High-throughput Immagine Analisi di sferoidi tumorali: Un software applicativo di facile utilizzo per misurare le dimensioni del Spheroids automaticamente e con precisione

Biology
 

Summary

Presentiamo un'applicazione high throughput software di analisi di immagine per misurare le dimensioni di sferoidi tumorali tridimensionali ripreso con microscopia in campo chiaro. Questa applicazione fornisce un modo veloce ed efficace per esaminare gli effetti dei farmaci terapeutici su sferoidi, che è vantaggioso per i ricercatori che desiderano utilizzare sferoidi nelle schermate di droga.

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Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

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Abstract

Il crescente numero di applicazioni tridimensionali (3D) sferoidi tumorali come un modello in vitro per la scoperta di nuovi farmaci richiede il loro adeguamento alle disposizioni di screening su larga scala in ogni passo di uno schermo di droga, tra cui su larga scala l'analisi delle immagini. Attualmente non ci sono software di analisi di immagine pronto per l'uso e di adempiere a questo formato gigante. La maggior parte dei metodi esistenti implicano disegnare manualmente la lunghezza e la larghezza delle sferoidi 3D esposta, che è un processo noioso e che richiede tempo. Questo studio presenta un high-throughput delle applicazioni software di analisi dell'immagine - SpheroidSizer, che misura la maggiore e minore lunghezza assiale delle imaged 3D sferoidi tumorali automaticamente e con precisione; calcola il volume di ogni singolo sferoide tumore 3D; poi uscite i risultati in due forme diverse in fogli di calcolo per semplici manipolazioni nella successiva analisi dei dati. Il vantaggio principale di questo software è la sua immagine potente applicazione di analisi che èadattato per un gran numero di immagini. Esso fornisce high-throughput di calcolo e workflow di controllo della qualità. Il tempo stimato per elaborare 1.000 immagini è di circa 15 minuti su un computer portatile configurazione minima, pari a circa 1 min su una workstation prestazioni multi-core. L'interfaccia utente grafica (GUI) è inoltre progettato per un facile controllo di qualità, e gli utenti possono sovrascrivere manualmente i risultati del computer. Il metodo principale utilizzato in questo software è tratto dal algoritmo profilo attivo, noto anche come serpenti, che è particolarmente adatto per le immagini con illuminazione uniforme e lo sfondo rumoroso che spesso affligge l'elaborazione automatica delle immagini in schermi ad alto rendimento. L'omaggio "Initialize manuale" e strumenti "disegnare a mano", offrono la flessibilità di SpheroidSizer nel trattare con i vari tipi di sferoidi e le diverse immagini di qualità. Questo software di analisi delle immagini ad alta velocità riduce notevolmente il lavoro e accelera il processo di analisi. L'implementazione di questo software è beneficial per sferoidi tumorali 3D per diventare una routine modello in vitro per schermi di droga nel mondo industriale e accademico.

Introduction

Tridimensionale (3D) sferoidi tumorali sono "aggregati simmetria sferica di cellule tumorali analoghi ai tessuti, senza substrato artificiale per l'adesione delle cellule" 1-3. La citologia e morfologia del tumore sferoidi imita meglio il vivo organizzazione tessuto tumorale e microambienti che monostrato bidimensionali (2D) cellule. Sferoidi tumorali 3D sono diventati un modello pratico in vitro per proiezioni alto-capacità di anti-cancro farmaci terapeutici o esaminare l'efficacia dei farmaci candidati prima in vivo animale o prova clinica 4. Clinicamente, l'efficacia di qualsiasi trattamento farmaco anti-cancro è valutata sulla base della crescita tumorale ridotta. Analogamente, il volume sferoide può essere usato come misura dell'efficacia per gli studi di droga cancro in vitro. Volume Spheroid (V = 0.5 * Lunghezza * Larghezza 2) è determinato sulla base del maggiore e minore lunghezza assiale (più comunemente noto come lunghezza e larghezza)degli sferoidi 6, 7. La maggior parte dei ricercatori devono disegnare manualmente la lunghezza e la larghezza su ogni sferoide, spesso utilizzando il software offerto da aziende di microscopia e venduto insieme agli strumenti di imaging. Questa tecnica diventa problematico quando droga schermi high-throughput vengono eseguite e più di centinaia di immagini sono prodotte. Alcuni recenti studi hanno riportato l'uso di immagine di origine toolbox software di analisi aperti come CellProfiler 8-10 e ImageJ 11 per sviluppare rudimentali routine di segmentazione / macro che ha coinvolto la correzione illuminazione e soglia semplice. Queste routine devono spesso essere ri-adattato per differenti lotti di immagini secondo le condizioni di illuminazione e il cambio contrasto dell'immagine; Pertanto, questi pacchetti software non possono soddisfare il requisito robustezza dell'analisi di immagini ad alta velocità. Friedrich e collaboratori (2009) hanno utilizzato software proprietario per misurare il volume semi-autom della sferoidematicamente 5. Il metodo descritto in Monazzam carta e dei suoi colleghi 10 era un metodo semi-automatico per misurare le dimensioni di sferoide solo per un piccolo numero di immagini. Pertanto, esiste una chiara necessità di strumenti robusti, flessibili, automatizzati e analisi delle immagini pronte all'uso per le sferoidi tumorali 3D.

In questo studio, descriviamo SpheroidSizer - un software open-source MATLAB-based e per misurare le dimensioni di sferoidi tumorali automaticamente e con precisione. SpheroidSizer è progettato per elaborare molti lotti diversi di immagini di sferoidi 3D nella stessa sessione. Utilizzando l'algoritmo profilo attivo 12-14, SpheroidSizer può tollerare il cambiamento contrasto dell'immagine, robusto ignorare il cambiamento graduale retroilluminazione e riconoscere sferoidi nell'immagine. Può anche tollerare molti manufatti usuali, ad esempio, detriti, originato dal campione. Il flusso di lavoro è progettato in modo che gli utenti possono eseguire Contro qualitàl durante o dopo il calcolo. Sovrascrittura manuale del risultato dell'analisi può essere facilmente eseguita sul posto. Approfittando della casella degli strumenti calcolo parallelo, la velocità di analisi può essere ulteriormente potenziato coordinando più core di elaborazione per lavorare sul calcolo contemporaneamente sul computer di un utente. Inoltre, SpheroidSizer visualizza i risultati in due forme diverse per consentire un facile interfacciamento con strumenti di analisi a valle.

Protocol

3D formazione di sferoidi tumorali, trattamenti 1. Farmacologici e raccolta di immagini vengono eseguite come descritto nel nostro precedente documento 15.

2. Installazione del software

  1. Installare il software concesso in licenza MATLAB sul computer utilizzato per l'analisi delle immagini. I seguenti toolbox di MATLAB sono inoltre tenuti a essere installati - Signal Processing Toolbox, Image Processing Toolbox, e Parallel Computing Toolbox * (* necessaria per la modalità di calcolo parallelo solo).
    NOTA: l'acquisto di molte università e mantenere le licenze di gruppo in modo che il software è libero di essere scaricato e utilizzato dagli scienziati affiliati.
  2. Installare il programma SpheroidSizer da file SpheroidSizer.zip (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Salvare il file zip nel file system locale.
    2. Decomprimere il file SpheroidSizer.
    3. Salvare i file in un designato directory / cartella, che sarà successivamente indicato come tegli "Directory di installazione".
      NOTA: SpheroidSizer è stato ampiamente testato su un sistema operativo Windows 7. Si prevede di lavorare su sistemi operativi alternativi con aggiustamenti minimi (non testato).

3. Preparazione per l'Analisi Immagine di SpheroidSizer

  1. Determinare la risoluzione / scala dell'immagine del sistema di imaging (scala assoluta dell'immagine in micron per pixel (micron / pix)).
    NOTA: Se la dimensione di ogni pixel sul chip della fotocamera è noto, la scala dell'immagine può essere calcolato come grandezza di ingrandimento obiettivo x pixel (micron / pix). Questo valore può essere ottenuto dal software di imaging equipaggiato con il microscopio come metadati incorporati o con l'aiuto del fornitore del sistema di imaging. Questo valore sarà richiesto nella fase 4.6.
  2. Convertire tutti i formati di file immagine proprietari per i formati di file accettati - TIFF, JPEG e altri formati di file immagine comune.
  3. Nome file di immagine e di organizzare directories (Figura 5A).
    NOTA: Il software si basa sul corretto layout della struttura di directory e nomi di riformattare i risultati in formato piatto:
    1. Nominare i file di immagine nel seguente formato: [targhetta] _ [riga] [colonna] [estensione] o [targhetta] [spazio] [riga] [colonna] [estensione]... [Fila] segue l'ordine alfabetico e [colonna] segue l'ordine numerico.
      NOTA: liberamente disponibile software ridenominazione automatica batch può essere trovato per aiutare gli utenti in questa fase.
    2. Disporre la directory / cartella in base all'esperimento nel seguente modo: Ogni esperimento deve avere una directory. Sotto directory di ogni esperimento, ci dovrebbero essere sottodirectory per ogni punto di tempo. Sotto ogni punto di sottodirectory volta, ci dovrebbero essere tutte le immagini di tutti i piatti.
      NOTA: Per i risultati delle analisi devono essere ordinati in modo ottimale nei risultati formattati, si consiglia di mantenere lo stesso numero di cifre per ogni identificativo compilando 0 del sul left, ad esempio, punti di tempo sono denominati come 000H, 072H e 144H.

4. Image Analysis del Spheroids da SpheroidSizer

  1. Aperto MATLAB, quindi aprire la "Command Window", digitare cd '[directory di installazione]' e premere [INVIO].
  2. Digitare "SpheroidSizer1_0" nella "Command Window" e premere [RETURN] per avviare il programma SpheroidSizer.
  3. Fare clic sul pulsante "Sfoglia" nella finestra SpheroidSizer1.0 per selezionare la directory esperimento che contiene tutte le immagini.
  4. Selezionare "Includi sottocartelle" toggle sotto il campo di testo "Cartella" per elaborare più cartelle di immagini nidificate nella directory designata.
    NOTA: Se "Includi sottocartelle" a levetta non è selezionata, solo le immagini direttamente sotto la directory vengono elaborati, e tutte le sottocartelle vengono ignorati.
  5. Selezionare l'opzione "visualizzazione on-the-fly" a dispgettare ogni immagine segmentata in cima alla sua immagine di origine per il controllo di qualità, come il calcolo viene eseguito.
    NOTA: la velocità di calcolo è più veloce se l'opzione "On-the-fly di visualizzazione" non è scelto.
  6. Specificare "Resolution" (scala dell'immagine / risoluzione in micron / pix) delle immagini analizzate nella casella, per il programma per convertire correttamente le misure della sferoide da pixel a micron.
    NOTA: Tutte le immagini contenute nella stessa cartella o analizzato insieme dovrebbero essere prese sotto lo stesso microscopio con lo stesso obiettivo in modo che la scala dell'immagine / risoluzione rimane costante per ogni esperimento.
  7. (Opzionale) gli utenti possono seguire Step 5 per le impostazioni definite dall'utente avanzate.
  8. Fare clic su "Compute" per avviare il calcolo.
    NOTA: Il software effettua un controllo automatico il nome del file prima di procedere al calcolo. Se una finestra di dialogo che segnala - "esiste un errore nel nome del file", scegliere "Esci e lista degli errori mostra"e correggere gli errori nei nomi dei file elencati (vedi punto 3.3). Quindi, fai clic su "Compute" per avviare nuovamente il calcolo.
  9. Fare clic sul pulsante "Pausa" per mettere in pausa il calcolo; e calcolo può essere ripresa facendo clic sullo stesso pulsante mostra "Continua".
    NOTA: La "tabella dei risultati" visualizza il "Volume" (in mm 3) "Folder", "File", "Length" (in micron), (casella di controllo) "Valido" "Larghezza" (in micron), e per tutti gli sferoidi analizzati (Figura 5C). Volume è calcolato sull'asse misurata maggiore (lunghezza) e dell'asse minore (larghezza) (V = 0.5 * Lunghezza * Larghezza 2). La casella di controllo "Valido" è un'opzione per l'utente di scegliere se l'analisi delle immagini è valido o non valido dopo il controllo di qualità, vedi punto 6.

5. Impostazioni definite dall'utente avanzate

  1. Fare clic sul pulsante "Avanzate" nella spheroidSizer1.0 finestra per aprire la finestra di configurazioni avanzate, al fine di regolare le impostazioni definite dall'utente (Figura 5B).
  2. Immettere i nomi dei file di interesse nella "Formato di uscita" e scatole "Lista di uscita" nella finestra Configurazioni Avanzate in "Input".
  3. Inserire un numero da "2-10" nella casella "Reduce". Questo è un coefficiente per il software per ridurre le dimensioni dell'immagine in calcolo al fine di migliorare la velocità di calcolo. Il più grande è il numero, maggiore è la velocità di calcolo. L'impostazione predefinita "Reduce" è impostato a 10.
  4. Inserire l'estensione del file di immagine a-essere-trattati nella casella "Includi tipo".
  5. Immettere le estensioni di file immagine o terminazioni che non stanno per essere elaborati dal programma nella casella "Escludi tipo" come segue: "_crude.jpg".
  6. Scegliere "None" per "Special Color" per elaborare 8 bit e 16 bit colo immagini correttamente; scegliere "12 bit" per "Special Color" per elaborare correttamente le immagini a colori a 12 bit
  7. Controllare "Usa Parallel Computing" se il computer utilizzato per l'analisi delle immagini è dotato di CPU multiple e / o CPU multi-core. Se questo è vero, quindi andare al passo 5.7.1; se no, ignorare le fasi 5.7.1 e 5.7.2.
    NOTA: Un errore si verifica se il computer in uso non supporta la configurazione scelta.
    1. Selezionare l'opzione "Usa Parallel Computing" nella finestra configurazioni avanzate.
      NOTA: utilizzare solo la modalità di calcolo parallelo quando quattro o più core sono disponibili per il computer.
    2. Immettere un numero di 4-12 in "# Workers" (informatica core) box.
      NOTA: Questo numero deve essere uguale o inferiore al numero di core di calcolo sul computer dell'utente. Un massimo di 12 è imposto dal MATLAB Parallel Computing Toolbox supporta un massimo di 12 core. Quando il calcolo parallelo è essereing eseguito, una piccola visualizzata la finestra di dialogo che chiede all'utente di attendere per il calcolo parallelo per terminare; il calcolo non può essere messo in pausa, e non è la caratteristica "On-the-fly di visualizzazione" in esecuzione in modalità di calcolo parallelo.

6. Controllo Qualità

  1. Fare clic sulla cella corrispondente nella "tabella dei risultati" per confermare l'esatto contorno di delimitazione di uno sferoide nelle immagini analizzate,
    NOTA: Le immagini originali ed il controllo della qualità appariranno sul lato destro per la revisione. L'utente può esaminare tutte le immagini in sequenza usando l'freccia sulla tastiera.
  2. Filtra il confine dello sferoide sull'immagine selezionata utilizzando i seguenti due strumenti, se necessario:
    1. Fare clic sul pulsante "Initialize manuale" per visualizzare l'immagine originale. Quindi fare clic e tenere premuto il pulsante destro fuori della sferoide e trascinare lo strumento ellisse per coprire il sferoide sull'immagine originale.
      NOTA: unalgoritmo ctive-contorno avvia utilizzando il contorno inviati dall'utente ed esegue convergere sul contorno sferoide desideri. La "tabella dei risultati" verrà aggiornato automaticamente con i nuovi risultati. Lo strumento "Initialize manuale" consente all'utente di fornire manualmente inizializzazione per attiva-profilo.
    2. Fare clic sul pulsante "Hand Draw" per visualizzare l'immagine originale. Quindi utilizzare il mouse o un touch screen abilitato per disegnare precisamente i confini dello sferoide.
      NOTA: Questo schema viene misurata direttamente per generare assi maggiore e minore, che vengono aggiornati nella "tabella dei risultati". Lo strumento "Hand Draw" viene utilizzato solo quando l'utensile "Initialize Manual" non riesce a convergere sul confine desiderata dello sferoide.
  3. Deselezionare la casella di controllo nella colonna "Valido" nella riga corrispondente della "tabella dei risultati", quando l'immagine non contiene alcun sferoide valido al momento dell'ispezione. Un "; Etichetta non valida "appare nell'angolo in alto a sinistra dell'immagine di controllo di qualità. Se "Valido" è deselezionata, i valori di tutte le misurazioni sono vuoti per il sferoide nei formattati e di uscita dei risultati dei file esportati.
    NOTA: le seguenti scorciatoie da tastiera sono disponibili da utilizzare nella "tabella dei risultati": "freccia giù" per un'immagine più prossimo; "V" per il valido / non valido; "M" per funzione "Initialize manuale" e "h" per funzione "Draw Hand".

7. Salvataggio ed esportazione dei dati

  1. Fare clic sul pulsante "Esporta Study" nella finestra SpheroidSizer1.0 per esportare lo stato intermedio dell'analisi, se l'utente ha bisogno di uscire dal software prima di terminare il progetto. Specificare il nome e la directory del file da salvare.
  2. Fare clic sul pulsante "Importa Study" per riportare il risultato stato intermedio sopra da "Export Study" e continuare a work su di esso.
    NOTA: I file di stato intermedio sono in un formato nativo di MATLAB (mat.) E non sono direttamente leggibili da altri programmi software. Una funzione di sicurezza integrata nel software rende le esportazioni automatiche del progetto aperto nel caso in cui il programma esce involontariamente. Quando necessario, l'utente può trovare questo file, il cui nome inizia con "~ tmp" che contiene il corrispondente timestamp nel [directory di installazione].
  3. Fare clic su "Formato risultati" nella finestra SpheroidSizer1.0 per salvare i risultati.
    NOTA: due forme di risultati vengono salvati nella directory del esperimento. I nomi dei file esportati possono essere configurati nella finestra di configurazione avanzata (vedi protocollo punto 5.2). Il formato di file di output è una tabella tab-delineato che organizza il valore del volume nel formato originale piastra nell'ordine di una targa ascendente per ciascun punto di tempo; e tutti i punti temporali sono organizzati in ordine crescente (Figura 5D). L'elenco oscita del file è una tabella tab-delineata che contiene tutte le misure in forma di elenchi ordinati (Figura 5E).

Representative Results

SpheroidSizer è progettato per produrre rilevamento automatico, definizione e misurazione degli sferoidi 3D, con una notevole riduzione di lavoro e acutamente maggiore efficienza per grandi quantità di immagini. Figura 1A mostra il flusso di lavoro di SpheroidSizer. I passi fondamentali di calcolo comprendono l'inizializzazione automatico, l'algoritmo profilo attivo e contorno quantificazione. Dopo il calcolo automatico, la funzione di controllo di qualità utilizza una combinazione di "Initialize manuale" e strumenti "disegnare a mano" per salvare qualsiasi segmentazione imperfetto. Figura 1B illustra l'algoritmo profilo attivo automatizzato dettagliata. La fase di inizializzazione (iterazione 0 °) utilizza fasi di elaborazione delle immagini per generare dimensioni approssimative e la posizione dello sferoide e generare un contorno iniziazione sferico con una dimensione stimata. Il profilo iniziazione alimenta l'algoritmo profilo attivo. A sua volta si itera per regolare secondo l'immagine localegradiente e la forma di curvatura. L'algoritmo profilo attivo termina quando il contorno stabilizza (converge), vale a dire 477 iterazioni per questa immagine, oppure quando viene eseguito il numero massimo predefinito di iterazioni. In questo esempio, il profilo di inizializzazione è volutamente ingrandita per mostrare meglio l'algoritmo. In realtà, l'inizializzazione è di solito molto vicino al limite reale e molto meno iterazioni sono necessarie per l'algoritmo a convergere. Successivamente, l'algoritmo effettua misurazioni morfometriche del confine sferoide rilevato. Gli assi maggiore e minore della sferoide sono misurate utilizzando MATLAB toolbox di elaborazione delle immagini (Figura 1C). L'asse maggiore è definito come il segmento di linea che collega una coppia di punti più lontani sul profilo, che si riferisce alla lunghezza (L). L'asse minore è definita come la più lunga linea perpendicolare all'asse maggiore, che si riferisce alla larghezza (W). In questo caso, i valori di L e W sono molto vicine in quanto lasferoide è sferica. Il volume dello sferoide è calcolato come V = 0.5 * L * W 2.

Una delle caratteristiche di SpheroidSizer è la sua rilevazione automatica del limite di sferoidi anche su immagini con sfondo uniforme o rumoroso utilizzando l'algoritmo profilo attivo (Figure 2B-D). Elaborazione computazionale delle immagini in campo chiaro è spesso afflitto da uno sfondo uniforme, che induca erroneamente metodi basati thresholding-adattativi per produrre risultati thresholding indesiderati. Il problema è particolarmente evidente quando piastre multi-pure vengono utilizzati e le pareti dei pozzetti possono creare effetti di ombreggiatura sulle immagini. Tuttavia, poiché l'algoritmo profilo attivo non è sensibile alla variazione ombreggiatura graduale in background, è in grado di identificare segmentazione sferoide in queste immagini in campo chiaro con una corretta inizializzazione. Figura 2 mostra alcuni esempi di immagini con sfondo uniforme o rumoroso, come irregolare illuminazione (Figura 2B (Figura 2C) o core necrotico (Figura 2D). Con algoritmo automatizzato profilo attivo, SpheroidSizer delinea questi sferoidi accuratamente in tutte queste immagini come mostrato nel contorno rosso al pannello inferiore di ciascuna figura.

La funzione di controllo di qualità di SpheroidSizer è la chiave per un flusso di lavoro high-throughput. Il "Initialize Manual" e strumenti "disegnare a mano" sono gli strumenti gratuiti utili per questa applicazione. Tra centinaia o migliaia di immagini, è inevitabile che l'algoritmo automatico non è in grado di rilevare correttamente gli sferoidi in alcune immagini. Come illustrato nella Figura 3A, quando rilevamento errato dello sferoide è dovuta alla fase di inizializzazione, cioè formato improprio o posizione del profilo iniziazione nell'immagine (pannello superiore), l'utensile "Inizializza Manual" funziona consentendo all'utente di correttamente definire la posizione e le dimensioni del spherOID manualmente (pannello inferiore). Si innesca l'algoritmo contorno attiva per lanciare con profilo definito manualmente ed eseguire convergere sul contorno desiderato. Per queste immagini difficili come l'immagine originale in Figura 3B, sferoide si trova in uno sfondo di distrazione e rumoroso. SpheroidSizer non è in grado di identificare univocamente il sferoide dal metodo automatizzato (pannello superiore) o dalla funzione "Inizializzazione manuale" con una corretta inizializzazione (pannello centrale). In questo caso, lo strumento "Draw Mano" può essere utilizzato per estrarre manualmente il contorno dello sferoide come illustrato nel pannello inferiore. Il programma utilizza il limite definito dall'utente per misurare gli assi maggiore e minore del sferoide e calcolare il volume. Tutti i risultati corretti vengono immediatamente inseriti nella "tabella dei risultati", e possono essere di conseguenza esportate.

Per determinare le prestazioni di SpheroidSizer in insiemi di dati di grandi dimensioni, ci confrontiamo prima volta operazioneAnalizzando lo stesso set di 288 immagini utilizzando uno) misurazioni manuali con il microscopio fornitore del software in dotazione; 2) SpheroidSizer con un single-core portatile normale; e 3) SpheroidSizer con un multi-core workstation prestazioni di calcolo parallelo. Le misurazioni manuali seguono il nostro protocollo tipico prima di sviluppare il software: la lunghezza e la larghezza di ogni sferoide sono disegnati a mano e valutate con il fornitore del programma (come si vede le linee rosse nel pannello superiore della figura 4A); poi l'utente copia stabilisce i valori di misurazione. SpheroidSizer elabora ogni immagine generando il confine sferoide (come mostrato il contorno rosso nel pannello inferiore della figura 4A), misurando la lunghezza maggiore e minore assiale, ed esportare i risultati in fogli di calcolo. Come si vede nella Tabella 1, basato sul calcolo di 288 immagini, ci vuole una media di 31.67 sec per misurare uno sferoide per immagine manualmente; mentre richiede solo SpheroidSizer meno di 2 sec & # 160, quando in esecuzione su un single-core portatile normale; e meno di 1 sec quando viene eseguito su una workstation prestazioni 12-core. Pertanto, l'analisi immagine è su 18x più veloce per un'immagine utilizzando SpheroidSizer di misurazioni manuali. Si riduce drasticamente il lavoro quando più di migliaia di immagini vengono analizzati. Avanti, mettiamo a confronto la variabilità nelle misurazioni delle 24 sferoidi illustrati nella Figura 4A tra le misure manuali e SpheroidSizer. Le 24 sferoidi sono misurati tre volte con entrambi i metodi; e la deviazione standard di ogni singolo sferoide viene calcolato. Come si vede nella Figura 4B, la deviazione standard dalla SpheroidSizer (linea verde e puntini) è vicino a zero, tranne per i tre sferoidi che vengono corretti nella fase di controllo di qualità, che mostrano ancora deviazione standard inferiore a quelli del metodo di misurazione manuale. Tutti questi indicano che SpheroidSizer esegue l'analisi dell'immagine più efficiente e preciso.

e_content "> Abbiamo condotto uno schermo di droga utilizzando sferoidi BON-1 tumore 3D umani per scoprire quali composti in combinazione con un inibitore Hsp90 sono i potenziali candidati per testare gli effetti antitumorali in vivo. sferoidi tumorali BON-1 3D umani sono stati coltivati su piastre a 96 pozzetti agarosio rivestite come descritto nel precedente articolo 15. Otto diversi composti con sei diluizioni seriali più mezzi di comunicazione e veicolo sono stati selezionati per i loro effetti singoli e combinatori con 10 nM e 20 nM inibitore Hsp90 in duplicato, rispettivamente. due sferoidi sono stati utilizzati per ciascuna concentrazione della sostanza singola o composti combinati. stati usati quattro piastre da 96 pozzetti con totale 384 sferoidi. Tutti gli sferoidi sono stati ripresi a 0, 72, 144, 168, e 192 hr. Un totale di 1.920 immagini sono state prodotte da questo esperimento. Ci sono voluti SpheroidSizer solo 30 minuti per completare l'analisi computazionale dei 1.920 immagini con un ulteriore 50 min per il controllo di qualità e l'esportazione dei dati. SpheroidSizer accelera il processo di analisi di immagine enorme. figura 5A mostra una schermata del regime cartelle e nomi di file per questo esperimento come un esempio per Protocollo Fase 3.3. Figure 5B-E mostra le schermate delle finestre e dei risultati pop-up di analisi delle immagini . usando SpheroidSizer come illustrazioni per il protocollo Steps 4, 5, e 7 Prendendo i volumi dei sferoidi 3D dalla tabella dei risultati in formato esportato da SpheroidSizer, abbiamo fatto i grafici - la crescita di sferoidi tumorali 3D su trattamenti composti in funzione del tempo di trattamenti. Due grafici rappresentativi di questo esperimento sono mostrati in Figura 5F e 5G. Figura 5F mostra che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e cladribina (linea verde) inibiscono la crescita di sferoidi 3D più che il singolo trattamento di inibitore Hsp90 (linea viola) o cladribina (linea arancione), suggerendo che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e cladribina può avere anti-tumorale effetti in vivo. figura 5G mostra che i trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e adriamicina (linea verde) non inibiscono la crescita di sferoidi 3D più che il singolo trattamento di adriamicina (linea arancione) o un inibitore Hsp90 (linea viola), suggerendo che il trattamenti combinati di inibitore Hsp90 e adriamicina non possono avere effetti anti-tumorali in vivo. Questo esperimento ci ha aiutato a meglio selezionare i composti per testare i loro effetti anti-tumorali in vivo e SpheroidSizer è la chiave per l'analisi dei dati sperimentali veloce.

Tabella 1
Tabella 1. Confronto tra tempo di funzionamento all'analisi dell'immagine tra misurazioni manuali e SpheroidSizer analizzando lo stesso insieme di 288 immagini. prega cleccare qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Figura 1
Figura 1 SpheroidSizer -... Un'applicazione software open-source per misurare le dimensioni della sferoide A) Il flusso di lavoro nucleo dell'applicazione B) Illustrazione dell'algoritmo profilo attivo a diversi stadi di iterazione. Si prega di notare che il contorno di inizializzazione (iterazione 0) è stato appositamente ampliato al fine di mostrare l'algoritmo. C) i maggiori e minori misure di lunghezza assiale e calcolo del volume SpheroidSizer. L - asse maggiore: il segmento di linea che collega una coppia di punti più lontani sul profilo (cui lunghezza); W - asse minore: la linea più lunga perpendicolare all'asse maggiore (di cui larghezza).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi della segmentazione automatica di SpheroidSizer, mostrando la robustezza contro varie condizioni di immagine. A) immagini tipica di buona qualità. B) Immagini con luminosità e contrasto differente. C) Immagini con detriti di distrazione. D) Immagini di sferoidi con core necrotico . Le immagini del pannello superiore di ogni figura sono la fonte / immagini originali; immagini del pannello inferiore di ciascuna figura sono le immagini di controllo della qualità; e il contorno rosso è la segmentazione sferoide disegnata da calcolo automatizzato.

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Figura 3. Illustrazione della "Initialize Manual" e "Disegna Hand" strumenti. A) Lo strumento "Manuale Initialize" consente il disegno di una forma di ellisse raccordo di tutti i sferoide per l'inizializzazione, quando si verifica la segmentazione sferoide impreciso dopo l'inizializzazione automatica. B ) Lo strumento "Hand Draw" consente disegno a mano precisa del confine sferoide, quando segmentazioni sferoidali imprecise si verificano con l'inizializzazione sia automatico che manuale. La linea blu intorno al sferoide mostra il profilo di inizializzazione; il contorno rosso è il confine sferoide identificato. Si prega di notare che la sferoide in "Initialize manuale" in A) e lo sferoide in "Draw Hand" in B) è volutamente ingrandita per mostrare meglio gli strumenti.

Figura 4 Figura 4. Confronto delle prestazioni di analisi di immagine tra SpheroidSizer e misurazioni manuali analizzando lo stesso insieme di 24 immagini. A) sferoidi rappresentativi per mostrare come la lunghezza e la larghezza di sferoidi sono determinate con misure manuali e SpheroidSizer. Top 24 immagini contengono disegnati a mano lunghezza / larghezza di ogni sferoide in linee rosse con misurazioni manuali; minori di 24 immagini (le stesse 24 immagini) contengono computer disegnato sferoidale confine in contorno rosso con SpheroidSizer. B) Deviazione standard della lunghezza o larghezza da tre misurazioni su ogni singolo sferoide.

Figura 5
Figura 5. Un esempio rappresentativo di utilizzazione SpheroidSizer in schermo di droga - analisi delle immagini sulle immagini degli sferoidi 'che sono stati raccolti da uno schermo di droga utilizzando sferoidi tumorali BON-1 3D A) Una schermata del regime cartelle e nomi di file per questo progetto B) Una schermata del avanzati.. finestra configurazioni in SpheroidSizer. C) Una schermata della finestra di SpheroidSizer1.0 con risultati visualizzati tabella. D) Una schermata del file di output in formato esportato da SpheroidSizer. E) una schermata del file di output elenco esportato da SpheroidSizer. F) La crescita di sferoidi tumorali 3D su i trattamenti con inibitori Hsp90 e la cladribina. G) ​​La crescita di sferoidi tumorali 3D su i trattamenti con inibitori Hsp90 e adriamicina. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ P>

Discussion

Questo studio presenta un veloce, flessibile, efficace e automatizzato programma - SpheroidSizer per l'accurata determinazione delle dimensioni di sferoidi tumorali 3D. SpheroidSizer è facile da usare e richiede un input minimo da parte dell'utente. Le fasi più critiche per accurato, buon funzionamento e successo di SpheroidSizer seguenti: che gli sferoidi vengono esposte nel centro del campo senza toccare il bordo del pozzo; tutti i file da analizzare insieme come un progetto dovrebbe essere ripreso con lo stesso microscopio con lo stesso obiettivo; tutti i file da analizzare sono denominate e disposte come indicato nel protocollo correttamente; e le impostazioni definite dall'utente corrette vengono inseriti prima di calcolo.

I vantaggi di SpheroidSizer includono la capacità di tollerare cambiamento graduale sfondo dell'immagine così come per generare profili regolari che corrispondono alle forme sferiche generali degli sferoidi utilizzando l'algoritmo profilo attivo. Prestazioni di attivocontorno può essere compromessa in due situazioni: povero di inizializzazione, o la presenza di altri bordi locali distrarre dal profilo desiderato. In particolare nei nostri casi esaminati, la seconda situazione, può accadere quando il nucleo necrotico di un grande sferoide attira il profilo attivo conseguente minore contorno stati segnalati. Vale la pena notare che altri metodi basati soglia automatizzate soffrono anche in questa situazione meno la soglia è specificamente impostato manualmente. Il software mette quindi in avanti sforzo per aiutare gli utenti a individuare e porre rimedio segmentazione compromessa, fornendo funzionalità di controllo della qualità facili. Se l'errore di segmentazione avviene da una cattiva inizializzazione, usi possono usare "Manual Initialize" strumento per ignorare l'inizializzazione automatica. Quando la qualità dell'immagine è troppo povero per il contorno attivo, gli utenti possono facilmente "disegnare a mano", il contorno che alimenta la quantificazione. Software esistente come CellProfiler può essere adattato per questa applicazione in un Fashio semi-automaticon. Il flusso di lavoro può essere ingombrante quando grandi quantità di immagini con differenti condizioni di imaging sono presentati o quando un sottoinsieme di immagini richiede un intervento più umano per misurare correttamente. SpheroidSizer fornisce una suite all-in-one per il calcolo e il controllo di qualità per la gestione high-throughput workflow analisi delle immagini.

SpheroidSizer è attualmente limitata a rilevare uno sferoide per immagine e misura solo la lunghezza assiale dello sferoide. Il programma può essere esteso per supportare ulteriore quantificazione necessari ai ricercatori come la quantificazione su sferoidi con nucleo necrotico, rilevando multipli sferoidi in un'immagine o monitorare la forma di sferoidi. Inoltre, il programma può essere modificato per rilevare e misurare la dimensione dei tumori asportati da animale o umano, che sarà certamente utile per ricercatori lo svolgimento in vivo pre-clinica o clinica. Post-elaborazione dei sferoidi rilevati può anche essere studiata obiettivozione a ridurre lo sforzo umano necessario per il controllo di qualità e migliorare ulteriormente il throughput. SpheroidSizer è un'applicazione di analisi dell'immagine generalizzata per sferoidi tumorali 3D che sono prodotte da qualsiasi tipo di cellule, e quindi può essere utilizzato da una vasta comunità di ricerca cancro.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare la Fondazione Raymond e Beverly Sackler per il loro sostegno alla nostra ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

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