종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사​​용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

Biology
 

Summary

우리는 명 시야 현미경으로 이미지화 입체 종양 구형 체의 크기를 측정하기 위해 높은 처리량 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션을 제시한다. 이 응용 프로그램은 약물 화면에서 상체를 사용하고자하는 연구자들에게 도움이됩니다 상체에 치료 약물의 효과를 조사하기 위해 신속하고 효과적인 방법을 제공합니다.

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Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

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Abstract

약물 발견을위한 시험 관내 모델로서 3 차원 (3D) 종양 상체의 애플리케이션의 수가 증가 대형 이미지 분석을 포함하는 약물 스크린의 모든 단계에서 대규모 스크리닝 형식으로 자신의 적응을 필요로한다. 현재이 대규모의 포맷에 부합하는 사용 준비하고 자유로운 이미지 분석 소프트웨어는 없다. 대부분의 기존의 방법은 수동 지루하고 시간 소모적 인 프로세스이다 묘화 된 3D 상체의 길이 및 폭을 포함하는 도면. 이 연구 결과는 높은 처리량 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션 제공 - SpheroidSizer 자동 정확하게 묘화 된 3D 종양 상체의 주 및 부 축 방향 길이를 계측하고; 각각의 3D 종양 타원체의 체적을 계산한다; 그 후에 후속 데이터 분석에서 락 조작위한 스프레드 시트의 두 가지 형태의 결과를 출력한다. 이 소프트웨어의 주요 장점은 강력한 이미지 분석 애플리케이션이다대량의 이미지에 대한 적응. 그것은 높은 처리량 계산 및 품질 관리 워크 플로우를 제공합니다. 1000 이미지를 처리​​하는 시간은 예상 최소 구성으로 노트북에 약 15 분, 또는 멀티 코어 성능 워크 스테이션에서 약 1 분이다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)도 락 품질 제어를 위해 설계되고, 사용자가 수동으로 컴퓨터의 결과를 무시할 수있다. 이 소프트웨어에 사용되는 핵심 방법은 종종 높은 처리량 화면에서 자동 영상 처리를 괴롭히는 고르지 조명과 시끄러운 배경 이미지에 특히 적합 또한 뱀으로 알려진 활성 윤곽선 알고리즘에서 구성된다. 무료 "수동 초기화"와 "손 그리기"도구는 상체와 다양한 품질의 이미지의 여러 유형을 다루는 SpheroidSizer 할 수있는 유연성을 제공한다. 이것은 높은 처리량 이미지 분석 소프트웨어 현저 노동을 감소시키고 분석 프로세스의 속도. 이 소프트웨어를 구현하는 것은 나입니다업계와 학계의 약물 스크린에 대한 시험 관내 모델의 일상이 될 3D 종양 상체에 eneficial.

Introduction

3 차원 (3D) 종양 상체는 1-3 "세포 부착을위한 인공 기판과 조직에 유사한 종양 세포의 구형 대칭 집계,"입니다. 종양 세포 검사 및 형태학 잘 모방 생체 내 종양 조직 조직 및 단층 이차원 (2D) 세포 미세 환경을보다 상체. 3D 종양 상체는 높은 처리량의 항암 치료 약물의 검사 또는 후보 약물의 효능을 조사하기위한 실제적인 시험 관내 모델이되고있다 생체 내 동물 또는 임상 시험 4 전. 임상 적으로, 임의의 항암 약물 치료의 효능이 감소 된 종양 성장에 따라 평가된다. 유사하게, 회전 타원체 양은 체외 항암제 연구에 대한 효능의 척도로 사용될 수있다. 회전 타원체 부피 (V = 0.5 * 세로 * 폭 2) (더 일반적으로 길이와 너비로 알려진) 메이저와 마이너 축 방향의 길이에 따라 결정된다상체의 6, 7. 대부분의 연구자들은 수동으로 자주 현미경 회사에서 제공하고 영상 기기와 함께 판매 된 소프트웨어를 사용하여, 각각의 회전 타원체의 길이와 폭을 그릴 수있다. 높은 처리량 약물 스크린이 수행되고 이미지 이상의 백을 제조 할 때이 기술은 문제가된다. 최근의 일부 연구는 조명 보정 및 간단한 임계 값을 포함 초보 분할 루틴 / 매크로를 개발하는 등 CellProfiler 8 ~ 10과 ImageJ에 11 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 도구 상자의 사용을보고했다. 이러한 루틴은 종종 조명 조건 및 이미지 콘트라스트 변화에 따라 이미지의 다른 배치를 위해 재조정 될 필요가있다; 따라서, 이러한 소프트웨어 패키지는 높은 처리량 이미지 분석의 견고성 요건을 충족 할 수 없다. 프리드리히와 합작 (2009) 회전 타원체의 볼륨을 반 자동 게이트를 측정하는 독점 소프트웨어를 사용atically 5. Monazzam와 그의 동료 '종이 (10)에 기술 된 방법은 이미지의 작은 번호의 회전 타원체의 크기를 측정하는 반 자동화 된 방법이었다. 따라서 3D 종양 상체위한 강력한가요 자동화 및 즉시 사용 이미지 분석 도구에 대한 명확한 필요성이 존재한다.

