De alto rendimiento de imagen Análisis de esferoides tumorales: una aplicación de software fácil de usar para medir el tamaño de esferoides forma automática y precisa

Biology
 

Summary

Se presenta una aplicación de alto rendimiento de software de análisis de imagen para medir el tamaño de esferoides de tumor en tres dimensiones fotografiadas con el microscopio de campo brillante. Esta aplicación proporciona una manera rápida y eficaz para examinar los efectos de las drogas terapéuticas en esferoides, lo cual es beneficioso para los investigadores que deseen hacer uso de esferoides en las pantallas de drogas.

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Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

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Abstract

El creciente número de aplicaciones de tres dimensiones (3D) esferoides tumorales como un modelo in vitro para el descubrimiento de fármacos requiere su adaptación a formatos de proyección a gran escala en cada paso de una prueba de drogas, incluido el análisis de imágenes a gran escala. Actualmente no hay ningún software listo para el uso y la libre de análisis de imagen para cumplir con este formato a gran escala. La mayoría de los métodos existentes implican dibujo manualmente la longitud y la anchura de los esferoides 3D fotografiados, lo cual es un proceso tedioso y consume mucho tiempo. Este estudio presenta una aplicación de software de análisis de imágenes de alto rendimiento - SpheroidSizer, que mide la longitud mayor y menor axial de los fotografiados esferoides tumorales 3D forma automática y precisa; calcula el volumen de cada esferoide tumoral 3D individuo; a continuación, genera los resultados en dos formas diferentes en las hojas de cálculo para manipulaciones fáciles en el análisis de datos posterior. La principal ventaja de este software es su aplicación de análisis de imagen de gran alcance que esadaptado para un gran número de imágenes. Proporciona la computación de alto rendimiento y de flujo de trabajo de control de calidad. El tiempo estimado para procesar 1.000 imágenes es de aproximadamente 15 minutos en un ordenador portátil de configuración mínima, o alrededor de 1 min en una estación de trabajo de rendimiento multi-core. La interfaz gráfica de usuario (GUI) también está diseñado para un fácil control de calidad, y los usuarios pueden cambiar manualmente los resultados de la computadora. El método fundamental utilizado en este programa es una adaptación del algoritmo de contorno activo, conocido también como serpientes, lo que es especialmente adecuado para las imágenes con iluminación desigual y ambiente ruidoso que a menudo azota el procesamiento automatizado de imágenes en pantallas de alto rendimiento. El "Initialize Manual" de cortesía y herramientas "drenaje de la mano" proporcionan la flexibilidad necesaria para SpheroidSizer en el trato con los distintos tipos de esferoides e imágenes de calidad diversa. Este alto rendimiento de software de análisis de imagen, se reduce notablemente el trabajo y acelera el proceso de análisis. La implementación de este software es beneficial de esferoides tumorales 3D para convertirse en una rutina modelo in vitro para el análisis de drogas en la industria y el mundo académico.

Introduction

Tridimensional (3D) esferoides tumorales son "agregados de simetría esférica de células tumorales análogos a los tejidos, sin sustrato artificial para la fijación celular" 1-3. La citología y la morfología del tumor esferoides imita mejor la organización del tejido in vivo de tumores en microambientes y que las células de dos dimensiones (2D) monocapa. Esferoides tumorales 3D se han convertido en un modelo práctico in vitro para la detección de alto rendimiento de los fármacos terapéuticos contra el cáncer o el examen de la eficacia de los fármacos candidatos antes de los animales in vivo o la prueba clínica 4. Clínicamente, la eficacia de cualquier tratamiento de drogas anti-cáncer se evalúa con base en el crecimiento tumoral reducida. Análogamente, el volumen esferoide se puede utilizar como una medida de la eficacia para los estudios de medicamento contra el cáncer in vitro. Volumen esferoide (V = 0,5 * Longitud * Ancho 2) se determina en base a la longitud axial mayor y menor (más comúnmente conocida como la longitud y anchura)de los esferoides 6, 7. La mayoría de los investigadores tienen que dibujar manualmente la longitud y la anchura de cada esferoide, a menudo utilizando el software ofrecido por empresas de microscopía y se vende junto con los instrumentos de formación de imágenes. Esta técnica se convierte en un problema cuando los exámenes de detección de alto rendimiento se llevan a cabo y se producen más de cientos de imágenes. Algunos estudios recientes informaron el uso de cajas de herramientas de imagen de origen del software de análisis abiertos como CellProfiler 8-10 y ImageJ 11 para desarrollar rudimentarias rutinas de segmentación / macros que implicaron corrección de la iluminación y el umbral simple. Estas rutinas a menudo necesitan ser reajustados para diferentes lotes de imágenes de acuerdo a la condición de la iluminación y el cambio de contraste de la imagen; Por lo tanto, estos paquetes de software no pueden cumplir con el requisito de la robustez del análisis de imágenes de alto rendimiento. Friedrich y colaboradores (2009) utilizaron el software propietario para medir el volumen semi-autom del esferoideticamente 5. El método descrito en el Monazzam y papel de sus colegas 10 era un método semi-automatizado para medir el tamaño del esferoide sólo para un pequeño número de imágenes. Por lo tanto, existe una clara necesidad de herramientas robustas, flexibles y automatizadas de análisis de imágenes listas para usar para los esferoides tumorales 3D.

En este estudio, se describe SpheroidSizer - una aplicación de software de código abierto basados ​​en MATLAB y para medir el tamaño de esferoides tumorales de forma automática y precisa. SpheroidSizer está diseñado para procesar muchos lotes diferentes de imágenes de esferoides en 3D en la misma sesión. Utilizando el algoritmo de contorno activo 12-14, SpheroidSizer puede tolerar cambios contraste de la imagen, robusto ignorar el cambio gradual en la iluminación de fondo y reconocer esferoides en la imagen. También puede tolerar muchos artefactos habituales, por ejemplo, los desechos, se originó a partir de la muestra. El flujo de trabajo está diseñado para que los usuarios puedan realizar contro de calidadl durante o después de la computación. Sobrescritura Manual del resultado del análisis se puede realizar fácilmente en el acto. Tomando ventaja de la caja de herramientas de la computación paralela, la velocidad de análisis se puede incrementar aún más la coordinación de múltiples núcleos de computación para trabajar en el cálculo al mismo tiempo en la computadora de un usuario. Por otra parte, SpheroidSizer emite los resultados en dos formas diferentes para permitir una fácil interfaz con herramientas de análisis de aguas abajo.

Protocol

1. Formación de esferoides tumorales 3D, tratamientos farmacológicos y la colección de imágenes se realizaron como se describe en nuestro artículo anterior 15.

2. Instalación de software

  1. Instalar el software MATLAB con licencia en el equipo utilizado para el análisis de imágenes. También se requieren los siguientes cajas de herramientas de MATLAB para ser instalado - caja de herramientas de procesamiento de señales, la caja de herramientas de procesamiento de imágenes, y Parallel Computing Toolbox * (* necesario para el modo de cálculo paralelo solamente).
    NOTA: Muchas universidades compran y mantienen licencias de grupo para que el software es libre para ser descargado y utilizado por los científicos afiliados.
  2. Instale el programa SpheroidSizer de archivo SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Guarde el archivo zip en su sistema de archivos local.
    2. Descomprimir el archivo SpheroidSizer.
    3. Guarde los archivos en un directorio / carpeta designada, que se hará referencia posteriormente como tél "Directorio de instalación".
      NOTA: SpheroidSizer ha sido ampliamente probado en un sistema operativo Windows 7. Se espera para funcionar en sistemas operativos alternativos con ajustes mínimos (no probados).

3. Preparación para el Análisis de Imágenes por SpheroidSizer

  1. Determine la resolución / escala de la imagen del sistema de imagen (escala absoluta de la imagen en micras por píxel (m / pix)).
    NOTA: Si se conoce el tamaño de cada píxel en el chip de la cámara, la escala de la imagen se puede calcular como el tamaño del aumento del objetivo x pixel (m / pix). Este valor se puede obtener desde el software de formación de imágenes equipado con el microscopio como metadatos incrustados o con la ayuda del proveedor del sistema de formación de imágenes. Este valor se requiere en el paso 4.6.
  2. Convertir cualquier formato de archivo de imagen de propiedad de los formatos de archivo aceptados - TIFF, JPEG y otros formatos de archivos de imagen comunes.
  3. Nombre de archivos de imagen y organizar directories (Figura 5A).
    NOTA: El software se basa en la disposición adecuada de la estructura de directorios y nombres de archivo para volver a formatear los resultados en formato de placa:
    1. Nombre de los archivos de imagen en el siguiente formato: [placa] _ [fila] [columna] [extensión] o [placa] [espacio] [fila] [columna] [extensión]... [Fila] sigue el orden alfabético y [columna] sigue el orden numérico.
      NOTA: Disponible de forma gratuita el software de cambio de nombre por lotes automática se puede encontrar para ayudar a los usuarios en este paso.
    2. Organizar el directorio / carpeta basada en el experimento de la siguiente manera: Cada experimento debe tener un directorio. En el directorio de cada experimento, debe haber subdirectorios para cada punto de tiempo. Bajo cada punto subdirectorio tiempo, debe haber todas las imágenes de todas las placas.
      NOTA: Para que los resultados del análisis para ser ordenados de manera óptima en los resultados con formato, le sugerimos que manteniendo el mismo número de dígitos para cada identificador rellenando 0 de de la left, por ejemplo, los puntos temporales se denominan de la 000H, 072H, 144H y.

4. Análisis de imágenes de los esferoides por SpheroidSizer

  1. Abrir MATLAB, a continuación, abra la ventana "Command Window", escriba cd '[directorio de instalación]' y pulse [RETURN].
  2. Escriba "SpheroidSizer1_0" en la "Ventana de comandos" y pulse [RETURN] para iniciar el programa SpheroidSizer.
  3. Haga clic en el botón "Examinar" en la ventana SpheroidSizer1.0 para seleccionar el directorio de experimento que contiene todas las imágenes.
  4. Seleccione "Incluir subcarpetas" palanca debajo del campo de texto "Carpeta" para procesar múltiples carpetas de imágenes anidadas bajo el directorio designado.
    NOTA: Si la opción "Incluir subcarpetas" alternancia no está seleccionada, sólo las imágenes directamente bajo el directorio se procesan, y todas las subcarpetas se ignoran.
  5. Seleccione la opción "Presentación en la marcha" para dispponer cada imagen segmentada en la parte superior de su imagen de origen para el control de calidad que se está ejecutando el cálculo.
    NOTA: La velocidad de Cálculo es más rápido si no se elige la opción "On-the-fly pantalla".
  6. Especifique "Resolución" (escala de la imagen / resolución de micras / pix) de las imágenes analizadas en la caja, para que el programa convierte correctamente las medidas del esferoide de píxeles para micras.
    NOTA: Todas las imágenes en la misma carpeta o analizados en conjunto se deben tomar bajo el mismo microscopio con el mismo objetivo de forma que la escala de la imagen / resolución se mantiene constante para cada experimento.
  7. (Opcional) los usuarios pueden seguir el paso 5 para Ajustes definidos por el usuario avanzado.
  8. Haga clic en "Calcular" para iniciar el cálculo.
    NOTA: El software lleva a cabo una comprobación automática de nombre de archivo antes de proceder al cálculo. Si aparece un cuadro de diálogo aparece que indica - "existe Error en nombre de archivo", haga clic en "Salir y lista de errores de mostrar"y corregir los errores en los nombres de archivo de la lista (Vea el Paso 3.3). A continuación, haga clic en "Calcular" para iniciar el cálculo de nuevo.
  9. Haga clic en el botón "Pausa" para hacer una pausa en el cálculo; y el cálculo se puede reanudar pulsando el mismo botón que muestra en "Continuar".
    NOTA: La "Tabla de Resultados" muestra la "carpeta", "archivo", "Volumen" (en mm 3), "Longitud" (en micras), (casilla de verificación) "Válido" "Ancho" (en micras), y para todos los esferoides analizados (Figura 5C). El volumen se calcula en función de la medida en el eje principal (longitud) y eje menor (ancho) (V = 0,5 * Longitud * Ancho 2). La casilla de verificación "Válido" es una opción para que el usuario elija si el análisis de la imagen es válida o no válida después del control de calidad, consulte el Paso 6.

5. Ajustes definidos por el usuario avanzadas

  1. Haga clic en el botón "Advanced" en el spheroidSizer1.0 ventana para abrir la ventana de Configuraciones Avanzadas con el fin de ajustar los parámetros definidos por el usuario (Figura 5B).
  2. Introduzca los nombres de archivo de interés en el "Formato de salida" y cajas "Lista de salida" en la ventana de Configuraciones Avanzadas en "Entrada".
  3. Introduzca un número de "2-10" en el cuadro "Reducir". Este es un coeficiente para el software para reducir el tamaño de la imagen en el cálculo con el fin de mejorar la velocidad de cálculo. Cuanto mayor sea el número, más rápida será la velocidad de cálculo. El valor por defecto "Reducir" está ajustado a 10.
  4. Escriba la extensión del archivo de la imagen a ser procesada en la casilla "Incluir tipo".
  5. Escriba las extensiones de archivo de imagen o finales que no van a ser procesados ​​por el programa en el cuadro "Excluir tipo" de la siguiente manera: "_crude.jpg".
  6. Seleccione la opción "Ninguno" para "Color Especial" para procesar 8 bits y 16 bits colo imágenes correctamente; elegir "12 bits" para "Color Especial" para procesar imágenes en color de 12 bits correctamente
  7. Marque "Usar Parallel Computing" si el equipo utilizado para el análisis de imágenes está equipado con varias CPU y / o CPUs multi-core. Si esto es cierto, entonces vaya al paso 5.7.1; si no, omitir los pasos 5.7.1 y 5.7.2.
    NOTA: Se producirá un error si el equipo se está utilizando no es compatible con la configuración elegida.
    1. Marque la opción "Usar Parallel Computing" en la ventana de Configuraciones Avanzadas.
      NOTA: Use sólo el modo de cómputo paralelo cuando 4 o más núcleos están disponibles para el equipo.
    2. Introduzca un número de 4 a 12 en los "# Trabajadores" (informática núcleos) caja.
      NOTA: Este número tiene que ser igual o menor que el número de núcleos de computación en el ordenador del usuario. Se impone un máximo de 12 por el MATLAB Parallel Computing Toolbox soporta un máximo de 12 núcleos. Cuando la computación paralela se estéing ejecutado, una pequeña muestra el cuadro de diálogo que pide al usuario que esperar a la computación paralela para terminar; el cálculo no se puede detener, y tampoco lo es la función de "on-the-fly pantalla" que se está ejecutando en el modo de cómputo paralelo.

6. Control de Calidad

  1. Haga clic en la celda correspondiente en la "Tabla de resultados" para confirmar el contorno de límite preciso de un esferoide en las imágenes analizadas,
    NOTA: Las imágenes originales y el control de calidad se mostrará en el lado derecho para su revisión. El usuario puede examinar todas las imágenes de forma secuencial utilizando la flecha hacia abajo en el teclado.
  2. Refinar el límite de la esferoide en la imagen seleccionada usando las dos herramientas siguientes, si es necesario:
    1. Haga clic en el botón "Inicializar Manual" para mostrar la imagen original. Luego, haga clic y mantener pulsado el botón derecho del ratón fuera del esferoide y arrastre la herramienta elipse para cubrir el esferoide en la imagen original.
      NOTA: La unaalgoritmo ctive contorno inicia utilizando el contorno enviado por el usuario y ejecuta a converger en el contorno esferoide deseado. La "Tabla de Resultados" se actualiza automáticamente con los nuevos resultados. La herramienta "Initialize Manual" permite al usuario proporcionar manualmente inicialización para contorno activo.
    2. Haga clic en el botón "Hand Draw" para mostrar la imagen original. A continuación, utilice el ratón o una pantalla táctil habilitada para dibujar con precisión los límites del esferoide.
      NOTA: Este esquema se mide directamente para generar ejes mayor y menor, que se actualizan en la "Tabla de Resultados". La herramienta "Mano Draw" sólo se utiliza cuando la función "Manual Initialize" no converge en el límite deseado del esferoide.
  3. Desmarque la casilla de verificación en la columna "Válido" en la fila correspondiente de la "Tabla de Resultados", cuando una imagen no contiene ningún esferoide válida después de una inspección. Un "; Etiqueta no válida "aparece en la esquina superior izquierda de la imagen de control de calidad. Si "Válido" es seleccionada, los valores de todas las mediciones están vacías para el esferoide en los archivos de resultados con formato de salida y exportados.
    NOTA: los siguientes métodos abreviados de teclado están disponibles para su uso en la "tabla de resultados": "flecha hacia abajo" para la siguiente imagen; "V" de válido / no válido; "M" para la función "Inicializar Manual" y "h" para la herramienta "Draw Hand".

7. Guardar y exportar datos

  1. Haga clic en el botón "Estudio de exportación" en la ventana SpheroidSizer1.0 exportar el estado intermedio del análisis, si el usuario necesita para salir del software antes de terminar el proyecto. Especifique el nombre y el directorio del archivo que desea guardar.
  2. Haga clic en el botón "Importar Estudio" para traer de vuelta el resultado del estado intermedio anterior del "Estudio Exportar" y seguir work en él.
    NOTA: Los archivos de estado intermedios están en un formato nativo de MATLAB (mat.) Y no son directamente legible por todos los demás programas de software. Una característica de seguridad integrada en el software hace que las exportaciones automáticas del proyecto abierto en caso de que el programa sale sin querer. Cuando es necesario, el usuario puede encontrar este archivo, cuyo nombre comienza con "~ tmp" que contiene la marca de tiempo correspondiente en el [directorio de instalación].
  3. Haga clic en "Formato de resultados" en la ventana SpheroidSizer1.0 para guardar los resultados.
    NOTA: Dos formas de los resultados se guardan en el directorio del experimento. Los nombres de los archivos exportados se pueden configurar en la ventana de Configuraciones Avanzadas (ver Protocolo Paso 5.2). El archivo de salida es un formato de tabla tabuladores delineado que organiza el valor del volumen en el formato placa original en el orden de un número de matrícula ascendente para cada momento; y todos los puntos de tiempo se organizan en un orden ascendente (Figura 5D). La lista oarchivo utput es una tabla de tabulación delimitado que contiene todas las mediciones en forma de listas ordenadas (Figura 5E).

Representative Results

SpheroidSizer está diseñado para producir detección automatizada, delineación y medición de los esferoides 3D, con notablemente reducido de trabajo y el aumento de forma aguda eficiencia para grandes cantidades de imágenes. Figura 1A muestra el flujo de trabajo de SpheroidSizer. Los pasos de computación principales incluyen la inicialización automatizado, algoritmo de contorno activo y el contorno de la cuantificación. Después de cómputo automatizado, la función de control de calidad utiliza una combinación de "Initialize Manual" y "herramientas de drenaje de la mano" para salvar cualquier segmentación imperfecta. Figura 1B ilustra con detalle el sistema contorno activo automatizado. El paso de inicialización (iteración 0) utiliza pasos básicos de procesamiento de imágenes para generar tamaño aproximado y la ubicación del esferoide y generar un contorno de iniciación esférica con un tamaño estimado. El contorno de iniciación se introduce en el algoritmo de contorno activo. A su vez itera para ajustar de acuerdo a la imagen localpendiente y curvatura forma. El algoritmo de contorno activo termina cuando el contorno se estabilice (converge), es decir, 477 iteraciones para esta imagen, o cuando se ejecuta el número máximo predefinido de iteraciones. En este ejemplo, el contorno de inicialización se amplía a propósito de mostrar mejor el algoritmo. En realidad, la inicialización es por lo general muy cerca del límite real y se necesitan muchos menos iteraciones para el algoritmo a converger. Posteriormente, el algoritmo toma mediciones morfométricas de la frontera esferoide detectado. Los ejes mayor y menor de la esferoide se miden usando MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imágenes (Figura 1C). El eje mayor se define como el segmento de línea que conecta un solo par de los puntos más lejanos en el contorno, que se refiere a la longitud (L). El eje menor se define como la línea más larga perpendicular al eje principal, que se refiere a la anchura (W). En este caso, los valores de L y W son muy cerca ya que elesferoide es esférica. El volumen del esferoide se calcula como V = 0,5 * L * W 2.

Una de las características de SpheroidSizer es su detección automatizada de la frontera de los esferoides incluso en imágenes con el fondo desigual o ruidoso utilizando el algoritmo de contorno activo (Figuras 2B-D). Procesamiento computacional de imágenes de campo claro es a menudo plagada de fondo desigual, lo que induce a error a los métodos basados ​​en umbralización adaptativa para producir resultados no deseados de umbrales. El problema es especialmente evidente cuando se utilizan placas de múltiples pocillos y paredes de los pozos pueden crear efectos de sombra en las imágenes. Sin embargo, debido a que el algoritmo de contorno activo no es sensible a los cambios de sombreado gradual en el fondo, es capaz de identificar la segmentación del esferoide en estas imágenes de campo claro con inicialización adecuada. Figura 2 muestra algunos ejemplos de imágenes con el fondo irregular o ruidoso, como desigual iluminación (Figura 2B (Figura 2C) o núcleo necrótico (Figura 2D). Con algoritmo de contorno activo automatizado, SpheroidSizer delinea estos esferoides con precisión en todas estas imágenes como se muestra en el contorno rojo en el panel inferior de cada figura.

La función de control de calidad de SpheroidSizer es clave para un flujo de trabajo de alto rendimiento. El "Initialize Manual" y herramientas "Dibujar a mano" son las herramientas gratuitos valiosos para esta aplicación. Entre cientos o miles de imágenes, es inevitable que el algoritmo automático no es capaz de detectar correctamente los esferoides en algunas imágenes. Como se ilustra en la Figura 3A, cuando la detección incorrecta del esferoide es causada debido a la etapa de inicialización, es decir, el tamaño o la ubicación del contorno de la iniciación en la imagen (panel superior) el manejo inadecuado, la herramienta "Manual Initialize" funciona al permitir que el usuario correctamente definir la ubicación y el tamaño de la spherOID manualmente (panel inferior). Se dispara el algoritmo de contorno activo para iniciar con contorno definido manualmente y ejecutar a converger en el contorno deseado. Por estas imágenes difíciles como la imagen original en la Figura 3B, el esferoide se encuentra en un fondo de distracción y ruidoso. SpheroidSizer no es capaz de identificar correctamente el esferoide por el método automatizado (panel superior) o mediante la función "Manual Initialize" con una inicialización adecuada (panel central). En este caso, la herramienta "Draw Hand" se puede utilizar para dibujar manualmente el contorno del esferoide tal como se muestra en el panel inferior. El programa utiliza el límite definido por el usuario para medir los ejes mayor y menor de la esferoide y calcular el volumen. Todos los resultados corregidos se incorporan inmediatamente en la "Tabla de Resultados" y pueden ser exportados en consecuencia.

Para determinar el rendimiento de SpheroidSizer en grandes conjuntos de datos, primero comparamos el tiempo de operación poranalizar el mismo conjunto de 288 imágenes mediante 1) la medición manual con el proveedor microscopio software suministrado; 2) SpheroidSizer con una computadora portátil regular de un solo núcleo; y 3) SpheroidSizer con una estación de trabajo de rendimiento de cómputo paralelo multi-core. Las mediciones manuales siguen nuestro protocolo típico antes de desarrollar el software: la longitud y la anchura de cada esferoide se dibujan a mano y se midieron utilizando el programa de proveedor (como se ve de las líneas rojas en el panel superior de la Figura 4A); a continuación, el usuario copia hacia abajo los valores de las mediciones. SpheroidSizer procesa cada imagen mediante la generación de la frontera esferoide (como se muestra el contorno rojo en el panel inferior de la Figura 4A), la medición de la longitud axial mayor y menor, y la exportación de los resultados en hojas de cálculo. Como se ve en la Tabla 1, basado en el cálculo a partir de 288 imágenes, se necesita un promedio de 31,67 seg para medir un esferoide por imagen manualmente; mientras que sólo se necesita SpheroidSizer menos de 2 segundos y # 160; cuando se ejecuta en un ordenador portátil normal de un solo núcleo; y menos de 1 segundo cuando se ejecuta en una estación de trabajo de rendimiento de 12 núcleos. Por lo tanto, el análisis de la imagen es de más de 18x más rápido por imagen usando SpheroidSizer que las mediciones manuales. Reduce drásticamente la mano de obra cuando más de miles de imágenes son analizadas. A continuación, se compara la variabilidad en las mediciones de las 24 esferoides mostradas en la figura 4A entre las mediciones manuales y SpheroidSizer. Los 24 esferoides se miden tres veces por ambos métodos; y la desviación estándar de cada esferoide individuo se calcula. Como se ve en la figura 4B, la desviación estándar de SpheroidSizer (línea verde y los puntos) es cercano a cero, excepto para los tres esferoides que se corrigen en el paso de control de calidad, que todavía muestran la desviación estándar más pequeñas que las del método de medición manual. Todo esto indica que SpheroidSizer realiza el análisis de imagen más eficiente y precisa.

e_content "> Se realizó una prueba de drogas utilizando esferoides BON-1 3D de tumores humanos para averiguar qué compuestos en combinación con un inhibidor de hsp90 son los candidatos potenciales para probar los efectos antitumorales in vivo. esferoides tumorales BON-1 3D Humanos fueron cultivadas en placas de 96 pocillos recubiertos de agarosa como se describe en el documento anterior 15. Ocho compuestos diferentes con seis diluciones en serie además de medios de comunicación y vehículo fueron seleccionados por sus efectos individuales y combinatorias con 10 nM y 20 nM de inhibidor de la HSP90 en los duplicados, respectivamente. Dos esferoides fueron utilizado para cada concentración del compuesto individual o los compuestos combinados se utilizan. Cuatro placas de 96 pocillos con un total de 384 esferoides. Todos los esferoides fueron imágenes a 0, 72, 144, 168, y 192 h. Se produjeron un total de 1.920 imágenes a partir de este experimento. Se tomó SpheroidSizer sólo 30 minutos para completar el análisis computacional de las imágenes 1920 con un 50 min adicionales para el control de calidad y la exportación de datos. esferoidSizer acelera el proceso de análisis de imágenes enormemente. Figura 5A muestra una captura de pantalla de los arreglos de carpetas y nombres de archivo para este experimento como un ejemplo para el protocolo de la Etapa 3.3. Figuras 5B-E muestra las capturas de pantalla de los análisis de imágenes ventanas pop-up y resultados . utilizando SpheroidSizer como ilustraciones para el protocolo de los pasos 4, 5 y 7 Tomando los volúmenes de los esferoides 3D a partir de la tabla de resultados con formato exportado de SpheroidSizer, hicimos gráficas - crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre tratamientos compuestos en función del tiempo de los tratamientos. Dos gráficos representativos de este experimento se muestran en la Figura 5F y 5G. Figura 5F muestra que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y cladribina (línea verde) inhiben el crecimiento de esferoides 3D más que el tratamiento único de inhibidor de hsp90 (línea morada) o cladribina (línea naranja), lo que sugiere que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y cladribina puede tener ef antitumoraldefectos en vivo. Figura 5G muestra que los tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y adriamicina (línea verde) no inhibe el crecimiento de esferoides 3D más que el tratamiento único de adriamicina (línea naranja) o un inhibidor de hsp90 (línea morada), lo que sugiere que la tratamientos combinados de inhibidor de hsp90 y adriamicina pueden no tener efectos antitumorales in vivo. Este experimento nos ayudó a seleccionar mejor los compuestos para probar sus efectos antitumorales in vivo e SpheroidSizer es la clave para el análisis de datos experimentales rápida.

Tabla 1
Tabla 1 Comparación del tiempo de operación. Sobre análisis de imágenes entre las mediciones manuales y SpheroidSizer la hora de analizar el mismo conjunto de 288 imágenes. Por favor, clamer aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Figura 1
Figura 1 SpheroidSizer -... Una aplicación de software de código abierto para medir el tamaño del esferoide A) El flujo de trabajo básico de la aplicación B) Ilustración del algoritmo de contorno activo en diferentes etapas de iteración. Tenga en cuenta que el contorno de inicialización (iteración 0) se amplió a propósito con el fin de mostrar el algoritmo. C) Los mayores y menores medidas de longitud axial y el cálculo del volumen de SpheroidSizer. L - eje mayor: el segmento de línea que conecta un solo par de puntos más lejanos en el contorno (que se refiere a la longitud); W - eje menor: la línea más larga perpendicular al eje principal (que se refiere a la anchura).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2
Figura 2. Los resultados representativos de la segmentación automatizada de SpheroidSizer, mostrando robustez frente a las diversas condiciones de imagen. A) imágenes de buena calidad típica. B) Las imágenes con distinto nivel de brillo y contraste. C) Las imágenes con los restos de distracción. D) Imágenes de esferoides con núcleo necrótico . Imágenes en el panel superior de cada figura son la fuente / imágenes originales; imágenes en el panel inferior de cada figura son las imágenes de control de calidad; y la línea roja es la segmentación del esferoide dibujado por el cómputo automatizado.

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Figura 3. Ejemplo de la "Initialize Manual" y "Hand Draw" de herramientas. A) La función "Manual Initialize" permite que el dibujo de una forma de elipse de ajuste a través del esferoide para la inicialización, cuando la segmentación esferoide inexacta se produce después de la inicialización automática. B ) La herramienta "Mano Draw" permite gráfico de la mano precisa del límite del esferoide, cuando segmentaciones esferoide inexactas ocurren con inicialización tanto automatizado y manual. La línea azul alrededor del esferoide muestra el contorno de inicialización; la línea roja es el límite esferoide identificado. Tenga en cuenta que el esferoide en "Initialize Manual" en A) y el esferoide en "Draw Hand" en B) se amplía a propósito de mostrar mejor las herramientas.

Figura 4 Figura 4. Comparación del rendimiento de análisis de imagen entre SpheroidSizer y mediciones manuales en el análisis de la misma serie de 24 imágenes. A) esferoides representativos para mostrar cómo la longitud y la anchura de esferoides se determinan por mediciones manuales y SpheroidSizer. 24 Top imágenes contienen dibujado a mano longitud / anchura de cada esferoide en líneas rojas utilizando mediciones manuales; 24 imágenes más bajas (las mismas 24 imágenes) contienen límite esferoide ordenador dibujada en el esquema rojo usando SpheroidSizer. B) Desviación estándar de longitud o anchura a partir de tres mediciones en cada esferoide individual.

La figura 5
Figura 5. Un ejemplo representativo de la utilización de EsferoideSizer en detección de drogas - el análisis de imágenes en imágenes los esferoides 'que se recogieron a partir de un examen de drogas utilizando esferoides tumorales BON-1 3D A) Una captura de pantalla de los arreglos de carpetas y nombres de archivo para este proyecto B) Una captura de pantalla de la avanzada.. ventana de configuraciones en SpheroidSizer. C) Una captura de pantalla de la ventana que aparece con SpheroidSizer1.0 Resultados En la tabla. D) Una captura de pantalla del archivo de salida en formato exportado de SpheroidSizer. E) Una captura de pantalla del archivo de salida lista exportada desde SpheroidSizer. F) El crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre los tratamientos con inhibidores hsp90 y cladribina. G) ​​El crecimiento de esferoides tumorales 3D sobre los tratamientos con inhibidores hsp90 y adriamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ P>

Discussion

Este estudio presenta un programa rápido, flexible, eficaz y automatizado - SpheroidSizer para la determinación precisa del tamaño de esferoides tumorales 3D. SpheroidSizer es fácil de usar y no requiere intervención mínima del usuario. Los pasos más críticos para la exacta ejecución de SpheroidSizer, suave y exitosa incluyen: que los esferoides son imágenes en el centro del campo sin tocar el borde del pozo; todos los archivos que se deben analizar en conjunto como uno de los proyectos deben ser reflejados bajo el mismo microscopio con el mismo objetivo; todos los archivos que se analizarán se nombran y se disponen como se indica en el protocolo correctamente; y los ajustes definidos por el usuario estén correctamente incorporadas antes de la computación.

Las ventajas de SpheroidSizer incluyen su capacidad para tolerar el cambio gradual de fondo en la imagen, así como para generar contornos suave que corresponden a las formas esféricas generales de los esferoides que utilizan el algoritmo de contorno activo. Rendimiento de activacontorno puede verse comprometida en dos situaciones: mala inicialización, o la presencia de otras aristas locales que distraen del contorno deseado. Específicamente en nuestros casos analizados, la segunda situación a veces ocurre cuando el núcleo necrótico de una gran esferoide atrae el contorno activo que resulta en menor contorno que se informa. Vale la pena señalar que otros métodos basados ​​en el umbral automatizados también sufren en esta situación a menos que el umbral se fija específicamente a mano. Por tanto, el software presenta esfuerzo para ayudar a los usuarios a detectar y remediar la segmentación comprometida al proporcionar características de control de calidad fáciles. Si ocurre el error de segmentación de la mala inicialización, los usos pueden utilizar la herramienta "Manual Initialize" para anular la inicialización automática. Cuando la calidad de la imagen es demasiado pobre para contorno activo, los usuarios pueden fácilmente "Hand Draw" del contorno que se alimenta en la cuantificación. El software existente como CellProfiler puede ser adaptado para esta aplicación en un fashio semiautomáticon. El flujo de trabajo puede ser incómodo cuando se presentan grandes cantidades de imágenes con diferentes condiciones de formación de imágenes o cuando un subconjunto de imágenes más precisa de la intervención humana para medir correctamente. SpheroidSizer ofrece una suite todo-en-uno para el cálculo y control de calidad para la gestión de alto rendimiento de análisis de imágenes de flujo de trabajo.

SpheroidSizer está actualmente limitado a la detección de un esferoide por imagen y sólo mide la longitud axial del esferoide. El programa se puede ampliar para apoyar aún más la cuantificación necesaria por investigadores tales como la cuantificación de esferoides con núcleo necrótico, la detección de múltiples esferoides en una imagen o el control de la forma de los esferoides. Además, el programa puede ser modificado para detectar y medir el tamaño de los tumores extirpados de animal o humano, que sin duda será beneficioso para los investigadores cuando se realiza in vivo pre-clínico o de investigación clínica. Post-procesamiento de los esferoides detectados también se puede investigar objetivoción a reducir el esfuerzo humano necesario para el control de calidad y mejorar aún más el rendimiento. SpheroidSizer es una aplicación de análisis de imagen generalizada para esferoides tumorales 3D que se producen a partir de cualquier tipo de células, y por lo tanto pueden ser utilizados por una comunidad de investigación del cáncer de ancho.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a la Fundación Raymond y Beverly Sackler por su apoyo en nuestra investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

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References

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