多氯联苯同系物净营养转移效率湖鳟鱼实验室估计(

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Summary

一种技术实验室评估中的多氯联苯(PCB)同系物的净营养转换效率从他们的猎物肉食性鱼类呈现。最大化的实验室结果的适用性领域,食鱼鱼应喂是通常食用的字段猎物鱼。

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Madenjian, C. P., Rediske, R. R., O'Keefe, J. P., David, S. R. Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey. J. Vis. Exp. (90), e51496, doi:10.3791/51496 (2014).

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Abstract

一种技术实验室评估中的多氯联苯(PCB)同系物的净营养转换效率(γ),从它们的猎物肉食性鱼类在此说明。在135天的实验室实验中,我们给bloater( 白鲑hoyi)已被夹在密歇根湖到湖鳟鱼( 红点鲑namaycush)保持在八个实验室坦克。 Bloater是一种天然猎物的湖鳟。在四个罐的,相对高的流率被用来确保由湖鳟相对高的活性,而较低的流速在其它四个罐使用时,可以实现很低的湖鳟活性。上的槽由槽的基础上,被记录了食物对试验的每一天吃掉湖鳟鱼的数量。每个湖鳟鱼是在实验的开始和结束称重。处死四至九湖鳟从每八个坦克在实验开始时,所有的10湖鳟残留在每一个池中分别euthan美化版在实验结束。我们确定的75​​多氯联苯同系物在湖鳟浓度在实验开始时,在湖鳟鱼在试验结束,并在bloaters在实验过程中提供给湖红点鲑。基于这些测量,γ计算每75 PCB同系物中的每个8罐。意思是γ计算每个75 PCB同系物的激活和未激活湖鳟鱼。因为该试验重复在8缸,对标准误差平均值γ可估计。结果这种类型的实验都是在风险评估模型有助于预测未来的风险,人类和野生动物在环境污染的各种情景食用受污染的鱼类。

Protocol

1,实验室实验

  1. 得到的猎物鱼在实验过程中,以被馈送到捕食鱼。优选这些捕食鱼应该被捕获在该领域,冷冻,并储存于约-30℃。考虑商业捕鱼作业的猎物鱼的潜在来源。
  2. 捕食鱼引入到实验室罐被用于实验。高达15捕食鱼已经被引入每一个870-L罐,和多达30个捕食鱼已经被引入到每一个2380-L罐中之前的研究16,18。
  3. 适应捕食鱼饮食选择猎物的鱼。一旦适应,捕食鱼应该在开始实验前留在这个饮食1-3个月。
  4. 抛开捕食鱼类样本通过随机选择从一批猎物鱼10〜20个混合样本。捕食鱼类的复合样品的数量范围可以从3到100,这取决于猎物的大小鱼。每个复合物的样品应该是双层包装,冷冻,并储存于约-30℃。
  5. 通过在每一个容器的牺牲为30〜50%的鱼开始实验。
    1. 安乐死的鱼,混合8克Finquel用45升的水在一个大的塑料容器中,然后将鱼在所述容器与Finquel溶液。
    2. 一旦安乐死,将所有从一箱中牺牲的鱼放入袋中,然后双击袋,并储存在-30°C,直到处理时间。
    3. 称量每个剩余在每个水箱中的鱼的,并记录重量;麻醉剂可能会需要进行称量。
    4. 麻醉的鱼,混合4.6克Finquel用在大型塑料容器45升水中,然后将鱼在所述容器与Finquel溶液。
    5. 等待几分钟,麻醉称量鱼之前生效。
  6. 在实验中的每一天,解冻的适量的捕食鱼,切鱼捕食成片重约1到5g。称取猎物的鱼的数量被放置在每个坦克,然后放下猎物鱼肉片成每罐允许捕食鱼类约1小时进食。然后将所有吃剩的食物,让食物风干约20分钟,然后权衡吃剩的食物对每个坦克。记录食品的放置在箱中的量和食物残渣每天每罐的量。
    注:对于代表的实验中,湖鳟鱼喂尽可能多的食物,因为它们会在每18天一次喂奶期间消耗。然而,捕食鱼,也可以放置在固定的口粮16,19。
  7. 通过牺牲所有剩余的捕食鱼的各罐的终止实验。安乐死的鱼,混合8克Finquel用45升的水在一个大的塑料容器中,然后将鱼在所述容器与Finquel溶液。记录吨他的重量每个牺牲的鱼。对于可靠的结果,实验必须至少130天至少运行100天最好。将所有从罐鱼成一个包,然后双袋,并储存于约-30℃直到处理时间。

2,鱼同质化

  1. 选择一组捕食鱼类和/或捕食鱼类复合材料解冻。使复合材料部分地解冻。每个复合物可能需要0.5到1小时,使之均匀。
  2. 使用适当大小的搅拌机,均匀每一个复合材料。对每个复合材料,放置样品(从50至100克)的匀浆成清洗,丙酮漂洗,并打成jar。然后盖上罐子,并在约-30℃的储存罐,直到处理的时间。
  3. 洗用均化鱼的所有设备,并然后适当地用蒸馏水​​和甲醇,样品之间的冲洗。

3,提取

  1. 称取20.0克解冻均质鱼组织中的200ml烧杯中。
  2. 加入约40克硫酸钠,并与刮刀拌匀。
  3. 添加含有同源30,61,161,和166斯派克在那得到的提取物中20毫微克/毫升的最终浓度是代理秒杀的解决方案。
  4. 使样品干燥在RT混合的同时,每隔20分钟。
  5. 使样品达到一致性干砂的,在该点的样品准备用于萃取。
  6. 成立了索氏抽提装置,配备了一枚500毫升瓶中含有特富龙煮芯片,索氏和冷凝器。
  7. 干鱼的混合物添加到玻璃套管用粗烧结盘底或纸顶针。
  8. 加入150毫升50%的己烷和50%二氯甲烷的一种用于样品的烧杯中,并搅拌,同时刮烧杯的侧壁用刮铲。
  9. 通过索氏并在该溶剂中转移到索氏的顶部与附着在烧瓶中,并允许其周期到烧瓶中。
  10. 再重复第二次150毫升。
  11. 将索氏所附加的烧瓶上的加热元件和附加冷凝器。
  12. 开启加热元件上,并把溶剂以温和的沸腾,然后提取了至少16小时确保冷的水被供给到冷凝器。
  13. 使溶剂冷却后,检查以查看是否有任何试样瓶中含有水。对于那些含有水的烧瓶中,加入硫酸钠和摇动,直至水被硫酸钠吸收。
  14. 集中使用氮气样品浓缩或Kaderna丹麦(KD)玻璃安装用热水洗澡的样本。
  15. 允许样品蒸发至小于2毫升的体积,然后通过使用己烷的小洗涤至样品从用于一个5毫升容量瓶中的玻璃器皿传输带至5毫升的最终体积。
  16. 转移到一个10毫升的小瓶样品的信息标签。

  1. 通过添加44克浓硫酸至100g活性硅胶制备酸化的硅胶。
  2. 添加10克酸化硅胶成含有一个小插件的玻璃棉在底部的小层析柱。
  3. 经过预清洗柱,用10ml己烷中加入1 ml样品提取液上柱。
  4. 洗脱的柱用20毫升己烷,并收集在锥形20毫升玻璃试管中。
  5. 放置在氮蒸发器(N-VAP)装置的玻璃管在氮气流中,并浸入热水中。
  6. 蒸发至小于1毫升但不至干。
  7. 从N汽雾装置移除并转移到1-mL容量瓶中,用己烷的小洗涤。
  8. 转移到1.8毫升进样瓶标有样品信息。
  9. 秒杀4μL内标入瓶中。示例现在准备用于分析。

5,肛门ysis的气相色谱 - 质谱联用负化学电离

  1. 使用标准校准仪器:该标准是在混合物组成的良好分离同源组可用。混合1-5包括几乎所有在Arochlors 1016,1221,1232,1242,1248,1254中发现的同系物,和1260混合1被用作多级校正结构,以及系统的线性度由至少准备确认5校准水平介于2和100纳克/毫升的浓度。混合2-5被用作每个同源单点校准。
  2. 成立色谱 - 质谱系统在负化学电离模式进行氢作为载气(1毫升/分钟)和甲烷作为反应气体。
  3. 使用熔融石英毛细管柱(60m×0.25毫米内径)涂覆有DB-XLB,在0.25-μm的膜厚度进行分离。程序烘箱温度为60〜212℃,在25℃/分钟,然后以260℃下以1℃/分钟,然后至280℃,在4℃/分钟,用4分钟的最后保持时间。喷射器和传输线的温度应设定在280℃。注入1〜2微升使用不分流进样模式的样本。
  4. 分析所有样品和标准使用13 C标记decachlorobiphenyl内标法。
  5. 通过运行第二个来源的标准和Aroclors 1242和1260上执行初始校准的检查,然后针对多氯联苯同系物与观察到的款项从这个检查过程比较预测值。
  6. 一旦最初的校准过程已成功完成,完成所有样品的分析。运行一个校验检查每十个样品,使用任何校准混合物从初始校准。

净营养转移效率6。计算

  1. 计算净营养的传输效率,γ,每个组合Ø使用以下方程f罐和PCB同类物:
    式(1)其中[印刷电路板f]的是在水箱在实验结束时,捕食鱼的平均PCB同类物浓度,W f是在罐在实验结束时,捕食鱼的平均重量,[PCB I]是在储罐中的捕食鱼在实验开始时的平均PCB同类物浓度,W i是捕食鱼在实验开始时的平均体重,以及PCB同源物的摄取量指的是重量在实验的过程中,PCB同类物摄取,平均来说,每一个湖鳟鱼中的罐中。
  2. 由猎物鱼的每捕食鱼在水箱杜尔吃过的平均量(重量)的捕食鱼复合乘以PCB同类物的平均浓度计算上述公式中的分母荷兰国际集团的实验的全过程。

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Representative Results

湖鳟鱼呈增长的大量实验过程中,作为初始湖鳟意味着重量介于694至907克而最后的湖鳟意味着权重介于853 1566克( 表1)。食品135天的实验过程中消耗的湖鳟的平均金额介于641至2649克。由实验期间平均的PCB同源物的浓度在湖鳟增加,平均的PCB同源物浓度范围为0.01至7.14纳克/克(湿重)在实验开始时的平均PCB同源物的浓度从0.03范围到29.31结论实验( 表2)。整个九月,抓bloater的10个混合样本平均,PCB同源物的浓度范围为0.03〜26.56纳克/克。整个五月,抓bloater的10个混合样本平均,PCB同源物的浓度范围为0.03〜23.52纳克/克( 表2)。请参阅Madenjian 21,用于在实验中使用的bloater更多细节。

γ的平均估算值由0.309不等,以0.988的基础上,在所有8个罐( 表3)平均。这些平均估计标准误差范围为0.029至0.227。对于所有75 PCB同系物,平均γ为主动湖鳟没有从平均值γ为无效湖鳟显著不同。因此,积极的湖鳟保持距离,他们用几乎相同的效率不活动的湖鳟消耗的食物的PCB同系物。

如氯化每个分子5〜10个氯原子增加的程度,γ的估计值略有减少( 图1)。然而,γ没有显著与PCB同系物的氯化程度各不相同(单因素方差分析:F = 2.16,自由度[DF] = 6,67,P = 0.0579)。整个场均γ所有75个同族,平均值为0.664。

由于log流量增加,从6.0到8.2,γ指数下降( 图2)。下降这率为显著异于零(t检验:T = -4.09,DF = 64,P = 0.0001),但仅相当于7%的单位的log 。根据拟合曲线,γ等于0.70日K 流量 = 6,和γ等于0.61日K 流量 = 8( 图2)。

对于75 PCB同系物66,关于γ的平均估计值的标准误差小(≤0.05)( 表3)。六九个其他PCB同系物,约γ的平均估计值的标准误差是相当低(≤0.10)。更高的标准误差均与较低程度的氯化(每个分子中三至五个氯原子)。

帐篷“FO:保together.within页=”总是“> 图1
图中PCB同系物的净营养转换效率(γ),以湖鳟鱼从它的猎物描绘按照PCB的同类分子的氯原子数的函数1。估计。估计是根据实验室的实验,在此期间,bloaters人送入湖红点鲑。图再现从Madenjian 等人 18的许可。

图2
图中PCB同系物的净营养转换效率(γ),以湖鳟鱼从它的猎物描绘成log氏和多氯联苯同类物的功能2。估计。估计是根据实验室的实验,在此期间,bloaters被送入湖鳟鱼。在安装Ř也显示egression线同源与log氏流量大于6。的R 2值的拟合回归直线表示的变化由log氏解释日志γ的量。图再现从Madenjian 等人 18的许可。

表1初始平均重量和在135天的实验室实验中使用的湖鳟鱼的最终平均重量。Bloaters送入湖鳟鱼。还包括食物,实验的整个过程中吃了一个湖鳟鱼的平均金额。表再现从Madenjian 等人 18的许可。

坦克数量湖红点鲑的初始平均重量(g) 湖红点鲑的最终平均重量(g) 消耗率(g)
1 907 1,345 1,734
2 860 1,339 1,999
3 890 1,518 2,344
4 817 1,566 2,649
5 694 1,242 1,870
6 729 853 641
7 754 1,050 1,203
8 729 1,092 1336

表2初始和最终的PCB同源物的浓度在湖鳟,场均跨越135天的实验室实验中所使用的8辆坦克。平均的PCB同源物的浓度在实验过程中送入湖鳟九月捕获和五月捕获bloaters被也显示。表再版oduced从Madenjian 等人 18的许可。 PCB同系物是根据Ballschmiter 等人,20号。

多氯联苯同类最初的湖鳟的PCB同类物平均浓度(纳克/克) 最后的湖鳟的PCB同类物平均浓度(纳克/克) 九月捕获bloater的PCB同类平均浓度(纳克/克) 可以捕获bloater的PCB同类平均浓度(纳克/克)
19 1.62 3.41 3.27 2.01
22 0.41 0.66 0.36 0.32
28 1.22 2.24 1.27 0.82
31 1.19 1.97 1.13 0.67
44 1.10 2.08 1.09 </ TD> 0.84
45 0.66 1.74 2.25 1.71
46 0.81 2.51 5.23 3.73
47 1.88 5.72 9.10 5.81
52 2.11 3.76 2.05 1.66
60 0.59 2.04 2.10 1.50
63 0.19 0.68 0.74 0.52
70 3.05 10.25 9.43 6.62
74 0.76 2.76 2.35 1.79
82 0.26 0.91 0.80 0.75
83 0.45 1.60 1.62 1.28
85 1.70 6.63 6.38 5.15
87 1.12 3.47 3.09 2.46
92 1.17 4.16 3.91 3.06
95 2.22 5.06 3.09 2.59
97 1.04 3.37 3.08 2.45
99 3.19 12.38 11.95 9.59
101 3.33 10.25 8.90 7.37
105 2.88 11.35 10.80 9.28
110 4.53 15.78 15.55 12.31
115 0.20 1.03 0.69 0.54 117 0.25 1.24 1.19 0.98
118 6.20 24.17 22.94 19.35
124 0.22 0.79 0.77 0.63
128 1.58 6.26 6.03 5.37
130 0.85 3.26 3.24 2.85
131 0.77 2.97 2.89 2.52
134 0.14 0.44 0.42 0.36
135 0.84 3.19 3.16 2.62
137 0.46 1.77 1.67 1.49
138 7.14 28.31 26.56 23.52
141 0.71 2.50 2.45 2.17
144 0.08 0.22 0.19 0.18
146 2.34 9.10 8.96 7.86
149 2.38 8.18 8.25 6.72
151 0.47 1.53 1.43 1.27
156 0.68 2.65 2.31 1.96
158 0.64 2.42 2.36 1.99
163 2.92 10.24 10.07 8.94
164 0.47 1.81 1.79 1.58
167 0.43 1.65 1.64 1.43
170 1.03 3.94 3.71 3.47
171 0.39 1.46 1.43 1.26
172 0.38 1.45 1.41 1.30
174 0.48 1.83 1.84 1.67
175 0.11 0.42 0.42 0.37
176 0.03 0.09 0.09 0.09
177 0.72 2.67 2.65 2.45
178 0.61 2.33 2.26 2.03
179 0.17 0.60 0.58 0.55
180 3.35 12.84 11.97 10.73
183 1.18 4.44 4.32 3.79
185 0.04 0.14 0.14 0.14
187 3.12 12.07 11.65 10.67
190 0.27 1.02 1.18 1.02
191 0.05 0.20 0.20 0.17
193 0.27 1.03 0.94 0.87
194 0.46 1.73 1.66 1.55
195 0.14 0.54 0.53 0.49
196 0.30 1.12 1.15 1.03
197 0.06 0.23 0.23 0.20
199 0.67 2.44 2.17 2.12
200 0.01 0.03 0.03 0.03
201 0.14 0.53 0.52 0.48
202 0.31 1.14 1.12 1.02
203 0.48 1.83 1.83 1.61
205 0.02 0.09 0.09 0.08
206 0.19 0.70 0.70 0.65
207 0.07 0.25 0.26 0.24
208 0.11 0.41 0.43 0.40
209 0.11 0.36 0.38 0.36

表PCB同系物的净营养转换效率(γ),以湖鳟鱼从它的猎物3均值估计。估计是根据135天的实验室实验,在此期间,湖鳟喂食bloaters。对于每一个同类,从八个坦克γ估计的平均值,得到平均估值。平均值的标准误差括在括号中。表再现从Madenjian 等人 18的许可。 PCB同系物是根据Ballschmiter 等人,20号。

多氯联苯同类意思是γ 平均值的标准误差
19 0.563 0.046
22 0.813 0.127
28 0.900 0.086
31 0.848 0。065
44 0.988 0.058
45 0.474 0.058
46 0.309 0.035
47 0.401 0.029
52 0.911 0.059
60 0.625 0.034
63 0.596 0.036
70 0.702 0.039
74 0.753 0.050
82 0.700 0.038
83 0.644 0.039
85 0.677 0.037
87 0.699 0.038
92 0.681 0.032
95 0.887 0.102
97 0.683 0.032
99 0.675 0.035
101 0.705 0.035
105 0.678 0.035
110 0.647 0.037
115 0.957 0.227
117 0.704 0.050
118 0.680 0.035
124 0.655 0.037
128 0.666 0.035
130 0.644 0.034
131 0.659 0.037
134 0.646 0.032
135 0.653 0.034
137 0.675 0.035
138 0.686 0.033
141 0.639 0.037
144 0.680 0.050
146 0.650 0.034
149 0.628 0.036
151 0.653 0.034
156 0.733 0.051
158 0.657 0.032
163 0.632 0.042
164 0.648 0.035
167 0.642 0.033
170 0.668 0.039
171 0.649 0.038
172 0.649 0.035
174 0.646 0.037
175 0.632 0.038
176 0.636 0.046
177 0.636 0.031
178 0.654 0.040
179 0.647 0.034
180 0.681 0.036
183 0.654 0.038
185 0.611 0.036
187 0.659 0.036
190 0.549 0.031
191 0.629 0.032
193 0.693 0.037
194 0.654 0.035
195 0.643 0.039
196 0.614
197 0.640 0.040
199 0.696 0.036
200 0.543 0.042
201 0.634 0.040
202 0.639 0.036
203 0.631 0.036
205 0.645 0.038
206 0.617 0.036
207 0.606 0.039
208 0.592 0.038
209 0.570 0.037

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Discussion

为γ的最准确的估计,实验者必须能够准确地跟踪食品的两个实验的过程中,放置在每一个容器并在每个罐的食物残渣的量的量。为了实现这一点,实验者必须能够从罐取出所有的食物残渣和准确地确定其重量。除了由捕食鱼实际上吃过的食物的准确的跟踪,γ的精确估计也可能依赖于实验的足够持续时间。鉴于广泛引用的实验室研究专门设计来估计多氯联苯营养转移效率对鱼类从他们的食物从105到224天不等的持续时间22,23,持续时间为至少100天,最好至少有130天里,建议。另外,偏压可以在记录开始时被引入γ的估计通过对采样的PCB测定捕食鱼的数量不够eriment 14。获得的捕食鱼的PCB浓度并不代表PCB平均浓度都在下降的样本大小的油箱​​增加了捕食鱼类样本的概率。理想情况下,一半在储罐中的鱼应在实验开始时被处死的PCB测定。

为了最大限度地提高针对性和实验室试验结果的应用领域,这通常是在现场吃的捕食鱼捕食鱼应该在实验室实验中被送入捕食鱼类。净营养转移效率可取决于含多氯联苯同源11,24食物基质的性质。从以往的研究证据表明,基于商业颗粒饲料γ的估计可能比基于捕食鱼类摄食实际捕食鱼类17γ估计少得多。捕食鱼类因此,节食,而不是处理或SYnthesized的饮食建议。

为了尽量减少γ的估计的不确定性,无论是捕食鱼类和猎物的鱼复合材料应该很均匀的。均质化的程度取决于,部分地基于可用的集搅拌机和搅拌机。对于大型捕食鱼,大混合器可能需要启动均化过程。从大型搅拌机匀浆的子样本可能被转移到一个较小的混频器,其中可以实现较高程度的同质化。

准确地确定在PCB同源物的浓度匀浆鱼组织样品中的准确估计γ的各种PCB同系物的过程中的一个关键组成部分。样品必须在后续的提取工艺去除基质干扰,并实现检测的PCB同系低水平适当清洗。使用气相色谱 - 质谱联用系统具有负在单一离子模式运行的化学电离源可导致检测浓度低至中提取的氯化度更高的多氯联苯同源0.02纳克/毫升,虽然检出限为低氯代多氯联苯同源会比该值25相当高。电子捕获检测器可以被取代的负化学电离仪和这种方法将提供低电平的检测,但也将更加容易受到基质干扰。取决于PCB的同类浓度均匀鱼组织样品中,研究人员将需要决定哪个方法(负化学离子化或电子捕获)是比较合适的。对于非常低的PCB同源物的浓度,该电子捕获方法可能必须被使用。但是应当指出,接近检测限的测量往往具有相对较低的精确度和准确度由于分析误差26。

该方法在这项研究中详述可以很容易地调整,以便解决新问题的研究在印刷电路板的积累在鱼类的领域。例如,如上所述,γ可以通过进料速率的影响。以前的工作表明,γ与食品消费14,17的增长速度下降。究竟如何γ随摄食率变化?做之间或γ和log ,γ和氯化程度之间的关系已经阐明该研究对鱼类自由采食,保持一致,以较低的进给速率?下列哪两个因素对γ较大的影响:食物的量,每天或喂食的频率消耗( 一天一次与每两三天喂一次,喂)?其中,以下两个因素对γ较大的影响:食物的重量,每天或能量在每一天所消耗的食物的量消耗?冰毒odology在这项研究中详述很适合回答这些问题,因为这两个摄食率和食物类型可以在实验室中进行控制。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
870-L fiberglass tanks Frigid Units RT-430-1
2,380-L fiberglass tanks Frigid Units RT-630-1
Tricaine methanesulfonate (Finquel) Argent Chemical Laboratories, Inc. C-FINQ-UE-100G Eugenol could also be used as an anesthetic.
Ashland chef knife Chicago Cutlery SKU 1106336
Cutting board Williams-Sonoma 3863586
Hobart verical mixer (40 quart) Hobart Corporation
1.9-L food processor Robot Coupe, Inc. RSI 2Y1 
Polyethylene bags (various sizes) Arcan Inc.
I-Chem jars I-Chem 220-0125
Top-load electronic balance Mettler Toledo Mettler PM 6000 
Sodium sulfate, anhydrous - granular EMD SX0760E-3
Glass extraction thimbles (45 mm x 130 mm) Wilmad-Lab Glass LG-7070-114
Teflon boiling chips Chemware 919120
Rapid Vap nitrogen sample concentrator Labconco 7910000
N-Vap nitrogen concentrator Organomation 112
Soxhlet extraction glassware (500 ml) Wilmad-Lab Glass  LG-6900-104
Hexane Burdick & Jackson  Cat. 211-4
Dichloromethane Burdick & Jackson  Cat. 300-4
Silica gel BDH Cat. BDH9004-1KG
Labl Line 5000 mult-unit extraction heater Lab Line Instruments
Agilent 5973 GC/MS with chemical ionization Agilent 5973N
Internal standard solution  Cambridge Isotope Laboratories EC-1410-1.2
PCB congener calibration standards Accustandard C-CSQ-SET
DB-XLB column (60 m x 0.25 mm, 0.25 micron) Agilent/ J&W 122-1262

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References

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