרים מזינים הדרושים כדי לקיים את הגוף. סלקטיביות זאת בשל הקיטוב של תאי אפיתל, אשר יוצר שני תחומים קרום שונים: בצד apical של התאים שנחשפו ללום והן בצד הבסיסי של התאים מעוגנים על הרקמות הבסיסיות 2,3. צמתים הדוקים (TJ) הם קומפלקסים של חלבונים המצויים בחלק הפסגה של תאי האפיתל ומהווים חלק ממכלול גדול יותר הידוע בשם צומת הפסגה 4. זרימת יונים על פני רקמת המחסום עשויה גם ללכת דרך transcellular (באמצעות הסלולרי) או באמצעות paracellular (בין שני תאים סמוכים) מסלול. הסכום שלהתחבורה באמצעות שני המסלולים שמכונה התנגדות transepithelial. צומת הפסגה אחראית על הרגולציה של יונים ומולקולות עוברות על פני המחסום 5,6 דרך פתח ספציפי ותפקוד סוגר. חוסר תפקוד או שיבוש של קומפלקסי חלבונים אלה קשורים לעתים קרובות למחלה 7-11. בנוסף, רבים פתוגנים / רעלים enteric ידועים למקד מורכב זה באופן ספציפי, ובכך להיכנס לגוף ומוביל לשלשולים, סביר להניח כתוצאה של חוסר ויסות מסיבית של זרימת יונים / מים על פני המחסום 12-14. רקמת גדר יכולה גם להיות שונה על ידי שינוי microenvironment תאי. Cadherin הוא חלבון חיוני להידבקות תאי תאים, והוא מעורב ביצירת צומת הפסגה. סידן נדרש לקונפורמציה המבנית הנכונה של cadherin, וירידה בסידן תאי הוכח לגרום להרס של צומת תאי תאים ופתיחה הבאה שלמסלול paracellular בין התאים 15. במחקר זה, EGTA (גליקול-BIS אתילן (בטא aminoethyl אתר)-N, N, N ', חומצה אצטית N'-טטרה), chelator סידן ספציפי, היה בשימוש כדי לגרום להפרה ברקמת מכשול, שכן יש הוכח יש השפעה מהירה ודרסטית על paracellular יון לזרום 16,17. chelator סידן זה היה בשימוש על מחוברות וmonolayer המובחן של תא אונליין קאקו-2. בתרבית מוסיף תרבית תאים, קו תא זה ידוע לפתח את המאפיינים של מערכת העיכול ונמצא בשימוש נרחב על ידי תעשיית התרופות כדי לבדוק את הספיגה של תרופות 18,19.

שיטות לניטור שלמות רקמות מחסום נמצאות בשפע. שיטות אלה הן בדרך כלל אופטיות, בהסתמך על מכתים immunofluorescence של חלבונים מסוימים הידועים להיות בצומת הפסגה 20, או להסתמך על הכימות של מולקולה נותב ניאון שהיא בדרך כלל בלתי חדיר לרקמות המחסום21,22. עם זאת, שיטות ללא תווית (כלומר ללא fluorophore / כרומופור) עדיפות כמו השימוש בתווית יכולה להיגרם חפצים, ולעתים קרובות מגדיל את העלות וassay הזמן. ניטור של רקמת מחסום חשמלי, ללא תווית התפתחה לאחרונה כשיטת מעקב דינמית 23. לדוגמא התקדמות טכנולוגית האחרונה בספקטרוסקופיה עכבה החשמלית אפשרה הפיתוח של מכשירים לסריקה זמינים מסחרי 24,25 שיכול למדוד את התנגדות transepithelial (TER), מדידה של מוליכות יונים על פני שכבת התאים.

אלקטרוניקה אורגנית יצרה הזדמנות ייחודית להתממשק העולם של מוצרי אלקטרוניקה וביולוגיה 26,27 28,29 באמצעות פולימרים מוליכים שיכול לנהל שתי נושאות אלקטרוניות ויוניות. שיטה חדשה לאיתור פרצות ברקמת מחסום באמצעות 30-32 OECT הוצגה לאחרונה. מכשיר זה היה תוקף כנגד טכניקות הקיימותed להעריך שלמות מחסום רקמות, כולל immunofluorescence, מבחני חדירות באמצעות לוציפר צהוב, וספקטרוסקופיה עכבה באמצעות Cellzscope. במקרה של כל התרכובות הרעילות שנבדקו, OECT נמצא לפעול ברגישות שווה או טובה יותר, ועם רזולוציה של זמן מוגבר, בהשוואה לטכניקות שצוינה לעיל. במכשיר זה, PEDOT: PSS, פולימר ניצוח כי הוכח להיות יציב וביולוגי 33,34, משמש כחומר הפעיל בערוץ טרנזיסטור. OECT מורכב מאלקטרודות ניקוז והמקור משני צדי ערוץ פולימרים מוליכים. זה ממוקם אז במגע עם אלקטרוליט, המהווה חלק בלתי נפרד מהמכשיר. אלקטרודת שער היא שקועה בתוך אלקטרוליט (איור 1), וכאשר מתח שער חיובי מיושם בשער, קטיונים מאלקטרוליט נאלצים לתוך הערוץ, ובכך dedoping פולימר הניצוח וכתוצאה משינוי במקור הניקוז נוכחית. דevice לכן מאוד רגיש לשינויים של הרגע בשטף היוני בשל הגברה של טרנזיסטור. שכבת תאים גדלה על הוספת תרבית תאים הושמה בין האלקטרודה השער וערוץ הפולימרים המוליכים. הנוכחות של שכבת תאים שלמה משמשת כמחסום לקטיונים להיכנס לתוך פולימר הניצוח, ולכן, בנוכחות monolayer שלם, הירידות הנוכחיות הניקוז (איור 2: מעבר מהאזור לב). בנוכחות של תרכובת רעילה, רקמת מכשול בהדרגה לאבד את היושרה שלה, ומאפשרות קטיונים להיכנס לסרט הפולימרים והגדלת הנוכחי הניקוז (איור 2: אזור ג). בעזרת טכניקה זו, הפרה ברקמת מחסום נתפס על ידי האפנון של זרם הניקוז, המקביל למודולציה של השטף על פני השכבה. מכשיר זה מסוגל למדוד וריאציות דקות בשטף היוני עם רזולוציה חסרת תקדים של זמן ורגישות בזמן אמת. wil טכנולוגיה זוl להיות עניין בתחום של רעלים לבדיקות סמים, אבחון מחלה או מחקר בסיסי כמודל המחסום ניתן להתאים בקלות. שיטה זו גם תסייע להפחית את הניסויים בבעלי החיים, שכן היא מאפשרת האימות של במבחנה מודלים להחליף בבדיקות vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PEDOT: PSS פתרון הכנה

  1. 50 מיליליטר של PEDOT: PSS, להוסיף אתילן גליקול (מגביר מוליכות) ביחס נפח של 1:4 (אתילן גליקול לPEDOT: PSS), 0.5 μl / מיליליטר של חומצת Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) כחומרים פעילי שטח, ו10 מ"ג / מיליליטר 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) כמקשר צולב כדי לקדם את ההידבקות של פולימר הניצוח לשקופית הזכוכית.

2. ייצור OECT (איור 3)

  1. הגדרת אנשי קשר מקור ניקוז זהב התאדו תרמית באמצעות יתוגרפיה ההמראה:
    1. ספין photoresist מעיל בשקופית זכוכית נקייה רגילה ב3,000 סל"ד במשך 30 שניות. ממדי זכוכית הם 3 בx 1 פנימה
    2. להגדיר דפוסים ידי photolithography. ממדים עשויים להשתנות, עם זאת הממדים המפורטים כאן הוצגו להוביל לרגישות האופטימלית. לאחר מכן להשתמש במפתח.
    3. להתאדות ננומטר 5 ושל כרום וזהב 100 ננומטר, בהתאמה.
    4. המראת photoresist בacהאמבטיה אטון עבור שעה 1, ומשאירה את המצע עם שטח אנשי קשר Au רק המקור וניקוז.
  2. האורך הרצוי של PEDOT: ערוץ PSS הוא 1 מ"מ. זו מושגת על ידי דפוסי שימוש בטכניקה לתלישה parylene-C (Pa-C):
    1. טען 3.5 גרם של Pa-C בהתקנת הציפוי. באופן אחיד להתאדות 2 מיקרומטר של parylene-C על גבי המצע עם אנשי קשר של Au.
    2. תבנית הערוץ על ידי photolithography:
      1. ספין photoresist המעיל ב3,000 סל"ד במשך 30 שניות.
      2. השתמש במסכה כדי להאיר ערוץ ומגע זהב 20 שניות לUV, photoresist נחשף יהפוך מסיס במפתחים.
      3. השתמש במפתח כדי לפתוח את אזור הערוץ בphotoresist.
    3. לחרוט Pa-C באזור הערוץ על ידי צעד 15 דקות פלזמה (O 2 (50 SCCM) ו4 פרנק שוויצרי (פלזמה 3 SCCM) ב160 W) כדי לפתוח את הערוץ ואת מגעי הזהב.
  3. להפקיד את PEDOT: פתרון תערובת PSS על ידי ציפוי ספין ב500 סל"ד 45 שניות. אופים במשך 30 שניות ב110 ° C.
  4. מתקלף Pa-C כדי לחשוף את PEDOT: ערוץ PSS של המצע שמתחת. ערוץ זה צריך מעט חפיפה עם אנשי קשר Au נעשה בפרוטוקול 1.
  5. דגימות אופים במשך שעה 1 ב140 ° C בתנאים אטמוספריים.

3. עצרת מכשיר

  1. הפוך PDMS על ידי ערבוב שני פתרונות (מסופקים בדרך כלל יחד בערכה) ב1:10 יחס של ריפוי פתרון בפתרון בסיס. לאפות שעה 1 120 מעלות
  2. לעצב גם באמצעות ניקוב חורים ולחתוך ריבוע מסביב לאזור הרצוי.
  3. דבק PDMS גם על גבי הערוץ, להביא לאזור ערוץ בסך של כ 6 מ"מ 2. ודא כי מגעים המקור וניקוז אינם מכוסים.
  4. הפוך תמיכת פלסטיק עם חור בזה (ניתן להשתמש בבעל ללהכניס את תרבות תאים) ולאחר מכן להדביק אותו על גבי PDMS. תן לזה הלילה יבש.
  5. בדוק היטב שאין נזילה ידי prefilling עם ואטאה.
  6. הלחמה חוטי חשמל על קשר מקור ניקוז עם פח.

4. תרבית תאים

  1. הכן תקשורת תרבית תאים באופן הבא:
    1. בDMEM, להוסיף גלוטמין 1%, 10% שור סרום עוברי, 0.5% פניצילין, סטרפטומיצין, ו0.1% גנטמיצין.
    2. לעקר את תרבות התקשורת הסלולרי באמצעות מכשיר סינון סטרילי.
  2. לשמור על קאקו-2 תאים בין המעבר 49 ו68 על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2, בתקשורת ובתרבות תא.
  3. לחלק תאים פעם בשבוע באמצעות טריפסין וזרע ב1.5 x 10 4 תאים / להוסיף.
  4. שינוי בתקשורת תרבות תא פעמיים בשבוע במשך 3 שבועות.

5. מדידות עם OECT

  1. חבר חוט Ag / AgCl לSourceMeter לשימוש כאלקטרודת השער. לטבול את הקצה בתקשורת תרבית תאים, המשמשת כאלקטרוליט, כפי שמודגם באיור 1 א.
  2. חבר חוטים ממקור וניקוז כדי לאהוא SourceMeter (הגדרת ערוץ כפולה).
  3. החל מתח דופק ריבועים חיובי (V GS) בין השער והמקור (ששמש כאלקטרודה השוואתית: קרקע). מתח קבוע שלילי בין הניקוז והמקור (V DS) מוחל ונוכחי המתאימים (אני DS) נמדד.
  4. השתמש באיסוף נתוני תכנית הריצה מחשב. פרמטרים OECT נכנסו בתכנית רכישה מותאמת אישית צריכים להיות כדלקמן: V DS = -0.2 V, V GS = 0.3 V, על זמן = 2 שניות V GS, את הזמן = 28 שניות.
  5. קראו את זרם מקור ניקוז (אני DS) ושער הנוכחי (אני GS). לבצע את המדידה במשך כמה דקות על מנת להבטיח אות בסיס יציבה.

6. שילוב תאים עם OECT למדידה

הערה: לפני הניסוי, על שלמותה של שכבת התאים עשויה להיות מאומתת על ידי מדידת TER עם מכשיר ספקטרוסקופיה עכבה. TER של כל inse תא 3 שבועות הישנים קאקו-2rt צריך להיות מעל 400 Ω. 2 סנטימטר.

  1. במהלך פסק הזמן של מדידת OECT: הסר את אלקטרודת השער מאלקטרוליט, לשלב להכניס את תרבות תאים, ולהחליף את אלקטרודת השער בפנים להכניס את תרבות תאים.
  2. לבצע את מדידת קו בסיס עם התאים במשך כמה דקות על מנת להבטיח אות יציבה. בסיס זה ישמש כלחישוב הערך המנורמל המתאים לmonolayer שלם (0).

7. הכנה והקדמה של תרכובת רעילה

  1. הכן פתרון 1 M של EGTA במי DI, כדי להתאים את ה-pH של הפתרון ל7.4 עם בסיס טריס הראשון.
  2. הוספת פתרון EGTA בנפח המתאים כדי להשיג את הריכוז הרצוי (למשל בין 5 מ"מ ו100 מ"מ) תוך לקיחה בחשבון את עוצמת הקול. EGTA יש להוסיף בתא הבסיסי במהלך פסק הזמן.
  3. למדוד באופן רציף ל90 דקות כמו בפרוטוקול 5. אם המדידה היא being מתבצע בטמפרטורת חדר, את היציבות של התאים לא תישאר קבועה לאחר 90 דקות.
  4. בסופו של הדבר, לגרד את שכבת התאים לגרום להרס של שכבת המחסום ומידה כנגד 15 דקות שלמים, בשלב זה יכול להיעשות על ידי הסרת המסנן ולטבול את אלקטרודת השער בתקשורת. בסיס זה ישמש כלחישוב הערך המנורמל המתאים לmonolayer נהרס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך השלב הראשון של מדידה, הניקוז הנוכחי עשויים להשתנות במידה מסוימת, אבל ברוב המקרים זה צריך להישאר יציב (איור 2, חתך). אם האות אינו יציב, הטרנזיסטור אמור להיות מושלך והוחלף. בדיקת יציבות זו גם מבטיחה כי כל הפסדים ראשוניים במוליכות של המכשיר אינם משפיעים על המדידה שלאחר מכן. לאחר כמה דקות של מדידה, להכניס את עם תאי יוצרי רקמת המכשול מונח על גבי הערוץ. הנוכחי הניקוז צריך להקטין באופן מיידי (איור 2, סעיף ב '.). אם זרם הניקוז אינו פוחת, זה יכול להצביע על כך שהתאים לא תקין יצרו מכשול, או ניזוקו במהלך מניפולציה, והמסנן צריך להיות מושלך והוחלף. על ידי הוספת תרכובת רעילה לרקמות המכשול, האפנון של זרם הניקוז צריך להגדיל בהדרגה או באופן מיידי, בהתאם למתחם המשמש והריכוז (איור 2,סעיף ג.).

הנתונים נאספו באמצעות SourceMeter ותכנית רכישה מותאמת אישית. מתכנית זו פרמטרים שונים התקבלו, המנוהלים בתכנית ניתוח נתונים כדי להשיג את אמצע האפנון-מתאים לכל אחד דופק שער. אמצע האפנון תואם את הערך של הזרם באמצע השיא (איור 4). ערכי אמצע האפנון שהושגו במהלך החישה של monolayer שלם היו מנורמלים ל0 תוך אמצע האפנון מתקבל לאחר השריטה היה מנורמל 1. תוצאות מנורמלות משמשות כדי להשוות נתונים מהתקנים שונים (איור 5). מהנתונים אלה בתגובת המנה של ריכוזי הבדל של תרכובת רעילה לאורך זמן ניתן לראות.

איור 1
איור 1. סכמטי של אורגני אלקטרוכימי טרנזיסטור משולב עם הוספת תרבית תאים) ממבט מצד. ב) להציג לראש הערוץ (אפור) וקשר (ממדים צהובים) בשקופית זכוכית באורך ערוץ של 6 מ"מ ורוחב ערוץ של 1 מ"מ . נתון זה שונה מ30 Jimison.

איור 2
.. איור 2 סקירה כללית של מדידה באתרו של תגובה הנוכחית ניקוז לפולסים שער מרובעים לאורך זמן בתנאי מדידה הם: V DS = -0.2 V, V GS = 0.3 V, V GS על זמן = 2 שניות, פסק הזמן = 28 שניות.) מתאים OECT שהופעלו קודם לאינטגרציה עם תאים, כדי להבטיח את היציבות של המכשיר. ב) המתאים integמנה של רקמת המחסום יוצרת תאים, הבטחת אות יציבה שוב לפני תחילת בדיקה של תרכובת רעילה. ג) מקבילה לתוספת של EGTA לתאי רקמת מחסום, שים לב להתפתחות של האות לאורך זמן.

איור 3
איור 3. תהליכי ייצור של OECT. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. OECT לנקז תגובה נוכחית לדופק שער ריבוע אחד. מדוד תנאי ment הם כדלקמן: V DS = -0.2 V, V GS = 0.3 V, V GS על זמן = 2 שניות, פסק הזמן = תאי 28 שניות.) תגובת מעבר OECT לפני (קו מקווקו) ואחרי (קו כחול) התוספת של רקמת מחסום יוצרים גדל על מסנן. ב) תגובת מעבר OECT לאחר התוספת של תרכובת רעילה ברקמות מכשול (קו כתום) וללא רקמות מכשול (קו מקווקו).

איור 5
איור 5. תוצאה מנורמלת טיפוסית מOECT. התגובה המנורמלת של OECT על מבוא של מכשיר (עיגול ריק), שכבת תאים (צלב שחור), 5 מ"מ EGTA (העיגול הכחול כהה) ו10 מ"מ EGTA (עיגול ציאן) הציגה ב t = 0, נמדדו על פני תקופה של 50 דקות.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקה זו מספקת שיטה חדשה לשילוב טרנזיסטור אלקטרוכימיים אורגני עם תאי חיים כדי למדוד שלמות רקמות מכשול. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם המהירות ורגישות, אלא גם את העלות הנמוכה של המכשיר לניטור דינמי של רקמת מכשול.

כמו בשיטה זו משתמשת בתאים חיים, נקודה קריטית היא כדי להיות בטוח לשימוש monolayer, המייצג את שכבת מחסום ללא פגע. הפרמטרים של הגדר צריכים להיות מוגדרים באפיון של הקו הסלולרי. לכן זה חיוני שלא לפגוע בשכבת התאים כאשר אלקטרודת השער היא שקועה באלקטרוליט על גבי שכבת התאים.

נקודה חשובה נוספת היא הייצור של המכשיר; דליפה לא צריכה להתרחש בין הקצה של PDMS ובעל הפלסטיק כדי למנוע וריאציה נפח נוזל. על מנת להשיג תוצאות לשחזור, תשומת לב צריכה להינתן גם להלחמה של החוט, כמושריפת האלקטרודה הזהב תגרום עני / אין קשר עם ערוץ הפולימרים המוליך וכך עני / אין אות.

כדי להקל על הניתוח וכדי להשיג תוצאות טובות יותר עיכוב דקות ספורים בין כל שלב של הניסוי צריך להיות מותר למכשיר כדי לייצב בין שלבים. כוריאציה של האות מהמכשיר למכשיר הוא ציין, נורמליזציה של תוצאות נדרש כדי להיות מסוגל להשוות את התוצאות של כל ניסוי. עם זאת, בעתיד ייצור בקנה מידה גדולה יותר של המכשיר יאפשר שחזור מכשיר מכשיר גדול יותר.

המגבלה העיקרית של הטכניקה היא את הפורמט, כמו לרגע אחד בלבד מדגם ניתן למדוד. זה ייפתר בקרוב על ידי הפיתוח של חיישן multiacquisition ובעתיד יצירת תבנית צלחת 96 היטב. הפעולה זו תפתח את הדרך לטכניקה זו לשימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של רקמת מכשול. במקביל, התקנים מישוריים הם גם תחת t פיתוחo מאפשר מדידות אופטיות ואלקטרוניות בו זמנית.

לסיכום, מכשיר חדש שיכול להיות מפוברק במחיר נמוך כי הוא מסוגל ניטור ללא תווית של רקמת מכשול כבר מפותח. מכשיר זה מראה רגישות רבה יותר ורזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר מאשר שיטות קיימות. שילוב של במבחנה מודלים עם מכשירים כגון OECT יכול להיות אלטרנטיבה מצוינת לניסויים בבעלי חיים לתרופה לגלות ורעלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

פרויקט זה נתמך על ידי FP7-People-2009-RG, מארי קירי פרויקט מס 256,367 (CELLTOX) וההצעה האירופית המועצה למחקר ERC-2010-STG לא 258,966 (IONOSENSE), כמו גם מענק משותף מConseil האזורי דה פרובאנס אלפ קוט ד 'אזור וCDL פארמה לST. אנו מודים לג'ורג' Malliaras לדיונים שימושיים הנוגעים לעיצוב OECT ותפקוד.

Acknowledgements

המחברים של מאמר זה אין לי שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clevios pH 1000 Heraus Clevios
AZ9260 resin Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore Dominique Dutscher 51705
24-well Cell culture plate BD Falcon Dominique Dutscher 51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM Dominique Dutscher 51246
Advanced DMEM Marque GIBCO Fisher Scientific E3434T
FBS Heat Inact. Fisher Scientific E3387M
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific E3470C
GlutaMAX Fisher Scientific E3524T
Trypsin 0.05% EDTA Fisher Scientific E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma Aldrich E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%, Sigma Aldrich
Caco-2 cells ATCC
PDMS Dow Corning SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%) NEYCO AU3X6
Chromium (99.95%) NEYCO
Parylene C Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire Harvard Apparatus
Photoresist Cipec Specialties

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
  3. Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
  4. Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
  5. Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
  6. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
  7. Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
  8. Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
  9. Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
  10. Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
  11. Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
  12. Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex--news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
  13. Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
  14. Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
  15. Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
  16. Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
  17. Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
  18. Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
  19. Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
  20. Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
  21. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
  22. Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
  23. Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
  24. Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
  25. Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
  26. Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. (2010).
  27. Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
  28. White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole - Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
  29. Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
  30. Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
  31. Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
  32. Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
  33. Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. 1556-1557 (2004).
  34. Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics