Visualisering av ATP synthase dimer i Mitokondrier av Electron Cryo-tomografi

Biology
 

Summary

Vi presenterer en protokoll på hvordan man skal samle inn og behandle elektron cryo-tomograms av hele mitokondrier. Teknikken gir detaljert innsikt i struktur, funksjon og organisering av store membran protein komplekser i innfødte biologiske membraner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davies, K. M., Daum, B., Gold, V. A., Mühleip, A. W., Brandt, T., Blum, T. B., Mills, D. J., Kühlbrandt, W. Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography. J. Vis. Exp. (91), e51228, doi:10.3791/51228 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektron kryo-tomografi er et kraftig verktøy i strukturell biologi, i stand til å visualisere tre-dimensjonale strukturen av biologiske prøver, slik som celler, organeller, membranvesiklene, eller virus ved molekyl detalj. For å oppnå dette, blir den vandige prøven hurtig forglasset i flytende etan, som bevarer den i en nær-til-native, frosset-hydratisert tilstand. I elektronmikroskop, er vippeserien registreres ved flytende nitrogen temperatur, hvorfra 3D tomograms rekonstrueres. Den signal-til-støyforholdet for tomografisk volum i seg selv er lav. Gjenkjennelige, tilbakevendende funksjoner er forbedret med subtomogram gjennomsnitt, der individuelle subvolumes er kuttet ut, justert og i gjennomsnitt for å redusere støy. På denne måten, kartene med en oppløsning av 2 nm eller bedre kan oppnås 3D. Et anfall av tilgjengelige høyoppløselige strukturer til 3D-volumet produserer deretter atom modeller av protein komplekser i sitt opprinnelige miljø. Her viser vi hvordan vi bruker elektron cryo-tomography å studere in situ organisering av store membranproteinkomplekser i mitokondrier. Vi finner at ATP synthases er ordnet i rader på dimerer langs sterkt buede spissene av den indre membran cristae, mens komplekset I er tilfeldig fordelt i membranregioner på hver side av rekkene. Ved subtomogram snitt vi oppnådd en struktur av den mitokondrielle ATP syntase dimer innenfor cristae membran.

Introduction

Mitokondrier er power-husene i cellen. Ved å konvertere en elektrokjemisk proton-gradient på tvers av den indre mitokondrie-membran inn kjemisk binding energi, produserer den mitokondrielle ATP syntase meste av ATP som driver cellulære prosesser. For å forstå mekanismene bak mitokondrie energi konvertering, må vi finne ut strukturen i ATP synthase in situ, og for å finne ut hvordan det er ordnet og distribueres i indre mitokondriemembranen. Selv om høy oppløsning strukturer av de fleste av de mitokondrielle ATP syntase komponenter 1-3 og lav oppløsning kart over hele komplekset 4 er tilgjengelige, er det viktig å etablere strukturen og konformasjon av arbeids enzymet i membranen. Fordelingen av ATP-syntase i den indre mitokondrie-membran har blitt mye antas å være tilfeldig, men en tidlig å finne 5 og egne første resultatene 6 indikerte at dette ikke er than saken. Etterfølgende studier fra gruppen vår og andre 7 har bekreftet at ATP-syntase er anordnet i lange rekker av dimerer langs tett buede rygger av den indre mitokondrie-membran cristae 8, mens protonpumpene i elektrontransportkjeden synes å være lokalisert på begge sider av radene 9. Denne ordningen har viktige implikasjoner for mekanismene mitokondriell energikonvertering.

Teknikken vi har brukt til å avgjøre denne ordningen er elektron cryo-tomografi (cryo-ET). Cryo-ET er for tiden den eneste metoden som gir nøyaktige tredimensjonale (3D) volumer av celler, cellular avdelinger eller organeller på molekylært oppløsning. Cryo-ET er spesielt egnet for å studere store komplekser i biologiske membraner, fordi membranene vises med god kontrast og er lett å spore i 3D-tomografiske volumer.

Andre metoder for å studere 3D-strukturen av celler eller organelles ikke gir molekyl detalj. Super-oppløsning lysmikroskopi 10, 11 er ypperlig ved å avsløre posisjonen eller avstander mellom lysemitterende markører festet til proteiner av interesse med en presisjon på titalls nm, men det trenger ikke avsløre strukturen til proteinet i seg selv, selv ved lav oppløsning, . Transmisjonselektronmikroskopi av seriesnitt 12 eller blokk-ansikt bildebehandling ved å skanne elektronmikroskopi 13 av plast-embedded biologiske prøver gir utsikt over mobilnettet volumer lav oppløsning, men også avslører ikke molekylær detalj. Atomic force microscopy 14 kan i prinsippet gi molekylær eller atom-oppløsning, men kun på overflaten av gjenstander på en atomisk flat, fast bærer. Til slutt, 16 er usannsynlig å avdekke strukturen i store, komplekse, aperiodic gjenstander som hele celler eller organeller ved m X-ray tomografi 15 eller spredning av intense X-ray pulser fra free-elektron laserolecular oppløsning i overskuelig fremtid. Dermed i dag, er det ikke noe alternativ til Cryo-ET for studier av 3D-struktur av celler eller organeller på nanometer oppløsning.

Cryo-ET er den foretrukne metode for å undersøke strukturen og konformasjon av membran-assosierte proteinsammensetningene inkludert atom pore komplekset 17, influensa komplekser pigg 18, og flagellene motor proteiner 22, 23, men også den organisasjon av hele bakterieceller 19 og oppføring av sykdomsfremkallende virus som HIV i å celler 20-23. Cryo-ET er uvurderlig for å visualisere trådformede proteiner og deres interaksjoner i cellen, inkludert actinfilamenter 24 eller axonemes 25. Vedtaket kan bli styrket til 2 nm eller bedre av subtomogram gjennomsnitt 26, der subvolumes av gjentatte, vanlige funksjoner er kuttet ut av en tomografisk volum og gjennomsnitt av single-partikkel-image produksjonling teknikker.

Cryo-ET medfører anskaffelse av en serie av projeksjonsbilder av en tynn prøven (<250 nm) tatt ved ulike vinkler i et transmisjonselektronmikroskop (TEM). Prøven må være tynn, slik at elektroner, som samhandler sterkt med saken, er spredt ikke mer enn én gang. Multiple spredning gjør de resulterende bildene vanskelig å tolke og reduserer kontrasten. Bilder av den valgte prøveområdet er innrettet i forhold til hverandre, og et annet projisert inn i en 3D-rom ved et egnet datamaskinprogram, å generere et 3D-volum av prøven. Justeringen av bildene er hjulpet av gull fiducial markører, som er blandet med prøven før frysing. Ideelt 10 eller flere jevnt fordelte fiducial markører bør være til stede i hvert bilde for å oppnå en god innretting.

Å observere molekylær detalj, prøvene er stupe-frosset i flytende etan, som bevarer sitt eget hydrert tilstand. Frysing i flytendeetan er så rask (~ 10 5 ° C / sek) 27 at vann ikke krystalliserer ikke, men forblir i en vitrifiseres, glass-lignende tilstand. Iskrystalldannelse skader følsomme biologiske strukturer. Som biologiske prøver lider av stråleskader, er det en grense for det totale antall spredningshendelser prøven kan tolerere. Bildene er dermed ervervet i lavdose-modus: Et område av interesse er identifisert ved lav forstørrelse (1,500X) med et elektron dose under en e - nm 2 (søkemodus) /. Bildet blir så fokusert på et høyere forstørrelse, utenfor området av interesse (fokusmodus). Bare når et bilde blir anskaffet, blir området av interesse bestrålt med en høyere elektron dose (eksponeringsmodus).

Her presenterer vi en oversikt over hvordan å samle inn og behandle elektron Cryo-tomograms, ved hjelp av ATP syntase dimer i indre mitokondriemembranen som et eksempel. Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør mitokondriene for cryo-ET, hvordan du setter oppog samle en vippe-serien med en bestemt total elektron dose, og hvordan man kan behandle tilt serie for å skaffe en 3D-volum av området av interesse. En oversikt over fremgangsmåten er illustrert i figur 1.

Protocol

1. Fremstilling av Mitokondrier fra celler eller vev ved differensialsentrifuge

Dette avsnittet beskriver en generell prosedyre for isolering av intakte mitokondrier fra forskjellige eukaryote organismer. Den nøyaktige bufferkomponenter og sentrifugeringshastigheter må optimeres for hvert vev / arter undersøkt.

  1. Bryte-celler i isotonisk buffer (f.eks, 250 mM sukrose, 10 mM HEPES pH 7,4), ved hjelp av en glass-perlemølle (soppens mycel) 28, enzymatisk oppslutning av celleveggen (Saccharomyces cerevisiae) 29, en kulebærende homogenisator (single -celle eukaryoter / kultur celler / nematoder) 30, eller en blender (dyr eller plante vev) 31.
  2. Fjern celleavfall ved filtrering gjennom muslin fulgt av lav-hastighetssentrifugering (2000 x g, 4 ° C, 10 min).
  3. Samle supernatant og pellet mitokondriene etter høyhastighetssentrifugering (9000 x g, 4 ° C, 10 min).
  4. Der det er nødvendig, kan du bruke en isotonisk tetthet skritt gradient for ytterligere rensing av mitokondrie fraksjon 32.

2. Utarbeidelse av Mitokondrier Elektron Cryo-tomografi

Følgende avsnitt beskriver hvordan du kan få frosne hydrert prøver for cryo-ET. MERK: Metoden innebærer bruk av ekstremt kaldt flytende nitrogen og etan, som kan forårsake alvorlige brannskader. Vernebriller og cryo-beskyttelseshansker må brukes. Flytende etan, som også er brannfarlig, må håndteres i en avtrekkshette.

  1. Resuspender pelleterte mitokondrier i 250 mM trehalose, 10 mM HEPES-buffer ved pH 7,4 til en konsentrasjon på ca 5 mg / ml totalt protein.
  2. Glow-utslipp holey karbon EM rutenett, carbon side opp, i et vakuum enhet i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Kondensere et par milliliter av etan ved å dirigere en strøm av etan gass på den indre side av en flytende nitrogen kuled aluminiumbeholder.
  4. Bland protein A-konjugert gull fiducial suspensjon 1: 1 med mitokondrie suspensjon og umiddelbart bruke 3 mL til en glød-utslipp EM grid holdt i pinsett.
  5. Plasser pinsett i en vitrification enhet, for eksempel en hjemmelaget giljotin. Blot av overflødig væske med en kile av filterpapir (~ 5 sek eller til væsken stopper spredning) og umiddelbart stuper rutenettet til flytende etan ved å slippe avtrekkeren.
  6. Overfør risten fra flytende etan i flytende nitrogen. Under overføring, fjerne overflødig etan fra nettet med filterpapir. Plasser spissen av et kileformet stykke filterpapir i den flytende etan. Som flytende etan stiger, forsiktig dra rutenettet opp filterpapiret men holde det under væske foran. Flytende etan fjernes fra risten ved kapillærvirkning og når all væsken etan er blitt fjernet, overfør umiddelbart risten i flytende nitrogen.
  7. Plasser forglassede rutenettet i et rutenett oppbevaringsboks, ennd Oppbevares under flytende nitrogen for senere bruk som hensiktsmessig.

3. Opptak av tomografisk Tilt Series

Følgende avsnitt beskriver hvordan du setter opp og samle en tomografisk tilt serie på mitokondrie med en Polara elektronmikroskop utstyrt med en post-kolonne energi filter og CCD-kamera. Lignende protokoller brukes med alle elektron Cryo-mikroskoper utstyrt med CCD eller direkte elektron detektor kameraer.

  1. Juster Microscope
    1. Sett test prøven f.eks, grafitt og gull øyer på holey karbon film.
    2. Modus Velg søk i mikroskopet lavdose system.
    3. Ta prøve til eucentric høyde. Dette er poenget med minimal xy bevegelse når du vipper prøveholder. Sentrer et punkt av interesse ved 0 ° tilt, tilt scenen til 20 ° og re-senter poenget ved å endre z-høyde. Tilbake til 0 ° og gjenta til sideveis forskyvning er minimert.
    4. Velgeksponeringsmodus. Velg ønsket forstørrelse for å samle inn en tomogram (f.eks 25,000X på detektoren ≈ 0.6 nm prøven pikselstørrelse).
    5. Velg en liten kondensator blenderåpning (50-70 mm) og velg et sted størrelse og stråleintensitet slik at strålen er bare bredere enn bildeenheten og gir en piksel lesning av 60 e - / pixel (CCD) eller 14 e - / pixel / sek (direkte elektrondetektor, telle modus).
    6. Senter kondensator blenderåpning.
    7. Finn Gaussian fokus f.eks poenget med minimal kontrast. Reset mikroskop defokus lesing og riktige dreiepunkter og rotasjonssenteret i henhold til produsentens instruksjoner.
    8. Ringe inn ønsket defokus for opptak tomogram. MERK: Høy defokus (8 mikrometer) øker kontrasten men reduserer oppløsningen, mens lav defokus (2-4 mikrometer) øker oppløsning på bekostning av kontrast.
    9. Over et tomt hull, generere en ny gevinst referanse og justere energi filter i henhold til produsentensinstruksjoner.
    10. Rett søke og eksponeringsmoduser. I eksponeringsmodus, plassere et punkt av interesse og bytte til søk-modus. Velg forstørrelse av 1,500X (0,033 mikrometer / pixel av prøven på detektor) og defokus på 100 mikrometer (for økt kontrast). Ta severdig tilbake til sentrum ved hjelp av bildeforskyvning spoler.
    11. I søkemodus, justere spot størrelse og stråleintensitet slik at strålen er bare bredere enn bildeenheten og gir en piksel lesning av ~ 20 e - / pixel (CCD) eller ~ 8 e - / pixel / sek (direkte elektrondetektor, telle modus).
  2. Finne en god Specimen området
    1. Sett risten med frosne hydrert mitokondrier i elektronmikroskopet på flytende nitrogen temperatur (se EM produsentens anvisninger).
    2. I søkemodus, søke på nettet for områder med passende istykkelse og prøvekvalitet. Ta en 6 sek søke bilde av lovende områder for å bestemme egnethet for tomogram samling. Both den indre og ytre mitokondriemembranen skal være synlig på dette forstørrelse.
  3. Opptak av en tomografisk Tilt Series
    1. Når en god prøveområdet er funnet, vippe scenen ± 60 ° for å bestemme den maksimale tiltområdet som er tilgjengelig uten obstruksjon av eksponeringen eller fokusområde ved grid barer eller isklumper.
    2. På en nærliggende isfylte hull av lignende utseende, skifte til eksponeringsmodus og juster stråleintensitet eller image oppkjøpet tid slik at hver registrerte bildet har et elektron dose på 30-50 e - / pixel for CCD eller 6-8 e - / pixel / Koreas direkte elektron detektorer, telle modus.
    3. Beregn dose fordelingsforholdet (I 0 / I 60) ved å dividere den gjennomsnittlige elektronantall for en 1 sek bilde tilegnet ved 0 ° C med den for en 60 ° bilde. Dette forholdet beskriver økningen i eksponeringstiden som kreves for å opprettholde en konstant elektron teller per bilde med økende vinkel (eksponeringstid = 1 / cOs (α) n der (I 0 / I 60) = 2 n). Forholdet tjener også som en god indikasjon på istykkelsen. Gode ​​tomograms av mitokondrier er vanligvis registrert med en I 0 / I 60 = 02.03 til 02.06.
    4. Over et tomt hull, få en 1 sek bilde i eksponeringsmodus og merk elektronet teller per A 2. Hensyntatt dose utdelingsgrad, beregne det totale antall bilder som kan tas opp for en bestemt total elektron dose (f.eks <40 e - / A 2 for strukturbestemmelse & ~ 160 e - / A 2 for morfologi).
    5. Bestem passende tilt intervall for tomogram samling ved å dele totalt tiltområdet (f.eks 120 ° for ± 60 °) med det totale antall bilder beregnet i 3.3.4.
  4. Sette opp og spille inn en tomogram med parametrene bestemmes over ved hjelp av egnet automatisk datainnsamling programvare 33, 34. Tilt serie er vanligvis startet på ± 20 °, og går gjennom 0 ° før den når høye helninger for å maksimere informasjonsinnholdet i lav-tilt bilder som er ødelagt ved å øke elektron dose.

4. Opprettelse og Segmentering av tomografisk Volumes

Denne delen beskriver hvordan tomografiske mengder mitokondrier genereres fra tilt serien og hvordan volumene er tilstede for generell visning.

  1. Lagre tomografisk tilt serien til en passende katalog. Generere en bildestakk og konvertere til et passende filformat med open-source programvare, for eksempel dm2mrc eller tif2mrc (imod pakke), som konverterer .dm3, .dm4 eller lang TIF-filer til MRC stabler. MRC stabler er nødvendig for tomografisk rekonstruksjon med imod 35. Andre pakker krever forskjellige formater.
  2. Justere bildene og generere en tomogram ved å følge trinnene beskrevet i imod opplæringen (
  3. Forbedre kontrasten i tomogram bruker den ikke-lineære anisotropisk diffusjon filter distribuert med imod. Dette filteret fungerer godt for membraner og membran-assosierte partikler, for eksempel ATP syntase.
  4. For visualisering, manuelt segmentere tomogram bruker kommersielt tilgjengelige programmer f.eks Amira. Tildel voksler som tilsvarer den indre eller ytre membran og generere en overflate. Ved hjelp av klikkeren alternativet i EM-pakken plugin for AMIRA 36 markere plasseringen av ATP syntase partikler.

5. Subtomogram Averaging av ATP synthase dimer og Montering av X-Ray Structures

Følgende avsnitt beskriver hvordan subtomogram gjennomsnitt av ATP syntase dimer kan skaffes.

  1. Ved hjelp av de merkede partikler som input, og en egnet programvarepakke slik som "Particle Estimat for Electron Tomography 'program, beregne en subtomogram gjennomsnittet.
  2. For en oppløsning estimat, sammenligne to uavhengig fastsatt subtomogram gjennomsnitt av Fourier shell korrelasjon 37.
  3. Hvis tilgjengelig, dock kjent X-ray strukturer inn i subtomogram gjennomsnitt med stiv kropp montering, enten manuelt eller ved hjelp av automatiske sekvensielle docking rutiner slik som de i programmet Chimera 38.

Representative Results

Elektron Cryo-tomograms av mitokondrier klart åpen 3D morfologi av organeller (figur 2). Manuell segmentering av membraner i et tomografisk volum illustrerer strukturen av cristae i en mitokondrie. Av tenkelig mitokondrier fra forskjellige gjær knockout stammer som mangler visse proteinkomponenter, kan effekten av disse proteinene på cristae morfologi ved vurderes. Figur 3 viser en mitokondrie fra en gjærstamme mangler ATP synthase subenheten e. Denne komponent av ATP syntase komplekset er nødvendig for dimerisering av mitokondriell ATP syntase. Mitokondrier fra denne stamme mangler den normale lamellær cristae av villtype mitochondria (figur 2), og i stedet inneholder en rekke indre membranlommer. Disse avdelingene er enten blottet for cristae eller inneholde små ballongformet membran invaginations (figur 3).

I tomograms med god kontrast, store mitokondrielle protein komplekser, i dette tilfellet ATP syntase dimer, er lett synlig (figur 4; Movie 1). Strukturene av kompleksene kan bestemmes på 2-3 nm oppløsning av subtomogram snitt (figur 5; Film 2). De gjennomsnittlige volumer kan plasseres tilbake i tomogram for å vurdere organiseringen av de enkelte komplekser i forhold til hverandre og til andre proteinkomplekser i membranen (figur 6; Film 3).

Figur 1
Figur 1. Flow-chart som viser stadier av elektron cryo-tomografi. Klikk her for å se større bilde.


Figur 2. Morfologi av en mitokondrie fra villtype S. Cerevisiae. Midt snitt gjennom en tomografisk volum av en villtype S. cerevisiae mitokondrie (til venstre) og tilsvarende overflategjengitt volum (til høyre). Den segmenterte volumet av den ytre membran er vist i grått og volumene av den indre grense og cristae membraner i lyseblå. Tilpasset fra Davies et al 8. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Mitokondrie fra en S. Cerevisiae stamme som mangler en underenhet som kreves forATP syntase dimerisering. Skjære gjennom tomografisk volum (til venstre) og tilhørende overflategjengitt volum (til høyre) av en mitokondrie fra en S. Cerevisiae stamme som mangler den protein subenheten e kreves for ATP syntase dimerisering. Når sammenlignet med Figur 2, mitokondrie fra mutantstammen mangler den normale lamellær cristae av villtype mitokondrier. I stedet har mitokondrie mange indre membran lommer med enten ingen cristae eller ballong-formet cristae. Dermed elektron Cryo-tomografi fremhever endringer i membran morfologi grunn gendelesjoner. Tilpasset fra Davies et al 8. Klikk her for å se større bilde.

Figur 4
Figure 4. Mitokondrie fra soppen P. anserina. Skjær gjennom CT-volum (til venstre) og tilhørende overflategjengitt volum (til høyre) av en mitokondrie fra trådformede soppen P. anserina. I denne tomogram, er rader med 10 nm partikler (gule pilspisser) plassert over svært buede membran rygger i indre membran cristae (se Movie 1). Disse partiklene ble identifisert som ATP syntase dimer av subtomogram snitt. Fra Davies et al ni. Klikk her for å se større bilde.

Figur 5
Figur 5. Struktur og organisering av mitokondriell ATP syntase. Side og toppriss som viser elektrontettheten for en ATP-syntase dimer fra S. c erevisiae som bestemmes av subtomogram snitt med montert atommodeller (til venstre). Mitokondrielle indre membranen vesikkel som viser organiseringen av ATP syntase dimer i rader (til høyre). Figuren ble generert ved å plassere subtomogram gjennomsnittet av ATP syntase dimer i den segmenterte volum av membranen vesikkel, ved hjelp av koordinatene som beregnes under i snitt. Tilpasset fra Davies et al 8. Atomic modeller: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (blå og lilla); oligomycin sensitive overdragelse protein-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (grønn); perifer stilken fragment [PDB: 2CLY] en med N-terminale rester fra [PDB: 2WSS] 2 (gul og rød) (se Movie 2). Klikk her for å se større bilde.

_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6. Isolert crista vesikkel fra en P. anserina mitokondrie. Slices fra en tomografisk volum (til venstre) og tilhørende overflategjengitt volum (til høyre) av en crista vesikkel fra P. anserina. Protein tettheter stikker fra membranen er godt synlig. Tettheter angitt med gule pilspisser er ATP syntase dimer, som er identifisert ved subtomogram snitt. Grønne pilspisser peke på tettheter identifisert av antistoff merking som NADH dehydrogenase (kompleks 1, for mer informasjon se 9). Segmentering av protein tettheter viser organiseringen i cristae, med ATP syntase dimerer (rød og gul) som danner rader langs de sterkt krummede cristae ryggene og NADH dehydrogenase-komplekser (grønt) i membranregioner på hver side av rekkene (se Movie 3). Fra Davies et al ni.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Movie 1. Electron cryo-tomogram av en P. anserina mitokondrie. Filmen viser suksessive skiver gjennom en tomografisk volum tatt av en mitokondrie fra trådformede soppen P. anserina. Rader av ATP syntase er angitt med gule pilspisser. Overflaten-rendret, segmentert volum viser plasseringen av ATP synthase (gule kuler) i forhold til 3D cristae struktur. Ytre membran, grå; indre grense membran, gjennomsiktig blå; cristae membraner, ugjennomsiktig blå. Fra Davies et al ni. Se også figur 4. Klikk her for å se video.

Movie 2. Subtomogram gjennomsnitt av mitokondriell ATP syntase dimer fra S. Cerevisiae med montert atommodeller. Den gjennomsnittlige varberegnet ut fra 121 subvolumes. Tettheten vises på tre høydenivåer: 1s - mesh, 2s - lys grå og 3s - mørkegrå. Atomic modeller ble montert inn tettheten ved hjelp av sekvensiell fit rutine i Chimera. Atomic modeller: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (blå og lilla); oligomycin sensitive overdragelse protein-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (grønn); perifer stilken fragment [PDB: 2CLY] en med N-terminale rester fra [PDB: 2WSS]. 2 (gul og rød) Klikk her for å se video.

Tilpasset fra Davies et al 8. Se også figur 5.

Movie 3. Isolert cristae vesikkel fra en P. anserina mitokondrie. Suksessive skiver gjennom tomografisk volum er vist, etterfulgt av den segmenterte overflategjengitte volum. Protein tettheter som stikker ut fra membrane er godt synlige. Røde og gule tettheter er ATP syntase dimer. Grønne tettheter er NADH dehydrogenase (kompleks I) som bestemt ved antistoff-merking. Fra Davies et al ni. Se også figur 6. Klikk her for å se video.

Discussion

Protokollen presenteres her gir en innføring i Cryo-ET og subtomogram gjennomsnitt av mitokondrier, men i hovedsak den samme prosedyren kan brukes på hvilken som helst annen celle rommet eller membran. For å oppnå best mulige data, kritiske trinnene under prosedyren er prøveopparbeidelse, stupe fryseprosessen og data oppkjøpsstrategi. Prøve kvalitet, noe som er avgjørende for å lykkes, avhenger av en optimalisert frysing protokollen for å sikre egnet istykkelse, som er av avgjørende betydning for god bildekontrast. Den optimale datainnsamling formasjonen avhenger av instrumentet og prøven. Parametere som skal optimalisert inkluderer elektron dose per bilde, tilt ordningen og defokus. Anskaffelse av en god tomogram av et godt utvalg gjør all videre behandling trinn enklere og sikrer en tilfredsstillende sluttresultat.

Cryo-ET kombinert med subtomogram snitt og atommodell montering gir detaljer om hvordan protein komplekser er ordnet i their innfødte mobile miljøet. Teknikken er like godt egnet for å undersøke strukturen av store membranproteinkomplekser, for eksempel respiratoriske kjeden supercomplexes 1.7 (MDA), ATP-syntase dimerer (2x500 kDa), eller det nukleære pore kompleks (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Organiseringen av ATP-syntase dimerer i rader ikke kan observeres ved høy oppløsning teknikker som røntgen-krystallografi, NMR-eller enkel-partikkel kryo-EM, fordi dimer rader er avbrutt ved detergentekstraksjon, som er et nødvendig trinn i isoleringen og rensing av membranproteinkomplekser.

Ordningen av ATP syntase i rader av dimer langs cristae rygger er en universell organiserende prinsipp i mitokondriene i alle arter. De protonpumpe komplekser av elektrontransportkjeden, særlig kompleks I (NADH dehydrogenase), er lokalisert i membranen områder på hver side av radene 8,9. Denne organisasjonen av luft kjeden har betydelig innflytelse på mitokondrie bioenergi. Dersom dimer rader ikke kan dannes på grunn av fravær av dimer-spesifikke protein subenheter, cellene oppviser lengre generasjonstid og redusert cellulær form, som observert i gjærmutant vist i figur 3 41. Med den økende interesse i mitokondrie sykdommer, en detaljert forståelse av det molekylære grunnlaget styrende mitokondrie ultrastructure og funksjon er av største betydning. Elektron kryo-tomografi gir en sammenheng mellom proteinstruktur bestemt ved høy resolusjonsmetoder, og fordelingen og arrangement av disse proteinene i membranen på omfanget av nanometer. Dette gjør cryo-ET et viktig verktøy for å forstå mitokondrie struktur og funksjon i helse og sykdom.

Ytterligere tekniske utviklingen og forbedringer i Cryo-ET inkludere protein-merking strategier for å identifisere posisjonen til Proteinkonn subenheter i makromolekylære komplekser eller plasseringen av mindre eller mindre distinkte proteiner (<0,5 MDA) i celler. I tillegg har hybrid EM bearbeidingsmetoder, som kombinerer subtomogram snitt med enkeltpartikkelanalyse eller spiralformede rekonstruksjon nylig bestemt proteinstrukturer til ~ 8 A 42, 43. Disse behandlingsmetodene er for øyeblikket begrenset til rensede proteiner, som er godt atskilt i is eller danner spiralformede forsamlinger og er for tiden ikke aktuelt å overfylte cellulære miljøer som mitokondrier og cristae membraner. For datainnsamling, nye data og maskinvare blir utviklet for å muliggjøre automatisert tomogram oppkjøpet øke bildekontrast og redusere total nødvendige elektron dose. Den eneste grunnleggende begrensning i kryo-ET er stråleskader til prøven ved elektronstråle. Dette betyr at bare svært lave doser elektron kan brukes til å registrere hvert bilde av en tomografisk tilt serie, noe som resulterer i dårlig signal-to-støy-forhold som til slutt begrenser den oppnåelige oppløsning. De nye direkte elektron detektorer, utgitt mindre enn et år siden, er i dag revolusjonerer feltet av single-partikkel cryo-EM 44, 45. Disse nye detektorer gir høyere kontrast og bedre oppløsning ved lavere elektron doser. For elektron cryo-tomografi, betyr dette at tilt serien med mindre steg størrelser eller enda to akser tomograms kan samles uten bekymringer om overdreven stråleskader (en CCD-bildesensor er tilsvarende i elektron dose til fem direkteelektrondetektor bilder). De enorme mengder data produsert av disse detektorene lage sine egne utfordringer i data håndtering, prosessering og lagring, som vil måtte overvinnes.

I tillegg fase plater, som fungerer på lignende prinsipper som de som brukes rutinemessig i lysmikroskopi å forbedre fasekontrast, er under utvikling for transmisjonselektronmikroskopi 46, 47.. Dette bør tillate tomograms samles nærmere å fokusere og derfor ved høyere oppløsning, mens på samme tid bevarer lav oppløsning gir nødvendig for innretting og tolkning av tomografiske volumer. Til sammen vil disse teknologiske fremskrittene i stor grad utvide utvalget av biologiske spørsmål som kan tas opp av cryo-ET.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, og WK), Cluster of Excellence Frankfurt "Macromolecular komplekser" finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) og en postdoktor EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Roth 4621.2
Trehalose Sigma-Aldrich T9449
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Zymolase biomol Z1000.1
Density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 or P1644
Protein A gold Aurion 810.111 10 nm
Ethane Air Liquide P0502S02R0A001
Nitrogen Air Liquide I4150RG
Consumables
Filter paper Whatman, GE Healthcare 1004 090 Nr 4
Tweezers Dumont T506 Non-magnetic, pattern #5
EM combined test grid Plano GmbH S142 grapite and gold islands on holey carbon film
Holey carbon grids Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat R2/2 300 Cu mesh
Cryo grid boxes Plano GmbH 160-42 Alternative home-made metal boxes
Potter Sigma-Aldrich P7984
Blender Waring 8011S
Glass bead mill - bead beater BioSpec Products 1107900-105 Including 0.5 mm beads
Ball-bearing (Balch) homogeniser isobiotec H8
Centrifuge Thermo Scientific 46915 Sorvall RC6+
Glow-discharge apparatus Bal-Tec A.G. CTA 010
Grid vitrification device FEI, Gatan or Leica Alternative home-made plunger
Transmission electron microscope FEI or Jeol 300 keV
Direct electron detector Gatan K2 summit 4k x 4k pixels, counted mode
Charge coupled device (CCD) Gatan US4000 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector)
Energy filter Gatan or Jeol
Software
Image acquisition software Gatan
Tomogram acquisition software Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder 4 alternatives
Tomogram processing software FEI, UCSF or UC-Boulder 3 alternatives
Subtomogram averaging software UC-Boulder, or University of Basel 2 alternatives
Tomogram visualization software UC-Boulder, FEI, or University of Utah 3 alternatives
Visualization software plugin Goethe university http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/
Structure visualization software UCSF http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Numerical calculation software MathWorks http://www.mathworks.de/academia/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
  2. Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
  3. Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
  4. Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
  5. Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
  6. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
  7. Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
  8. Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
  9. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
  10. Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
  11. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
  12. Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
  13. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
  14. Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
  15. Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
  16. Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
  17. Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
  18. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
  19. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (39), (2010).
  20. Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
  21. Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591 (2009).
  22. Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
  23. Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
  24. Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
  25. Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
  26. Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
  27. Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
  28. Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
  29. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
  30. Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
  31. Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
  32. Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. John Wiley and Sons. (2001).
  33. Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
  34. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  35. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
  36. Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
  37. Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
  39. Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
  40. Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
  41. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
  42. Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
  43. Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
  44. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
  45. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. (2013).
  46. Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
  47. Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics