Vi presenterer en protokoll på hvordan man skal samle inn og behandle elektron cryo-tomograms av hele mitokondrier. Teknikken gir detaljert innsikt i struktur, funksjon og organisering av store membran protein komplekser i innfødte biologiske membraner.
Elektron kryo-tomografi er et kraftig verktøy i strukturell biologi, i stand til å visualisere tre-dimensjonale strukturen av biologiske prøver, slik som celler, organeller, membranvesiklene, eller virus ved molekyl detalj. For å oppnå dette, blir den vandige prøven hurtig forglasset i flytende etan, som bevarer den i en nær-til-native, frosset-hydratisert tilstand. I elektronmikroskop, er vippeserien registreres ved flytende nitrogen temperatur, hvorfra 3D tomograms rekonstrueres. Den signal-til-støyforholdet for tomografisk volum i seg selv er lav. Gjenkjennelige, tilbakevendende funksjoner er forbedret med subtomogram gjennomsnitt, der individuelle subvolumes er kuttet ut, justert og i gjennomsnitt for å redusere støy. På denne måten, kartene med en oppløsning av 2 nm eller bedre kan oppnås 3D. Et anfall av tilgjengelige høyoppløselige strukturer til 3D-volumet produserer deretter atom modeller av protein komplekser i sitt opprinnelige miljø. Her viser vi hvordan vi bruker elektron cryo-tomography å studere in situ organisering av store membranproteinkomplekser i mitokondrier. Vi finner at ATP synthases er ordnet i rader på dimerer langs sterkt buede spissene av den indre membran cristae, mens komplekset I er tilfeldig fordelt i membranregioner på hver side av rekkene. Ved subtomogram snitt vi oppnådd en struktur av den mitokondrielle ATP syntase dimer innenfor cristae membran.
Mitokondrier er power-husene i cellen. Ved å konvertere en elektrokjemisk proton-gradient på tvers av den indre mitokondrie-membran inn kjemisk binding energi, produserer den mitokondrielle ATP syntase meste av ATP som driver cellulære prosesser. For å forstå mekanismene bak mitokondrie energi konvertering, må vi finne ut strukturen i ATP synthase in situ, og for å finne ut hvordan det er ordnet og distribueres i indre mitokondriemembranen. Selv om høy oppløsning strukturer av de fleste av de mitokondrielle ATP syntase komponenter 1-3 og lav oppløsning kart over hele komplekset 4 er tilgjengelige, er det viktig å etablere strukturen og konformasjon av arbeids enzymet i membranen. Fordelingen av ATP-syntase i den indre mitokondrie-membran har blitt mye antas å være tilfeldig, men en tidlig å finne 5 og egne første resultatene 6 indikerte at dette ikke er than saken. Etterfølgende studier fra gruppen vår og andre 7 har bekreftet at ATP-syntase er anordnet i lange rekker av dimerer langs tett buede rygger av den indre mitokondrie-membran cristae 8, mens protonpumpene i elektrontransportkjeden synes å være lokalisert på begge sider av radene 9. Denne ordningen har viktige implikasjoner for mekanismene mitokondriell energikonvertering.
Teknikken vi har brukt til å avgjøre denne ordningen er elektron cryo-tomografi (cryo-ET). Cryo-ET er for tiden den eneste metoden som gir nøyaktige tredimensjonale (3D) volumer av celler, cellular avdelinger eller organeller på molekylært oppløsning. Cryo-ET er spesielt egnet for å studere store komplekser i biologiske membraner, fordi membranene vises med god kontrast og er lett å spore i 3D-tomografiske volumer.
Andre metoder for å studere 3D-strukturen av celler eller organelles ikke gir molekyl detalj. Super-oppløsning lysmikroskopi 10, 11 er ypperlig ved å avsløre posisjonen eller avstander mellom lysemitterende markører festet til proteiner av interesse med en presisjon på titalls nm, men det trenger ikke avsløre strukturen til proteinet i seg selv, selv ved lav oppløsning, . Transmisjonselektronmikroskopi av seriesnitt 12 eller blokk-ansikt bildebehandling ved å skanne elektronmikroskopi 13 av plast-embedded biologiske prøver gir utsikt over mobilnettet volumer lav oppløsning, men også avslører ikke molekylær detalj. Atomic force microscopy 14 kan i prinsippet gi molekylær eller atom-oppløsning, men kun på overflaten av gjenstander på en atomisk flat, fast bærer. Til slutt, 16 er usannsynlig å avdekke strukturen i store, komplekse, aperiodic gjenstander som hele celler eller organeller ved m X-ray tomografi 15 eller spredning av intense X-ray pulser fra free-elektron laserolecular oppløsning i overskuelig fremtid. Dermed i dag, er det ikke noe alternativ til Cryo-ET for studier av 3D-struktur av celler eller organeller på nanometer oppløsning.
Cryo-ET er den foretrukne metode for å undersøke strukturen og konformasjon av membran-assosierte proteinsammensetningene inkludert atom pore komplekset 17, influensa komplekser pigg 18, og flagellene motor proteiner 22, 23, men også den organisasjon av hele bakterieceller 19 og oppføring av sykdomsfremkallende virus som HIV i å celler 20-23. Cryo-ET er uvurderlig for å visualisere trådformede proteiner og deres interaksjoner i cellen, inkludert actinfilamenter 24 eller axonemes 25. Vedtaket kan bli styrket til 2 nm eller bedre av subtomogram gjennomsnitt 26, der subvolumes av gjentatte, vanlige funksjoner er kuttet ut av en tomografisk volum og gjennomsnitt av single-partikkel-image produksjonling teknikker.
Cryo-ET medfører anskaffelse av en serie av projeksjonsbilder av en tynn prøven (<250 nm) tatt ved ulike vinkler i et transmisjonselektronmikroskop (TEM). Prøven må være tynn, slik at elektroner, som samhandler sterkt med saken, er spredt ikke mer enn én gang. Multiple spredning gjør de resulterende bildene vanskelig å tolke og reduserer kontrasten. Bilder av den valgte prøveområdet er innrettet i forhold til hverandre, og et annet projisert inn i en 3D-rom ved et egnet datamaskinprogram, å generere et 3D-volum av prøven. Justeringen av bildene er hjulpet av gull fiducial markører, som er blandet med prøven før frysing. Ideelt 10 eller flere jevnt fordelte fiducial markører bør være til stede i hvert bilde for å oppnå en god innretting.
Å observere molekylær detalj, prøvene er stupe-frosset i flytende etan, som bevarer sitt eget hydrert tilstand. Frysing i flytendeetan er så rask (~ 10 5 ° C / sek) 27 at vann ikke krystalliserer ikke, men forblir i en vitrifiseres, glass-lignende tilstand. Iskrystalldannelse skader følsomme biologiske strukturer. Som biologiske prøver lider av stråleskader, er det en grense for det totale antall spredningshendelser prøven kan tolerere. Bildene er dermed ervervet i lavdose-modus: Et område av interesse er identifisert ved lav forstørrelse (1,500X) med et elektron dose under en e – nm 2 (søkemodus) /. Bildet blir så fokusert på et høyere forstørrelse, utenfor området av interesse (fokusmodus). Bare når et bilde blir anskaffet, blir området av interesse bestrålt med en høyere elektron dose (eksponeringsmodus).
Her presenterer vi en oversikt over hvordan å samle inn og behandle elektron Cryo-tomograms, ved hjelp av ATP syntase dimer i indre mitokondriemembranen som et eksempel. Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør mitokondriene for cryo-ET, hvordan du setter oppog samle en vippe-serien med en bestemt total elektron dose, og hvordan man kan behandle tilt serie for å skaffe en 3D-volum av området av interesse. En oversikt over fremgangsmåten er illustrert i figur 1.
Protokollen presenteres her gir en innføring i Cryo-ET og subtomogram gjennomsnitt av mitokondrier, men i hovedsak den samme prosedyren kan brukes på hvilken som helst annen celle rommet eller membran. For å oppnå best mulige data, kritiske trinnene under prosedyren er prøveopparbeidelse, stupe fryseprosessen og data oppkjøpsstrategi. Prøve kvalitet, noe som er avgjørende for å lykkes, avhenger av en optimalisert frysing protokollen for å sikre egnet istykkelse, som er av avgjørende betydning for god bildekontrast. Den optimale datainnsamling formasjonen avhenger av instrumentet og prøven. Parametere som skal optimalisert inkluderer elektron dose per bilde, tilt ordningen og defokus. Anskaffelse av en god tomogram av et godt utvalg gjør all videre behandling trinn enklere og sikrer en tilfredsstillende sluttresultat.
Cryo-ET kombinert med subtomogram snitt og atommodell montering gir detaljer om hvordan protein komplekser er ordnet i their innfødte mobile miljøet. Teknikken er like godt egnet for å undersøke strukturen av store membranproteinkomplekser, for eksempel respiratoriske kjeden supercomplexes 1.7 (MDA), ATP-syntase dimerer (2×500 kDa), eller det nukleære pore kompleks (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Organiseringen av ATP-syntase dimerer i rader ikke kan observeres ved høy oppløsning teknikker som røntgen-krystallografi, NMR-eller enkel-partikkel kryo-EM, fordi dimer rader er avbrutt ved detergentekstraksjon, som er et nødvendig trinn i isoleringen og rensing av membranproteinkomplekser.
Ordningen av ATP syntase i rader av dimer langs cristae rygger er en universell organiserende prinsipp i mitokondriene i alle arter. De protonpumpe komplekser av elektrontransportkjeden, særlig kompleks I (NADH dehydrogenase), er lokalisert i membranen områder på hver side av radene 8,9. Denne organisasjonen av luft kjeden har betydelig innflytelse på mitokondrie bioenergi. Dersom dimer rader ikke kan dannes på grunn av fravær av dimer-spesifikke protein subenheter, cellene oppviser lengre generasjonstid og redusert cellulær form, som observert i gjærmutant vist i figur 3 41. Med den økende interesse i mitokondrie sykdommer, en detaljert forståelse av det molekylære grunnlaget styrende mitokondrie ultrastructure og funksjon er av største betydning. Elektron kryo-tomografi gir en sammenheng mellom proteinstruktur bestemt ved høy resolusjonsmetoder, og fordelingen og arrangement av disse proteinene i membranen på omfanget av nanometer. Dette gjør cryo-ET et viktig verktøy for å forstå mitokondrie struktur og funksjon i helse og sykdom.
Ytterligere tekniske utviklingen og forbedringer i Cryo-ET inkludere protein-merking strategier for å identifisere posisjonen til Proteinkonn subenheter i makromolekylære komplekser eller plasseringen av mindre eller mindre distinkte proteiner (<0,5 MDA) i celler. I tillegg har hybrid EM bearbeidingsmetoder, som kombinerer subtomogram snitt med enkeltpartikkelanalyse eller spiralformede rekonstruksjon nylig bestemt proteinstrukturer til ~ 8 A 42, 43. Disse behandlingsmetodene er for øyeblikket begrenset til rensede proteiner, som er godt atskilt i is eller danner spiralformede forsamlinger og er for tiden ikke aktuelt å overfylte cellulære miljøer som mitokondrier og cristae membraner. For datainnsamling, nye data og maskinvare blir utviklet for å muliggjøre automatisert tomogram oppkjøpet øke bildekontrast og redusere total nødvendige elektron dose. Den eneste grunnleggende begrensning i kryo-ET er stråleskader til prøven ved elektronstråle. Dette betyr at bare svært lave doser elektron kan brukes til å registrere hvert bilde av en tomografisk tilt serie, noe som resulterer i dårlig signal-to-støy-forhold som til slutt begrenser den oppnåelige oppløsning. De nye direkte elektron detektorer, utgitt mindre enn et år siden, er i dag revolusjonerer feltet av single-partikkel cryo-EM 44, 45. Disse nye detektorer gir høyere kontrast og bedre oppløsning ved lavere elektron doser. For elektron cryo-tomografi, betyr dette at tilt serien med mindre steg størrelser eller enda to akser tomograms kan samles uten bekymringer om overdreven stråleskader (en CCD-bildesensor er tilsvarende i elektron dose til fem direkteelektrondetektor bilder). De enorme mengder data produsert av disse detektorene lage sine egne utfordringer i data håndtering, prosessering og lagring, som vil måtte overvinnes.
I tillegg fase plater, som fungerer på lignende prinsipper som de som brukes rutinemessig i lysmikroskopi å forbedre fasekontrast, er under utvikling for transmisjonselektronmikroskopi 46, 47.. Dette bør tillate tomograms samles nærmere å fokusere og derfor ved høyere oppløsning, mens på samme tid bevarer lav oppløsning gir nødvendig for innretting og tolkning av tomografiske volumer. Til sammen vil disse teknologiske fremskrittene i stor grad utvide utvalget av biologiske spørsmål som kan tas opp av cryo-ET.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, og WK), Cluster of Excellence Frankfurt "Macromolecular komplekser" finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) og en postdoktor EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |