एक कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर के साथ बैरियर ऊतक व्यवधान के सेंसिंग

1Department of Bioelectronics, Ecole Nationale Superieure des Mines, 2Research and Exploratory Development Division, Applied Physics Laboratory, Johns Hopkins University
Bioengineering

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Summary

कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर जीवित कोशिकाओं के साथ एकीकृत और जठरांत्र उपकला बाधा पार आयन प्रवाह की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. इस अध्ययन में, कैल्शियम chelator EGTA (इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक की मौजूदगी से प्रेरित तंग जंक्शनों के विघटन से संबंधित आयन प्रवाह में वृद्धि हुई है, एसिड), मापा जाता है.

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Tria, S. A., Ramuz, M., Jimison, L. H., Hama, A., Owens, R. M. Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor. J. Vis. Exp. (84), e51102, doi:10.3791/51102 (2014).

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Abstract

जठरांत्र पथ आवश्यक आयनों और अणुओं के पारित होने की अनुमति है, जबकि रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के प्रवेश के खिलाफ एक शारीरिक बाधा प्रदान करता है कि बाधा ऊतक का एक उदाहरण है. इस बाधा में एक दरार कोशिकी कैल्शियम एकाग्रता में कमी की वजह से हो सकता है. कैल्शियम एकाग्रता में यह कमी paracellular प्रवाह की वृद्धि करने के लिए अग्रणी, बाधा की सीलिंग में शामिल प्रोटीन में एक गठनात्मक परिवर्तन का कारण बनता है. इस आशय की नकल करने के लिए कैल्शियम chelator इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक एसिड (EGTA) जठरांत्र संबंधी मार्ग के प्रतिनिधि होने के लिए जाना जाता है कोशिकाओं की एक monolayer पर इस्तेमाल किया गया था. बाधा ऊतक के विघटन का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीकों पहले से ही इस तरह के immunofluorescence और पारगम्यता assays के रूप में मौजूद हैं. हालांकि, इन तरीकों समय लेने वाली और महंगा और गतिशील या उच्च throughput माप के लिए उपयुक्त नहीं हैं. बाधा ऊतक को मापने के लिए इलेक्ट्रॉनिक तरीकेअखंडता भी transepithelial (प्रतिरोध TER) की माप के लिए मौजूद है, लेकिन ये अक्सर महंगा और जटिल हैं. बाधा ऊतक की अखंडता दवाओं की खोज और रोगज़नक़ / विष निदान में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में है, तेजी से सस्ता है, और संवेदनशील तरीके से विकास की तत्काल जरूरत है. बाधा ऊतक कोशिकाओं के गठन के साथ एकीकृत जैविक विद्युत ट्रांजिस्टर (OECT) गतिशील बाधा ऊतक अखंडता की निगरानी करने में सक्षम एक नई डिवाइस के रूप में दिखाया जा चुका है. डिवाइस बाधा ऊतक अखंडता का एक संकेतक के रूप में वास्तविक समय में, अभूतपूर्व अस्थायी समाधान और संवेदनशीलता के साथ ईओण प्रवाह में मिनट विविधताओं को मापने के लिए सक्षम है. इस नई विधि उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के साथ संगत और कम लागत पर निर्मित किया जा सकता है कि एक साधारण उपकरण पर आधारित है.

Introduction

जठरांत्र उपकला शरीर के विभिन्न डिब्बों के बीच अणुओं के पारित होने को नियंत्रित करता है जो बाधा ऊतक का एक उदाहरण है. पानी और शरीर को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की यात्रा की अनुमति है, जबकि उपकला, रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा 1 प्रदान कि प्रोटीन के परिसरों से एक साथ शामिल हो गए लम्बी स्तंभ कोशिकाओं के होते हैं. लुमेन और अंतर्निहित ऊतकों 2,3 पर लंगर कोशिकाओं के बेसल पक्ष को उजागर कोशिकाओं के शिखर की ओर: इस चयनात्मकता दो अलग झिल्ली डोमेन बनाता है जो उपकला कोशिकाओं के ध्रुवीकरण के कारण है. तंग जंक्शनों (टीजे) उपकला कोशिकाओं के शिखर भाग में मौजूद प्रोटीन के परिसरों हैं और शिखर जंक्शन 4 के रूप में जाना एक बड़ा जटिल का हिस्सा हैं. बाधा ऊतक भर आयन प्रवाह (सेल) के माध्यम से transcellular के माध्यम से या (दो सन्निकट कक्षों के बीच) एक paracellular मार्ग के माध्यम से जा सकते हैं या तो. योग कादोनों रास्ते के माध्यम से परिवहन transepithelial प्रतिरोध के रूप में जाना जाता है. शिखर जंक्शन आयनों और एक विशिष्ट उद्घाटन और समापन समारोह के माध्यम से बाधा 5,6 भर गुजर अणुओं के विनियमन के लिए जिम्मेदार है. इन प्रोटीन परिसरों की शिथिलता या विघटन अक्सर बीमारी 7-11 से संबंधित है. इसके अलावा, कई आंतों रोगजनकों / विषाक्त पदार्थों बाधा 12-14 भर आयन / पानी के प्रवाह के लिए बड़े पैमाने पर अनियंत्रण का एक परिणाम के रूप में सबसे अधिक संभावना है, जिससे शरीर में प्रवेश करने और दस्त के लिए अग्रणी, विशेष रूप से इस जटिल लक्षित करने के लिए जाना जाता है. बैरियर ऊतक भी बाह्य microenvironment बदलकर संशोधित किया जा सकता है. Cadherin सेल सेल आसंजन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है, और शिखर जंक्शन के गठन में शामिल है. कैल्शियम cadherin के सही संरचनात्मक रचना के लिए आवश्यक है, और बाह्य कैल्शियम में कमी सेल सेल जंक्शन के विनाश और के एक बाद उद्घाटन में परिणाम दिखाया गया हैकोशिकाओं के बीच 15 paracellular मार्ग. यह है के रूप में इस अध्ययन में, EGTA (इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (बीटा aminoethyl ईथर) एन, एन, एन, 'n' टेट्रा एसिटिक एसिड), एक विशिष्ट कैल्शियम chelator, बाधा ऊतक में एक दरार उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था आयन 16,17 प्रवाह paracellular पर एक तेजी से और कठोर प्रभाव है दिखाया गया. यह कैल्शियम chelator Caco -2 सेल लाइन का एक मिला हुआ है और विभेदित monolayer पर इस्तेमाल किया गया था. सेल संस्कृति आवेषण में सुसंस्कृत, इस सेल लाइन जठरांत्र संबंधी मार्ग की विशेषताओं को विकसित करने के लिए जाना जाता है और व्यापक रूप से दवाओं 18,19 के अवशोषण परीक्षण करने के लिए दवा उद्योग द्वारा प्रयोग किया जाता है.

बाधा ऊतक अखंडता पर नजर रखने के तरीके बहुतायत से हैं. इन विधियों शिखर जंक्शन 20 में हो जाना विशेष प्रोटीन के immunofluorescence धुंधला पर निर्भर है, या बाधा के ऊतकों को सामान्य रूप से अभेद्य है कि एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर अणु की मात्रा का ठहराव पर निर्भर है, अक्सर ऑप्टिकल हैं21,22. एक लेबल का उपयोग कलाकृतियों उठाना, और अक्सर लागत और परख समय बढ़ सकते हैं लेकिन, जैसा कि (यानी एक fluorophore / क्रोमोफोर के बिना) लेबल से मुक्त तरीकों बेहतर कर रहे हैं. बाधा ऊतक के विद्युत, लेबल मुक्त निगरानी हाल ही में एक गतिशील निगरानी पद्धति के रूप में 23 में उभरा है. उदाहरण के लिए बिजली के प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी में हाल ही में तकनीकी विकास transepithelial प्रतिरोध (आतंकवाद), सेल परत भर आयन प्रवाहकत्त्व की एक माप उपाय कर सकते हैं कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्कैनिंग तंत्र 24,25 के विकास की अनुमति दी है.

कार्बनिक इलेक्ट्रॉनिक्स इलेक्ट्रॉनिक और ईओण वाहक दोनों का संचालन कर सकते हैं कि पॉलिमर आयोजित उपयोग करके इलेक्ट्रॉनिक्स और जीव विज्ञान 26,27 28,29 की दुनिया इंटरफेस करने के लिए एक अनूठा अवसर पैदा कर दी है. OECT 30-32 का उपयोग बाधा ऊतक में उल्लंघनों का पता लगाने के लिए एक नई तकनीक हाल ही में शुरू की गई थी. इस डिवाइस मौजूदा तकनीक हमारे खिलाफ मान्य किया गया थाCellzscope का उपयोग लूसिफ़ेर पीला उपयोग कर immunofluorescence, पारगम्यता assays सहित बाधा ऊतक अखंडता, और प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी का आकलन करने के लिए एड. परीक्षण सभी विषाक्त यौगिकों के मामले में, OECT बराबर या बेहतर संवेदनशीलता के साथ काम करने के लिए मिला है, और ऊपर तकनीकों वृद्धि की तुलना में अस्थायी समाधान के साथ किया गया था. इस उपकरण में, PEDOT: पी एस एस, स्थिर और 33,34 biocompatible होना दिखाया गया है कि एक आयोजन बहुलक, ट्रांजिस्टर चैनल में सक्रिय सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है. OECT एक आयोजन बहुलक चैनल के दोनों तरफ नाली और स्रोत इलेक्ट्रोड से बना है. यह तो डिवाइस का एक अभिन्न हिस्सा है, जो एक इलेक्ट्रोलाइट के साथ संपर्क में रखा गया है. एक फाटक इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोलाइट (चित्रा 1) में डूब जाता है, और एक सकारात्मक फाटक वोल्टेज गेट पर लागू किया जाता है, जब इलेक्ट्रोलाइट से फैटायनों इस प्रकार का आयोजन बहुलक dedoping और स्रोत नाली में एक परिवर्तन के परिणामस्वरूप, चैनल के लिए मजबूर कर रहे हैं वर्तमान. डीevice इस प्रकार के कारण ट्रांजिस्टर द्वारा प्रवर्धन को आयनिक प्रवाह में मिनट में परिवर्तन के प्रति बेहद संवेदनशील है. एक सेल संस्कृति डालने पर हो एक सेल परत गेट इलेक्ट्रोड और आयोजन बहुलक चैनल के बीच रखा गया था. एक अक्षुण्ण सेल परत की उपस्थिति, नाली वर्तमान कम हो जाती है (: क्षेत्र में एक से बी करने के लिए संक्रमण चित्रा 2) फैटायनों एक अक्षुण्ण monolayer की उपस्थिति में, इसलिए, आयोजन बहुलक में प्रवेश के लिए बाधा के रूप में कार्य करता है. एक विषाक्त यौगिक की उपस्थिति में, बाधा ऊतक उत्तरोत्तर फैटायनों बहुलक फिल्म में प्रवेश दे और (: क्षेत्र सी चित्रा 2) नाली वर्तमान में वृद्धि, इसकी अखंडता खो देंगे. इस तकनीक के साथ, बाधा ऊतक में भंग monolayer भर में प्रवाह की मॉडुलन के लिए इसी नाली वर्तमान के मॉडुलन द्वारा देखा जाता है. इस उपकरण के वास्तविक समय में अभूतपूर्व अस्थायी समाधान और संवेदनशीलता के साथ ईओण प्रवाह में मिनट विविधताओं को मापने के लिए सक्षम है. यह तकनीक wilएल औषधि परीक्षण, रोग निदान या बाधा मॉडल को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में बुनियादी अनुसंधान के लिए विष विज्ञान के क्षेत्र में ब्याज की हो. इस विधि को भी यह इन विट्रो मॉडल का सत्यापन विवो परीक्षण में बदलने के लिए अनुमति देता है के रूप में, पशु प्रयोग को कम करने में मदद मिलेगी.

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Protocol

1. PEDOT: पी एस एस समाधान तैयार

  1. PEDOT की 50 मिलीलीटर: (PEDOT को इथाइलीन ग्लाइकॉल: पीएसएस) पीएसएस, इथाइलीन ग्लाइकॉल (चालकता बढ़ जाती है) 01:04 का अनुपात मात्रा में जोड़ने के लिए, 0.5 μl / एक surfactant रूप Dodecylbenzenesulfonic एसिड (DBSA) की मिलीग्राम, 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर गिलास स्लाइड के लिए आयोजन बहुलक के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए एक पार linker के रूप में 3 glycidoxypropyltrimethoxysilane (Gops).

2. OECT निर्माण (चित्रा 3)

  1. लिफ्ट बंद लिथोग्राफी के माध्यम से thermally सुखाया सोने स्रोत और नाली संपर्क परिभाषित करें:
    1. 30 सेकंड के लिए 3000 rpm पर एक सामान्य साफ कांच स्लाइड पर कोट photoresist स्पिन. ग्लास आयाम इंच x 1 में 3 रहे हैं
    2. फोटोलिथोग्राफी द्वारा पैटर्न को परिभाषित करें. आयाम हालांकि यहां सूचीबद्ध आयाम इष्टतम संवेदनशीलता के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाए गए थे, बदला जा सकता है. फिर एक डेवलपर का उपयोग करें.
    3. क्रमशः, 5 एनएम और क्रोमियम और सोने के 100 एनएम लुप्त हो जाना.
    4. लिफ्ट बंद photoresist एक एसी मेंस्रोत और नाली केवल Au संपर्कों क्षेत्र के साथ सब्सट्रेट छोड़ने 1 घंटे के लिए Etone स्नान,.
  2. PEDOT की इच्छित लंबाई: पी एस एस चैनल 1 मिमी है. यह एक parylene सी (PA-सी) छील बंद तकनीक का उपयोग patterning द्वारा हासिल की है:
    1. कोटिंग सेटअप में पा सी की 3.5 ग्राम लोड करें. समान रूप से Au संपर्कों के साथ सब्सट्रेट के शीर्ष पर parylene सी के 2 माइक्रोन लुप्त हो जाना.
    2. पैटर्न फोटोलिथोग्राफी द्वारा चैनल:
      1. 30 सेकंड के लिए 3000 rpm पर कोट photoresist स्पिन.
      2. यूवी के लिए चैनल और सोना संपर्क 20 सेकंड रोशन करने के लिए एक मुखौटा का उपयोग, उजागर photoresist डेवलपर में घुलनशील बन जाएगा.
      3. Photoresist पर चैनल क्षेत्र को खोलने के लिए डेवलपर का प्रयोग करें.
    3. के चैनल और सोना संपर्क खोलने के क्रम में एक 15 मिनट प्लाज्मा कदम (ओ 2 (50 SCCM) और CHF 4 160 डब्ल्यू पर (3 SCCM) प्लाज्मा) द्वारा चैनल क्षेत्र में पा सी खोदना.
  3. स्पिन कोटिंग में से पीएसएस मिश्रण समाधान: PEDOT जमा45 सेकंड के लिए 500 आरपीएम. 110 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंकना
  4. पील बंद पा सी PEDOT प्रकट करने के लिए: नीचे सब्सट्रेट के पी एस एस चैनल. इस चैनल थोड़ा प्रोटोकॉल 1 में बनाया Au संपर्क के साथ ओवरलैप चाहिए.
  5. वायुमंडलीय परिस्थितियों में 140 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेंकना नमूनों.

3. विधानसभा डिवाइस

  1. आधार समाधान में समाधान के इलाज का एक अनुपात 1:10 पर (आमतौर पर एक किट में एक साथ आपूर्ति) दो समाधान के मिश्रण से PDMS बनाओ. 120 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेंकना
  2. एक छेद पंच का उपयोग करके अच्छी तरह से डिजाइन और वांछित क्षेत्र के चारों ओर एक वर्ग में कटौती.
  3. लगभग 6 मिमी 2 के एक चैनल के क्षेत्र में परिणाम के लिए, चैनल के शीर्ष पर अच्छी तरह से एक PDMS गोंद. स्रोत और नाली संपर्क कवर नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  4. इस में एक छेद (सेल संस्कृति डालने के धारक उपयोग कर सकता है) के साथ एक प्लास्टिक का समर्थन कर और फिर PDMS की चोटी पर गोंद. सूखी रातोंरात यह करते हैं.
  5. वाट के साथ prefilling द्वारा लीक करने के लिए अच्छी तरह से परीक्षणएर.
  6. टिन के साथ स्रोत और नाली संपर्क पर बिजली के तार मिलाप.

4. सेल संस्कृति

  1. इस प्रकार के रूप में सेल संस्कृति मीडिया तैयार:
    1. DMEM में, 1% Glutamine, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.5% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.1% Gentamicin जोड़ें.
    2. एक बाँझ फिल्टर डिवाइस का उपयोग सेल संस्कृति मीडिया जीवाणुरहित.
  2. सेल संस्कृति मीडिया में, 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर पारित होने के 49 और 68 के बीच Caco -2 कोशिकाओं को बनाए रखें.
  3. 10 x 4 कोशिकाओं / डालने 1.5 पर trypsin और बीज का उपयोग कर एक बार एक सप्ताह कोशिकाओं के विभाजन.
  4. 3 सप्ताह से अधिक दो बार एक सप्ताह सेल संस्कृति मीडिया बदलें.

5. OECT साथ माप

  1. फाटक इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल के लिए एक SourceMeter को एक एजी / AgCl तार कनेक्ट. चित्रा 1 ए में सचित्र के रूप में, इलेक्ट्रोलाइट के रूप में प्रयोग किया जाता है जो सेल संस्कृति मीडिया में टिप को विसर्जित कर दिया.
  2. टी के लिए स्रोत और नाली से तारों कनेक्टवह (दोहरी चैनल सेटअप) SourceMeter.
  3. एक वर्ग पल्स सकारात्मक वोल्टेज (: जमीन संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल) गेट और स्रोत के बीच (वी जी एस) लागू करें. नाली और स्रोत (वी डी एस) के बीच एक नकारात्मक लगातार वोल्टेज लागू किया जाता है और इसी वर्तमान (मैं डी एस) मापा जाता है.
  4. एक पीसी चल रहे कार्यक्रम डेटा संग्रह का उपयोग करें. के रूप में निम्नानुसार एक स्वनिर्धारित अधिग्रहण कार्यक्रम में प्रवेश किया OECT मापदंडों होना चाहिए: वी डी एस = -0.2 वी, वी जी एस = 0.3 वी, वी जी एस समय पर = 2 सेकंड, समय बंद = 28 सेकंड.
  5. स्रोत नाली वर्तमान (मैं डी एस) और फाटक वर्तमान (मैं जी एस) बाहर पढ़ें. एक स्थिर आधारभूत संकेत सुनिश्चित करने के लिए कई मिनट के लिए माप ले.

6. मापन के लिए OECT साथ कोशिकाओं का घालमेल

नोट: प्रयोग करने से पहले, सेल परत की अखंडता एक प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी डिवाइस के साथ आतंकवाद को मापने के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. प्रत्येक तीन सप्ताह पुरानी Caco -2 सेल INSE के आतंकवादRT 400 Ω से ऊपर होना चाहिए. 2 सेमी.

  1. OECT माप के बंद समय के दौरान:, इलेक्ट्रोलाइट से गेट इलेक्ट्रोड निकालें सेल संस्कृति डालने शामिल है, और सेल संस्कृति डालने के अंदर गेट इलेक्ट्रोड जगह.
  2. एक स्थिर संकेत सुनिश्चित करने के लिए कई मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ एक आधारभूत माप ले. इस आधारभूत एक अक्षुण्ण monolayer (0) को इसी सामान्यीकृत मूल्य की गणना के लिए के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.

7. तैयारी और विषाक्त यौगिक का परिचय

  1. पहले Tris आधार के साथ 7.4 के समाधान का पीएच समायोजन, डि पानी में EGTA के एक 1 एम समाधान तैयार करें.
  2. खाते में मात्रा लेने (जैसे 5 मिमी और 100 मिमी के बीच) वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में EGTA समाधान जोड़ें. EGTA छुट्टी दौरान बेसल चैम्बर जोड़ा जा चाहिए.
  3. प्रोटोकॉल 5 के रूप में 90 मिनट के लिए लगातार उपाय. माप बी है तोएनजी कमरे के तापमान पर, कोशिकाओं की स्थिरता में 90 मिनट के बाद लगातार नहीं रह जाएगा बाहर किया.
  4. चलाने के अंत में, इस बिंदु फिल्टर को दूर करने और मीडिया में गेट इलेक्ट्रोड डुबो द्वारा किया जा सकता है 15 मिनट के लिए अवरोध परत और माप की एक पूर्ण विनाश में परिणाम के लिए सेल परत खरोंच. इस आधारभूत एक नष्ट monolayer को इसी सामान्यीकृत मूल्य की गणना के लिए के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.

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Representative Results

माप के पहले चरण के दौरान, नाली वर्तमान में कुछ हद तक भिन्न हो सकते हैं, लेकिन ज्यादातर मामलों में यह (चित्रा 2, खंड एक) स्थिर रहना चाहिए. संकेत स्थिर नहीं है, ट्रांजिस्टर त्याग और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. यह स्थिरता की जांच भी डिवाइस की चालकता में किसी भी प्रारंभिक घाटे बाद माप को प्रभावित नहीं करते कि यह सुनिश्चित करता है. माप के कई मिनट के बाद, कोशिकाओं बाधा ऊतक के गठन के साथ सम्मिलित चैनल के शीर्ष पर रखा गया है. नाली वर्तमान तुरंत (चित्रा 2, खंड बी.) में कमी करनी चाहिए. नाली वर्तमान में कमी नहीं होती है, तो यह कोशिकाओं को सही ढंग से एक बाधा गठन नहीं किया है, या जोड़ - तोड़ के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए थे, और फिल्टर त्याग और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए कि दर्शा सकता है. बाधा ऊतक के लिए एक विषाक्त यौगिक जोड़कर, नाली वर्तमान की मॉडुलन, इस्तेमाल किया यौगिक और एकाग्रता (चित्रा 2 पर निर्भर करता है, उत्तरोत्तर या तुरंत वृद्धि करनी चाहिएखंड सी.).

डेटा एक SourceMeter और एक स्वनिर्धारित अधिग्रहण कार्यक्रम का उपयोग कर एकत्र किए गए थे. इस कार्यक्रम से अलग मापदंडों प्रत्येक गेट नाड़ी को इसी मध्य मॉडुलन प्राप्त करने के लिए एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में चलाए जा रहे हैं, जो प्राप्त किया गया. मध्य मॉडुलन चोटी के मध्य (चित्रा 4) पर वर्तमान के मूल्य से मेल खाती है. खरोंच के बाद प्राप्त मध्य मॉडुलन 1 के लिए सामान्यीकृत थे जबकि एक अक्षुण्ण monolayer के संवेदन के दौरान प्राप्त मध्य मॉडुलन मान 0 के लिए सामान्यीकृत थे. सामान्यीकृत परिणाम विभिन्न उपकरणों से डेटा (चित्रा 5) की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है. आंकड़ों से यह समय के साथ विषाक्त यौगिक का अंतर सांद्रता की खुराक प्रतिक्रिया देखा जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर के योजनाबद्ध सेल संस्कृति एक तरफ देखने से सम्मिलित एक) चैनल की. ख) ऊपर देखें) (ग्रे और संपर्क 6mm और 1 मिमी के चैनल चौड़ाई का एक चैनल लंबाई के साथ एक गिलास स्लाइड पर (पीला) आयामों के साथ एकीकृत . यह आंकड़ा Jimison 30 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 2
.. समय के साथ वर्ग गेट दालों को पानी चालू प्रतिक्रिया की सीटू माप में चित्रा 2 अवलोकन माप की स्थिति इस प्रकार हैं: वी डी एस = -0.2 वी, वी जी एस = 0.3 वी, वी जी एस समय = 2 सेकंड पर, समय बंद = 28 सेकंड. एक) OECT से मेल खाती डिवाइस की स्थिरता सुनिश्चित करने, कोशिकाओं के साथ एकीकरण से पहले संचालित. ख) से मेल खाती है integकोशिकाओं के गठन बाधा ऊतक, फिर विषाक्त यौगिक का परीक्षण. ग) शुरू होने से पहले एक स्थिर संकेत सुनिश्चित करने का राशन, बाधा ऊतक कोशिकाओं को EGTA के अलावा से मेल खाती है समय के साथ संकेत के विकास पर ध्यान दें.

चित्रा 3
चित्रा 3. OECT की निर्माण प्रक्रियाओं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. OECT एक एकल वर्ग गेट नाड़ी को वर्तमान प्रतिक्रिया नाली. उपाय के रूप में निम्नानुसार बयान शर्तें हैं: वी डी एस = -0.2 वी, वी जी एस = 0.3 वी, वी जी एस समय = 2 सेकंड पर, समय बंद = बाधा ऊतक के अलावा (धराशायी लाइन) से पहले और (ब्लू लाइन) के बाद 28 सेकंड. एक) OECT क्षणिक प्रतिक्रिया बनाने कोशिकाओं एक बाधा ऊतक (नारंगी रेखा) पर विषाक्त यौगिक के बाद इसके अलावा और बाधा ऊतक (धराशायी लाइन) के बिना एक फिल्टर पर हो. ख) OECT क्षणिक प्रतिक्रिया.

चित्रा 5
चित्रा 5. OECT से ठेठ सामान्यीकृत परिणाम. डिवाइस (खाली चक्र) की शुरूआत पर OECT की सामान्यीकृत प्रतिक्रिया, सेल परत (काला पार), 5 मिमी EGTA (गहरे नीले वृत्त) और 10 मिमी EGTA (सियान वृत्त) में पेश टी = 0, 50 मिनट की अवधि में मापा गया.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस तकनीक बाधा ऊतक अखंडता को मापने के लिए जीवित कोशिकाओं के साथ एक कार्बनिक विद्युत ट्रांजिस्टर एकीकृत करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है. इस तकनीक का मुख्य लाभ तेज़ी और संवेदनशीलता, लेकिन यह भी बाधा ऊतक के गतिशील निगरानी के लिए उपकरण की कम लागत रहे हैं.

इस विधि जीवित कोशिकाओं का उपयोग करता है, एक महत्वपूर्ण बिंदु एक अक्षुण्ण परत बाधा का प्रतिनिधित्व करता है जो एक monolayer, उपयोग करने के लिए सुनिश्चित किया जाना है. बाधा के मापदंडों सेल लाइन के लक्षण वर्णन के दौरान परिभाषित किया जाना चाहिए. यह गेट इलेक्ट्रोड सेल परत के ऊपर इलेक्ट्रोलाइट में डूब जाता है जब सेल परत को नुकसान नहीं इसलिए महत्वपूर्ण है.

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु डिवाइस का निर्माण है, कोई रिसाव तरल मात्रा परिवर्तन से बचने के लिए PDMS की बढ़त और प्लास्टिक धारक के बीच हो जाना चाहिए. Reproducible परिणाम प्राप्त क्रम में ध्यान भी रूप तार की सोल्डर दी जानी चाहिएसोना इलेक्ट्रोड जलती आयोजन बहुलक चैनल और इतने गरीब / कोई संकेत के साथ गरीब / कोई संपर्क का परिणाम देगा.

विश्लेषण की सुविधा और प्रयोग के प्रत्येक चरण के बीच कुछ मिनट की देरी के कदम के बीच स्थिर करने के लिए डिवाइस के लिए अनुमति दी जानी चाहिए बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए. डिवाइस डिवाइस से संकेत के विभिन्नता मनाया जाता है, परिणाम को सामान्य बनाने के प्रत्येक प्रयोग के परिणामों की तुलना करने के लिए सक्षम होने के लिए आवश्यक है. हालांकि, भविष्य में इस उपकरण का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अधिक से अधिक डिवाइस डिवाइस reproducibility के लिए अनुमति देगा.

तकनीक की मुख्य सीमा स्वरूप है, पल के लिए के रूप में केवल एक नमूना मापा जा सकता है. यह एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप का निर्माण एक multiacquisition सेंसर के विकास के द्वारा और भविष्य में जल्द ही हल हो जाएगा. इस बाधा ऊतक के उच्च throughput स्क्रीनिंग में इस्तेमाल के लिए इस तकनीक के लिए रास्ता खुल जाएगा. समानांतर में, तलीय उपकरणों विकास टन से कम भी कर रहे हैंओ एक साथ ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉनिक माप अनुमति देते हैं.

संक्षेप में, बाधा ऊतक का लेबल मुक्त निगरानी करने में सक्षम है कि कम लागत पर निर्मित किया जा सकता है कि एक उपन्यास डिवाइस विकसित किया गया है. इस डिवाइस को अधिक से अधिक संवेदनशीलता और मौजूदा तरीकों की तुलना में उच्च अस्थायी समाधान से पता चलता है. ऐसे OECT के रूप में उपकरणों के साथ इन विट्रो मॉडल के एकीकरण की खोज और विष विज्ञान दवा के लिए पशु परीक्षण करने के लिए एक बहुत अच्छा विकल्प हो सकता है.

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Disclosures

इस परियोजना FP7 लोग-2009-आरजी, मैरी क्यूरी परियोजना सं 256367 (CELLTOX) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद ईआरसी-2010-STG प्रस्ताव नहीं 258,966 (IONOSENSE), साथ ही Conseil क्षेत्रीय डे से एक संयुक्त अनुदान द्वारा समर्थित है अनुसूचित जनजाति के लिए प्रोवेंस आल्प्स कोटे डी AZUR और सीडीएल फार्मा. हम OECT डिजाइन और समारोह से संबंधित उपयोगी विचार विमर्श के लिए जॉर्ज Malliaras धन्यवाद.

Acknowledgements

इस पत्र के लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clevios pH 1000 Heraus Clevios
AZ9260 resin Cipec Specialties
Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Culture insert Millicell  PET 0.4 μm Millipore Dominique Dutscher 51705
24-well Cell culture plate BD Falcon Dominique Dutscher 51705
Stericup-GPT PES 0.22 μM Dominique Dutscher 51246
Advanced DMEM Marque GIBCO Fisher Scientific E3434T
FBS Heat Inact. Fisher Scientific E3387M
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific E3470C
GlutaMAX Fisher Scientific E3524T
Trypsin 0.05% EDTA Fisher Scientific E3513N
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma Aldrich E4378
Ethylene glycol, anhydrous, 99.8%, Sigma Aldrich
Caco-2 cells ATCC
PDMS Dow Corning SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER
Au (99.99%) NEYCO AU3X6
Chromium (99.95%) NEYCO
Parylene C Specialty Coating Systems
Ag/AgCl wire Harvard Apparatus
Photoresist Cipec Specialties

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References

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