이 연구에서, 우리는 SpheroidSizer을 설명 - MATLAB 기반의 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램을 자동으로 정확하게 종양 상체의 크기를 측정 할 수 있습니다. SpheroidSizer은 같은 세션에서 3D의 상체의 이미지의 다양한 배치를 처리하도록 설계되었습니다. 활성 윤곽선 알고리즘 12-14을 활용, SpheroidSizer는 견고 배경 조명의 점진적인 변화를 무시하고 이미지의 회전 타원체를 인식, 이미지 콘트라스트 변화를 견딜 수 있습니다. 또한 예를 들어, 파편, 시편에서 유래 많은 보통의 유물을 견딜 수 있습니다. 사용자가 품질 관제사를 수행 할 수 있도록 워크 플로우 설계L 중 또는 계산 후. 분석 결과의 수동 오버 라이트 쉽게 자리에서 수행 될 수있다. 병렬 컴퓨팅 툴박스의 활용, 분석 속도가 더 사용자의 컴퓨터에 동시에 계산에서 작동하는 여러 개의 컴퓨팅 코어를 조정에 의해 증폭 될 수있다. 더욱이 SpheroidSizer 하류 분석 도구로 쉽게 인터페이싱 할 수 있도록 두 개의 상이한 형태로 결과를 출력한다.

Protocol

우리의 이전 논문 (15)에 설명 된대로 1. 3D 종양 회전 타원체의 형성, 약물 치료 및 이미지 수집이 수행됩니다.

2. 소프트웨어 설치

  1. 이미지 분석에 사용되는 컴퓨터에 허가 된 MATLAB 소프트웨어를 설치합니다. MATLAB에서 다음 도구 상자도 설치해야합니다 - 신호 처리 도구 상자, 이미지 처리 도구 상자 및 병렬 컴퓨팅 도구 상자 * (* 병렬 컴퓨팅 모드에만 필요).
    주 : 소프트웨어가 다운로드 및 소속 과학자들에 의해 사용될 수 자유롭게되도록 많은 대학 그룹의 라이센스를 구입하고 유지.
  2. SpheroidSizer.zip 파일에서 SpheroidSizer 프로그램을 설치 (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip)
    1. 로컬 파일 시스템에서 zip 파일을 저장합니다.
    2. SpheroidSizer 파일의 압축을 풉니 다.
    3. 이어서 t 라한다 지정된 디렉토리 / 폴더에 파일을 저장그는 "설치 디렉토리".
      참고 : SpheroidSizer 광범위 Windows 7 운영 체제에서 테스트되었습니다. 그것은 최소한의 조정 (테스트하지)와 다른 운영 체제에서 작동 할 것으로 예상된다.

SpheroidSizer하여 이미지 분석을위한 3. 준비

  1. (픽셀 (μm의 / PIX) 당 미크론 이미지의 절대 규모) 영상 시스템의 이미지 스케일 / 해상도를 결정합니다.
    주 : 카메라 칩의 각 화소의 크기가 알려져 있다면, 이미지 스케일 대물 배율 X 화소 사이즈 (μM / PIX)로 계산 될 수있다. 이 값은 내장 된 메타 데이터로 현미경 또는 이미징 시스템 공급 업체로부터 도움을 탑재 이미징 소프트웨어로부터 얻을 수있다. 이 값은 4.6 단계에 필요합니다.
  2. TIFF, JPEG 및 기타 일반적인 이미지 파일 형식 - 가능한 파일 형식으로 모든 고유의 이미지 파일 포맷을 변환합니다.
  3. 이미지 파일의 이름을 지정하고 directori을 마련ES (그림 5A).
    참고 :이 소프트웨어는 플레이트 형식으로 결과를 다시 포맷하는 디렉토리 구조와 파일 이름의 적절한 레이아웃을 사용합니다 :
    1. 다음과 같은 형식의 이미지 파일 이름 : [플레이트 이름] _ [행] [열] [확장] 또는 [플레이트 이름] [공간] [행] [열] [연장]... [행]는 알파벳 순서를 따라와 [열] 숫자 순서를 따릅니다.
      참고 : 자유롭게 사용할 수 있습니다 자동 배치 이름 바꾸기 소프트웨어는이 단계에서 사용자를 지원하기 위해 찾을 수 있습니다.
    2. 각각의 실험이 하나의 디렉토리가 있어야합니다 다음과 같은 방법으로 실험을 기반으로 디렉토리 / 폴더를 정렬합니다. 각 실험의 디렉토리에서, 각 시점에 대한 하위 디렉토리가 있어야합니다. 각 시점의 하위 디렉터리에서 모든 접시의 모든 이미지가 있어야합니다.
      참고 : 최적의 포맷 결과를 정렬 할 수있는 분석 결과를 위해, 우리는 L에 0의를 작성하여 각 식별자의 숫자가 같은 수를 유지하는 것이 좋습니다EFT, 예를 들면, 시점은 000H, 072H 및 144H로 지정됩니다.

SpheroidSizer로 상체의 4. 이미지 분석

  1. 오픈 MATLAB은 다음 "명령 창"에서 cd​​ '[설치 디렉토리]를 눌러 [RETURN]을 엽니 다.
  2. SpheroidSizer 프로그램을 시작합니다 "명령 창"나 [RETURN]의 "SpheroidSizer1_0"를 입력합니다.
  3. 모든 이미지를 포함하는 실험의 디렉토리를 선택 SpheroidSizer1.0 창에서 "찾아보기"버튼을 클릭합니다.
  4. 선택 지정된 디렉토리에 여러 중첩 된 이미지 폴더를 처리 할 수​​있는 "폴더"텍스트 필드 아래에 토글 "하위 폴더 포함".
    참고 : 토글 만 직접 디렉토리 아래의 이미지가 처리되는 선택하지 않고, 모든 하위 폴더는 무시됩니다 "하위 폴더 포함"합니다.
  5. DISP하기 위해 "온 - 더 - 플라이 표시"옵션을 선택합니다계산이 실행되는 등의 품질 관리를위한 그것의 소스 이미지의 상단에 각각의 분할 된 화상을 놓는다.
    참고 : "온 - 더 - 플라이 표시"옵션을 선택하지 않은 경우 연산 속도가 빠르다.
  6. 프로그램이 제대로 픽셀에서 μm의 구형의 측정을 변환하는, 상자의 분석 이미지의 "해결 방법"(μm의 / PIX의 이미지 스케일 / 해상도)을 지정합니다.
    참고 : 이미지 스케일 / 해상도가 각 실험에 대한 일정하게 유지되도록 모두 같은 폴더에있는 이미지 나 함께 분석은 같은 목적으로 같은 현미경으로주의해야한다.
  7. (선택 사항) 사용자는 고급 사용자 정의 설정을위한 5 단계를 볼 수 있습니다.
  8. 계산을 시작하기 위해 "계산"을 클릭합니다.
    참고 :이 소프트웨어는 계산을하기 전에 자동으로 파일 이름을 검사를 실시하고 있습니다. 대화 상자가 표시 나타난다면 - "오류가 파일 이름에있는"클릭 "종료 및 오류의 목록을 표시"과 (단계 3.3 참조)에 나열된 파일 이름에 오류를 수정. 그런 다음, 다시 계산을 시작하기 위해 "계산"을 클릭합니다.
  9. 계산을 일시 정지 "일시 정지"버튼을 클릭; 그리고 계산은 "계속"을 보여주는 동일한 버튼을 클릭하여 다시 시작할 수 있습니다.
    참고 : (단위 : μm) "결과 표는"(μm의에서) "폴더", "파일"(mm 3), "볼륨", "길이"를 표시, "폭"및 "유효"(확인란) 분석 상체 (그림 5C)의 모든. 볼륨이 측정 장축 (길이)과 단축 (폭)을 기준으로 계산된다 (V = 0.5 * 세로 * 폭 2). "유효한"체크 상자에는 이미지의 분석 품질 관리 후 유효 또는 무효 인 경우 6 단계를 참조 선택할 수있는 사용자에 대한 옵션입니다.

5. 고급 사용자 정의 설정

  1. Spher에서 "고급"버튼을 클릭oidSizer1.0 사용자 정의 설정 (그림 5B)을 조정하기 위해 고급 구성 창을 가져올 수있는 창입니다.
  2. "입력"아래의 고급 구성 창에서 "포맷 출력"에 대한 관심의 파일 이름과 "리스트 출력"상자를 입력합니다.
  3. "감소"상자에 "2-10"숫자를 입력합니다. 이것은 연산 속도를 향상시키기 위해 연산의 이미지 크기를 줄이기 위해 소프트웨어에 대한 계수이다. 큰 숫자는 더 빠른 계산 속도이다. 기본 "감소"가 10로 설정되어 있습니다.
  4. "유형을 포함"상자에 -로 처리 된 이미지 파일 확장자를 입력합니다.
  5. "_crude.jpg"다음과 같이 "유형 제외"상자에 프로그램에 의해 처리 될 수 없습니다 이미지 파일 확장자 또는 엔딩을 입력합니다.
  6. 8 비트 및 16 비트 콜을 처리하기 위해 "특별한 색상"에 대한 "없음"을 선택또는 제대로 이미지; 제대로 12 비트 컬러 이미지를 처리​​하는 "특별한 색상"에 대해 "12 비트"를 선택
  7. 이미지 분석에 사용 된 컴퓨터가 여러 개의 CPU 및 / 또는 멀티 코어 CPU가 장착되어있는 경우 "병렬 컴퓨팅을 사용하여"확인합니다. 이것이 사실이라면, 5.7.1 단계로 이동합니다; 하지 않을 경우, 다음 단계의 5.7.1과 5.7.2를 건너 뜁니다.
    참고 : 사용중인 컴퓨터가 선택한 구성을 지원하지 않는 경우 오류가 발생합니다.
    1. 고급 구성 창에서 "사용 병렬 컴퓨팅"옵션을 선택합니다.
      참고 : 4 개 이상의 코어가 컴퓨터에 사용할 수있는 경우에만 병렬 컴퓨팅 모드를 사용합니다.
    2. "# 근로자"4-12 사이의 숫자를 입력합니다 (코어 컴퓨팅) 상자.
      NOTE :이 숫자는 동일하거나 또는 사용자의 컴퓨터의 컴퓨팅 코어 수 이상이어야한다. 12의 최대가 MATLAB 병렬 컴퓨팅 툴박스에서 부과하는 12 코어의 최대 지원합니다. 병렬 컴퓨팅이 될 때ING는 완료하는 병렬 계산을 기다리는를 묻는 작은 대화 상자가 표시됩니다를 실행; 계산은 일시 중지하고도 병렬 컴퓨팅 모드에서 실행되는 "온 - 더 - 플라이 표시"기능입니다 수 없습니다.

6. 품질 관리

  1. 분석 된 이미지의 회전 타원체의 정확한 경계의 윤곽을 확인하기 위해 "결과 표"에서 해당 셀을 클릭
    참고 : 원본과 품질 관리 이미지가 검토를 위해 오른쪽에 표시됩니다. 사용자가 순차적으로 키보드의 아래쪽 화살표를 사용하여 모든 이미지를 확인할 수 있습니다.
  2. 필요한 경우, 다음 두 도구를 사용하여 상기 선택된 이미지를 회전 타원체의 경계 분류 :
    1. 원래 이미지를 표시하려면 "수동 초기화"버튼을 클릭합니다. 다음을 클릭 한 채로 오른쪽으로 회전 타원체 외부 마우스와 원본 이미지의 구형을 커버하는 타원 도구를 드래그합니다.
      참고 :ctive 컨투어 알고리즘은 사용자가 제출 한 형상을 이용하여 시작하고, 원하는 구형 개요에 수렴하도록 실행한다. "결과 표"가 자동으로 새로운 결과로 업데이트됩니다. "수동 초기화"도구는 사용자가 수동으로 액티브 윤곽에 대한 초기화를 제공 할 수 있습니다.
    2. 원래 이미지를 표시하려면 "손 그리기 '버튼을 클릭합니다. 그런 정확하게 회전 타원체의 경계를 그리는 마우스 나 터치 스크린 사용을 사용합니다.
      참고 :이 개요는 직접 "결과 표"에 업데이트됩니다 메이저와 마이너 축 생성하는 측정한다. "수동 초기화"도구는 회전 타원체의 원하는 경계에 수렴하는 데 실패하는 경우에만 "손 그리기"도구를 사용합니다.
  3. 이미지가 검사시 유효한 회전 타원체를 포함하지 않는 "결과 표"의 해당 행의 "유효한"열에서 확인란의 선택을 취소합니다. "; 잘못된 "레이블은 품질 관리 이미지의 왼쪽 위 모서리에 나타납니다. "유효한"는 선택하지 않으면, 모든 측정 값은 내 보낸 서식 및 출력 결과 파일의 회전 타원체에 대한 비어 있습니다.
    참고 : 다음과 같은 키보드 바로 가기는 "결과 테이블"에서 사용할 수 있습니다 : 다음 이미지에 대해 "아래쪽 화살표"; 유효 / 무효를위한 "V"; "손 그리기"도구 "수동 초기화"도구 "H"의 "M".

7. 저장 및 데이터 내보내기

  1. 사용자가 프로젝트를 완료하기 전에 소프트웨어를 종료해야하는 경우, 분석의 중간 상태를 내보낼 SpheroidSizer1.0 창에서 "내보내기 연구"버튼을 클릭합니다. 저장 될 파일의​​ 이름과 디렉토리를 지정합니다.
  2. "수출 연구"에서 위의 중간 상태의 결과를 다시 데려와 예배에 계속 "가져 오기 연구"버튼을 클릭그것에 K.
    참고 : 중간 상태 파일은 기본 MATLAB 형식 (. 매트)에 있고 다른 소프트웨어 프로그램에서 직접 읽을 수 없습니다. 소프트웨어에 내장 된 안전 기능은 프로그램이 실수로 종료 경우에 열려있는 프로젝트를 자동으로 수출을합니다. 필요한 경우, 사용자 이름이 [설치 디렉토리]에 해당하는 타임 스탬프를 포함 "~ TMP"로 시작하는이 파일을 찾을 수 있습니다.
  3. 결과를 저장하는 SpheroidSizer1.0 창에서 "형식 결과"를 클릭합니다.
    참고 : 결과의 두 가지 형태가 실험의 디렉토리에 저장됩니다. 내 보낸 파일 이름 (프로토콜 단계 5.2 참조) 고급 구성 창에 구성 할 수 있습니다. 포맷 출력 파일은 각 시점에 대한 상승 번호판의 순서 원판 포맷으로 볼륨 값을 구성 탭 - 구분 된 테이블이다; 모든 시점은 오름차순 (그림 5D)로 구성됩니다. 목록 Output 파일을 정렬 목록 (그림 5E)의 형태로 모든 측정을 포함하는 탭으로 구분 된 테이블입니다.

Representative Results

SpheroidSizer이 이미지의 많은 양에 대한 현저하게 감소 된 노동 및 급성 효율성 증가와 함께, 자동 감지, 묘사와 3D 상체를 측정 할 수 있도록 고안된 것입니다. 그림 1A는 SpheroidSizer의 흐름을 보여줍니다. 핵심 연산 단계는 자동 초기화, 활성 윤곽선 알고리즘과 윤곽 정량화 있습니다. 후 계산을 자동화, 품질 관리 기능은 불완전한 분할을 얻기 위해서 "수동 초기화"와 "손 그리기"도구의 조합을 사용합니다. 그림 1B는 자세한 자동화 된 활성 윤곽선 알고리즘을 보여줍니다. 초기화 단계 (제 0 반복)의 회전 타원체의 대략적인 크기 및 위치를 생성하고 예상 크기와 구형 개시 형상을 생성하는 기본적인 화상 처리 단계를 이용한다. 개시 윤곽은 활성 윤곽 알고리즘에 공급한다. 다시는 로컬 이미지에 따라 조정하는 반복그라데이션 모양의 곡률. 윤곽 (수렴)을 안정화 할 때 활성 윤곽 알고리즘이 완료, 이미지, 또는 경우에 대한 477 반복은 반복의 미리 정의 된 최대 수는 실행됩니다. 이 예에서, 초기화 형상이 의도적으로 더 나은 알고리즘을 선보일 확대됩니다. 실제로, 초기화는 통상 실제 경계에 매우 가깝다 훨씬 적은 반복은 수렴 알고리즘에 필요하다. 그 후, 알고리즘은 상기 검출 된 회전 타원체 경계의 형태 계측 학적 측정 걸린다. 회전 타원체의 메이저와 마이너 축이 MATLAB 이미지 처리 도구 상자 (그림 1C)를 사용하여 측정된다. 장축은 길이 (L)로 언급된다 윤곽에 가장 먼 점의 단일 쌍을 연결하는 선분으로서 정의된다. 보조 축이 폭 (W)이라한다 장축에 수직 인 가장 긴 선으로 정의된다. 이 경우, L 및 W의 값은 이후 매우 가까운구형은 구형입니다. 회전 타원체의 부피는 V = 0.5 * 패 * 승 2로 계산됩니다.

SpheroidSizer의 특징 중 하나는 고르지 또는 시끄러운 배경 활성 윤곽선 알고리즘 (그림 2B-D)를 이용와 이미지의 회전 타원체의 경계의 자동 감지합니다. 시야 이미지의 전산 처리는 종종 원치 않는 임계 결과를 생산하기 위해 적응 형 임계 값 기반의 방법을 잘못 인도하는 고르지 못한 배경에 시달리고있다. 멀티 웰 플레이트를 사용하고, 웰의 벽은 이미지에 그림자 효과를 생성 할 수있다 때 문제는 특히 명백하다. 활성 윤곽선 알고리즘은 배경에서 점진적으로 음영의 변화에 민감하지 않기 때문에 그러나,. 2 요철처럼 울퉁불퉁하거나 시끄러운 배경 이미지의 몇 가지 예를 보여줍니다 적절한 초기화 이러한 시야 이미지의 회전 타원체의 세그먼트를 식별 할 수 있습니다 조명 (그림 2B (그림 2C) 또는 괴사 코어 (그림 2D). 각 그림의 하단 패널에 빨간색 윤곽과 같이 자동화 된 활성 윤곽선 알고리즘으로, SpheroidSizer이 모든 이미지에 정확하게이 상체를 묘사한다.

SpheroidSizer의 품질 관리 기능은 높은 처리량 워크 플로우의 핵심입니다. "수동 초기화"와 "손 그리기"도구는이 응용 프로그램에 대한 가치있는 무료 도구입니다. 이미지의 수백 또는 수천 중에서, 자동화 알고리즘 올바르게 일부 이미지에서 상체를 감지 할 수없는 것을 피할 수 없다. 회전 타원체의 부적절한 검출 인해 초기화 단계로 발생도 3a에 도시 된 바와 같이, 부적절한 크기 또는 이미지 (상단 패널)에서 개시 형상의 위치는 "수동 초기화"도구는 사용자가 적절하게 허용하는 방식으로 작동합니다 spher의 위치 및 크기를 정의하는수동 (아래 패널) OID. 수동으로 정의 된 윤곽으로 시작하고 원하는 윤곽선을 수렴하기 위해 실행할 수있는 활성 윤곽선 알고리즘을 트리거합니다. 그림 (b)에 원본 이미지와 같은 이러한 어려운 이미지의 회전 타원체는 산만하고 시끄러운 배경에 있습니다. SpheroidSizer 제대로 자동화 된 방법 (상단 패널) 또는 적절한 초기화 (중앙 패널)와 "수동 초기화"도구를 사용하여 회전 타원체를 식별 할 수 없습니다. 이 경우에는, 「손 그리기 "툴은 하부 패널에 나타낸 바와 같이 수동으로 회전 타원체의 윤곽을 그릴 수있다. 프로그램은 타원체의 주요 및 보조 축을 측정하고 양을 계산하기 위해 사용자 정의 된 경계를 사용한다. 모든 수정 된 결과는 즉시 "결과 표"에 통합하고 그에 따라 내보낼 수 있습니다.

큰 데이터 집합에 SpheroidSizer의 성능을 확인하기 위해, 우리가 처음으로 수술 시간을 비교현미경, 벤더가 제공하는 소프트웨어와 함께 1) 수동 측정을 사용하여 288 이미지의 집합을 분석하는 단계; 싱글 코어 일반 노트북 2) SpheroidSizer; 및 3) 멀티 코어 병렬 컴퓨팅 성능 워크 스테이션과 SpheroidSizer. 수동 측정 전에 소프트웨어를 개발하는 우리의 일반적인 프로토콜을 따르 각 회전 타원체의 길이와 폭은 손으로 그려진 및 공급 업체 프로그램 (그림 4A의 상단 패널에있는 빨간색 선을 볼 때)를 사용하여 측정된다; 다음 사용자 복사 측정 값 아래로. SpheroidSizer (그림 4A의 하단 패널에 빨간색 윤곽을 그림과 같이), 회전 타원체의 경계를 생성하는 축 메이저와 마이너의 길이를 측정하고, 스프레드 시트에 결과를 내보내는 방법으로 각각의 이미지를 처리합니다. 표 1에서 알 수있는 바와 같이, 이미지 (288)에서의 계산에 기초하여 수동으로 이미지 당 하나의 타원체를 측정하도록 31.67 초의 평균 소요된다; 그것은 단지 SpheroidSizer보다 2 초 &를 사용하는 동안 # 160; 싱글 코어 일반 노트북에서 실행하는 경우; 이하 1 초 12 코어 성능 워크 스테이션에서 실행하는 경우. 따라서, 이미지 분석은 수동 측정보다 SpheroidSizer를 사용하여 이미지 당 18 배 이상 빠르다. 이미지의 수천 이상을 분석 할 때 그것은 극적으로 노동을 줄일 수 있습니다. 다음으로, 우리는 수동 측정과 SpheroidSizer 사이도 4a에 도시 된 24 회전 타원체의 측정의 변화를 비교. (24) 상체는 두 가지 방법으로 세 번 측정; 그리고 각 회전 타원체의 표준 편차가 계산된다. 그림 (b), SpheroidSizer (녹색 선 및 점)의 표준 편차에서 보는 바와 같이 여전히 수동 측정 방법에서보다 더 작은 표준 편차를 표시 품질 관리 단계에서 수정 된 세 가지 상체를 제외하고 제로에 가깝습니다. 이러한 모든 SpheroidSizer보다 효율적이고 정확하게 이미지 분석을 수행하는 것을 나타낸다.

e_content "> We는 생체 내에서 항 종양 효과를 시험하기위한 잠재적 인 후보들이다. 성격 BON-1 차원 종양 상체를 성장시켰다 HSP90 억제제와 조합하여 화합물 된 알 인간 BON-1 차원 종양 상체를 사용하여 약물 검사를 실시 이전 글 (15)에 설명 된대로 아가 로스 코팅 96 - 웰 플레이트에. 여섯 시리얼 희석 플러스 미디어 및 차량과 8 개의 서로 다른 화합물은 각각 10 nm의 중복에 20 nm의 HSP90 억제제와의 단일 및 조합의 효과에 대한 검사를했다. 두 상체가 있었다 개별 화합물 또는 결합 된 화합물의 각 농도에 사용됩니다. 총 384 상체와 4 개의 96 - 웰 플레이트를 사용 하였다. 모든 상체가 0에서 72, 144, 168, 192 시간을 몇 군데 있었다. 1,920 이미지의 총 생산되었다 이 실험에서. 그것은 품질 관리 및 데이터 수출을위한 추가 50 분에 1,920 이미지의 전산 분석을 완료 SpheroidSizer에게 30 분을했다. Sphero에게idSizer 엄청나게 이미지 분석 프로세스 속도가 빨라집니다. 그림 5A는 프로토콜의 단계 3.3에 대한 예를 들어이 실험의 폴더 배치 및 파일 이름의 스크린 샷을 보여줍니다. 피규어 5B-E는 이미지 분석 팝업 창 및 결과의 스크린 샷을 보여줍니다 . 치료의 시간에 대한 화합물의 처리에 따라 3D 종양 상체의 성장 - SpheroidSizer에서 내 보낸 형식의 결과 테이블에서 3D 상체의 볼륨을 촬영 프로토콜 단계 4 삽화, 5, 7로 SpheroidSizer를 사용하여, 우리는 그래프를했다. 이 실험에서 두 대표 그래프는 그림 5 층과 세대에 표시됩니다. 그림 5 층은 HSP90 억제제 및 클라 드리 빈 (녹색 선)의 결합 치료는 3D가 제안, HSP90 억제제 (퍼플 라인) 또는 클라 드리 빈 (오렌지 라인)의 단일 치료보다 상체의 성장을 억제하는 것을 보여줍니다 결합 된 HSP90 억제제의 치료와 클라 드리 빈은 항 종양 EF가있을 수 있습니다생체 내에서 fects. 그림 5G는 HSP90 억제제와 아드리아 마이신 (녹색 선)의 결합 치료가 3D의 성장이 제안, 아드리아 마이신 (오렌지 라인) 또는 HSP90 억제제 (퍼플 라인)의 단일 치료보다 상체 억제하지 않음을 보여줍니다 HSP90 억제제와 아드리아 마이신의 결합 치료는 생체 내에서 항 종양 효과가 없을 수 있습니다. 이 실험은 우리가 더 나은 생체 내에서 자신의 항 종양 효과를 테스트하는 화합물을 선택하고 SpheroidSizer가 빠른 실험 데이터 분석의 핵심입니다 도왔다.

표 1
표 1. 동작 시간의 비교 및 수동 측정 SpheroidSizer 288 이미지의 집합을 분석 할 때. 간의 화상 해석에 해주세요 C이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아.

그림 1
그림 1 SpheroidSizer -... 반복의 다른 단계에서 활성 윤곽 알고리즘의 회전 타원체의 크기를 측정하기위한 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램) 응용 프로그램의 핵심 워크 플로우 B) 그림. 초기화 윤곽 (반복 0) 의도적으로 알고리즘. C) 메이저와 마이너 축 길이 측정 및 SpheroidSizer이 볼륨의 계산을 소개하기 위해 확대 된 것을 양해 해 주시기 바랍니다. L - 장축 (길이 함) 형상의 가장 먼 점의 단일 쌍을 연결하는 선분; W - 보조 축 (폭이라 함)의 장축에 수직 인 가장 긴 선.

클래스 = "jove_content"FO : 유지 - together.within 페이지를 = "항상"> 그림 2
괴사 코어와 상체의 산만 한 파편과 다른 밝기와 콘트라스트 그림 2. 다양한 이미지의 조건에 대한 견고성을 보여주는 SpheroidSizer의 자동 분할, 대표 결과.) 전형적인 좋은 품질의 이미지. B) 이미지. C) 이미지. D) 이미지 . 각 그림의 상단 패널의 이미지는 소스 / 원본 이미지입니다; 각 그림의 하단 패널에서 이미지 품질 관리 이미지입니다; 그리고 붉은 윤곽이 자동 계산에 의해 도출 된 회전 타원체의 분할이다.

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도구를 제공합니다.) "수동 초기화"도구를 초기화 구형에 걸쳐 피팅 타원 모양의 드로잉을 할 수 있습니다 "를 손 그리기" "수동 초기화"와 그림 3. 그림, 부정확 한 구형 분할이 자동으로 초기화 한 후 발생합니다. B ) "손 그리기"도구는 구형 경계의 정확한 손 그리기, 부정확 한 구형의 세분화가 모두 자동 및 수동 초기화가 발생할 수 있습니다. 구형 주위의 파란 선은 초기화 윤곽을 보여줍니다; 적색 윤곽 식별 타원체 경계이다. 의 "수동 초기화")와 B에서 "손 그리기"에있는 회전 타원체)의 회전 타원체가 의도적으로 더 나은 도구를 소개하기 위해 확대된다는 점에 유의하시기 바랍니다.

그림 4 도 4. 24 이미지의 동일한 세트를 분석 SpheroidSizer 수동 측정 사이 이미지 분석 성능의 비교. A) 대표 상체는 상체의 길이와 너비는 수동 측정과 SpheroidSizer에 의해 결정하는 방법을 표시합니다. 최고 24 이미지는 수동 측정을 사용하여 레드 라인의 각 회전 타원체의 손으로 그린​​ 길이 / 너비를 포함; 낮은 24 이미지 (같은 24 이미지) SpheroidSizer. B) 각각의 회전 타원체에 세 개의 측정에서 길이 또는 폭의 표준 편차를 사용하여 붉은 개요에서 컴퓨터 그린 회전 타원체의 경계가 포함되어 있습니다.

그림 5
그림 5. 회전 타원체의 활용의 대표적인 예약물 검사에 사이 저 -..)이 프로젝트 고급의 B) 스크린 샷의 폴더 배치 및 파일 이름의 스크린 샷 BON-1 3D 종양 구형 체를 사용하여 약물 검사에서 수집 된 회전 타원체 '이미지에 대한 이미지 분석 SpheroidSizer. C)의 구성 창이 표시 결과 표. D와 SpheroidSizer1.0 창의 스크린 샷) SpheroidSizer. E)에서 내 보낸 형식 출력 파일의 스크린 샷 화면 SpheroidSizer. F에서 내 보낸 목록 출력 파일의 총) HSP90 억제제 및 클라 드리 빈 HSP90 억제제와 아드리아 마이신과 치료에 따라 3D 종양 상체의. G) 성장과 치료에 따라 3D 종양 구형 체의 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>

Discussion

SpheroidSizer 3D 종양 상체의 크기의 정확한 측정을위한 -이 연구는 빠르고, 유연하고, 효율적이고 자동화 된 프로그램을 제공합니다. SpheroidSizer는 사용하기 쉽고, 최소한의 사용자 입력이 필요합니다. SpheroidSizer 정확하고 원활하고 성공적으로 실행하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 상체는 우물의 가장자리에 닿지 않고 필드의 중앙에 이미지가 있는지; 하나의 프로젝트로서 함께 분석 될 모든 파일은 동일한 목적을 가진 동일한 현미경 묘화한다; 분석 할 수있는 모든 파일 이름을 정확하게 지정 및 프로토콜에 표시된대로 배열되어있다; 및 올바른 사용자 정의 설정이 계산되기 전에 입력됩니다.

SpheroidSizer의 장점은 이미지의 배경 점진적인 변화를 용납 할뿐만 아니라 활성 컨투어 알고리즘을 이용한 상체의 일반적인 구형 형상에 대응 매끄러운 윤곽을 생성하는 능력을 포함한다. 활동의 성과가난한 초기화하거나 원하는 형상에서 산만 다른 지역 가장자리의 존재 : 윤곽은 두 가지 상황에서 손상 될 수 있습니다. 큰 회전 타원체의 괴사 코어가보고되는 작은 윤곽의 결과로 활성 윤곽을 유치 할 때 특히 우리의 시험의 경우, 두 번째 상황은 때때로 일어난다. 이 임계 값이 특별히 손으로 설정되어 있지 않으면 다른 자동화 된 임계 값 기반의 방법은 또한이 상황에서 고통받는 것을 주목할 필요가있다. 이 소프트웨어는 따라서 앞으로 사용자가 감지하는 데 도움이 쉽고 품질 관리 기능을 제공하여 손상된 세그먼트를 해결하기 위해 노력을 넣습니다. 분할 오류가별로 초기화에서 발생하는 경우, 용도는 자동 초기화를 재정의하는 "수동 초기화"도구를 사용할 수 있습니다. 이미지 품질이 활성화 윤곽이 너무 약할 때, 사용자는 쉽게 정량화에 공급 윤곽을 "손 그리기"할 수 있습니다. 같은 CellProfiler 같은 기존의 소프트웨어는 반자동 FASHIO에서이 응용 프로그램에 대해 적용 할 수 있습니다N. 이미지의 일부가 제대로 측정 할 수있는 더 많은 사람의 개입을 필요로 할 때 다른 촬영 조건 이미지의 많은 양이 제시 될 때 또는 워크 플로는 번거로울 수 있습니다. SpheroidSizer는 계산과 높은 처리량 이미지 분석 워크 플로우를 관리 할 수​​있는 품질 관리를위한 올인원 제품군을 제공합니다.

SpheroidSizer 현재 이미지 당 하나의 타원체를 검출하는 것에 한정 만 회전 타원체의 축 방향 길이가 측정된다. 프로그램은 하나의 이미지에 체류 상체를 검출 또는 회전 타원체의 형상을 모니터링 괴사 코어 상체에 이러한 정량화 연구자에 의해 필요한 추가적인 정량화를 지원하도록 확장 될 수있다. 또한, 프로그램은 생체 전임상 또는 임상 연구에서 실시하면 확실 연구자 위해 유리할 것이다 동물이나 인간에서 절제된 종양의 크기를 검출하고 측정하기 위해 수정 될 수있다. 검출 된 회전 타원체의 사후 처리는 목표를 조사 할 수있다품질 관리에 필요한 인간의 노력을 감소시키고 더욱 스루풋을 향상 주입. SpheroidSizer는 모든 종류의 세포에서 생산되며, 따라서 다양한 암 연구 커뮤니티에서 사용할 수있는 3D 종양 상체에 대한 일반화 된 이미지 분석 응용 프로그램입니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 우리의 연구에 대한 그들의 지원을 위해 레이몬드와 비벌리 클러 재단에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

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References

  1. Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
  2. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
  3. Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
  4. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  5. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
  6. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
  7. Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
  8. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
  9. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
  10. Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  12. Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  13. Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
  14. Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
  15. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).

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