Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

Biology
 

Summary

Biz, parlak-alan mikroskopisi ile görüntülenmiş üç boyutlu tümör küremsiler boyutunu ölçmek için, bir yüksek verimli bir görüntü analiz yazılımı uygulaması mevcut. Bu uygulama ilaç ekranlarında sferoitlerden kullanmak isteyen araştırmacılar için faydalıdır küremsiler üzerinde tedavi edici ilaçların etkilerini incelemek için hızlı ve etkili bir şekilde sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ilaç keşfi için bir in vitro model olarak üç boyutlu (3D) tümör küremsi uygulamaları artan sayıda büyük çaplı bir görüntü analizi de dahil olmak üzere bir ilaç ekranın her aşamada, büyük ölçekli tarama biçimleri adaptasyonlarını gerektirir. Şu anda bu büyük ölçekli biçimini karşılamak için hiçbir kullanıma hazır ve ücretsiz görüntü analiz yazılımı var. Çoğu mevcut yöntemleri elle sıkıcı ve zaman alıcı bir süreçtir görüntülü 3D sferoitlerin, uzunluğunu ve genişliğini çizim içerir. Bu çalışma, yüksek verimli bir görüntü analiz yazılımı uygulaması sunulur - SpheroidSizer, otomatik olarak ve doğru görüntülü 3D tümör küremsiler majör ve minör eksenel uzunluk ölçer; her 3D tümör sfero hacmini hesaplar; sonra sonraki veri analizi kolay manipülasyon için elektronik tablolar iki farklı şekillerde sonuç verir. Bu yazılımın ana avantajı, güçlü görüntü analizi uygulamasıçok sayıda görüntü için adapte edilmiştir. Bu yüksek verimlilik hesaplama ve kalite kontrol iş akışı sağlar. 1,000 görüntüleri işlemek için tahmini süre ve bir minimal yapılandırılmış dizüstü yaklaşık 15 dakika, ya da bir çoklu-çekirdek performansı iş istasyonunda yaklaşık 1 dk. Grafik kullanıcı arayüzü (GUI) ayrıca kolay kalite kontrolü için tasarlanmış, ve kullanıcıların el bilgisayar sonuçlarını geçersiz kılabilirsiniz. Bu yazılım kullanılan anahtar yöntem, genellikle yüksek verimli ekranlarında otomatik görüntüleme işleme veba düzensiz aydınlatma ve gürültülü arka plan görüntüler için uygundur aynı zamanda Yılanlar olarak bilinen aktif kontur algoritması, uyarlanmıştır. Ücretsiz "Manuel başlat" ve "El Beraberlik" araçları küremsilerden ve farklı kaliteli görüntüler çeşitli türleri ile ilgili SpheroidSizer için esneklik sağlar. Bu yüksek verimli görüntü analiz yazılımı oldukça emek azaltır ve analiz sürecini hızlandırır. Bu yazılımı uygulayan bsanayi ve akademi ilaç ekranlar için in vitro modelde bir rutin haline 3D tümör küremsiler için eneficial.

Introduction

Üç boyutlu (3D) tümör sferoidler 1-3 "hücre eki için bir alt-tabaka ile yapay dokularına benzer tümör hücrelerinin küresel simetrik agrega," dir. Tümörün sitoloji ve morfoloji daha iyi taklit eden in vivo tümör dokusu Organizasyon ve tek tabakalı, iki boyutlu (2B) hücreler daha microenvironments küremsi. 3D tümör sferoidler yüksek verimli anti-kanser tedavi edici ilaçların gösterimleri veya aday ilaçların etkinliğini incelemek için pratik bir in vitro model haline gelmiştir in vivo hayvan ya da klinik olarak test 4. önce. Klinik olarak, herhangi bir anti-kanser ilaç tedavisinin etkinliği azaltılmış tümör büyümesi göre değerlendirilir. Benzer şekilde, küremsi hacim in vitro kanser ilaç çalışmaları için etkinliğinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Sferoid hacmi (V = 0.5 * Uzunluk * Genişlik 2) (daha yaygın uzunluk ve genişlik olarak da bilinir) majör ve minör eksen uzunluğuna göre belirlenirküremsilerin 6, 7. Çoğu araştırmacı elle sık mikroskopi şirketleri tarafından sunulan ve görüntüleme aletleri ile birlikte satılan yazılımı kullanarak, her sferoit üzerinde uzunluk ve genişlik çizmek gerekiyor. Yüksek verimlilik gösteren ilaç ekranlar gerçekleştirilir ve görüntülerin daha fazla yüzlerce üretilir Bu teknik, sorunlu olur. Bazı yeni çalışmalar aydınlatma düzeltme ve basit eşikleme dahil ilkel segmentasyonu rutinleri / makro geliştirmek için böyle CellProfiler 8-10 ve ImageJ 11 gibi açık kaynak kodlu görüntü analiz yazılımı avadanlıkları kullanımını bildirdi. Bu rutinler genellikle aydınlatma durumuna ve görüntü kontrast değişimine göre görüntülerin farklı partiler için yeniden ayarlanması gerekir; bu nedenle, bu yazılım paketi, yüksek verimli görüntü analizi sağlamlığı ihtiyacını karşılamak olamaz. Friedrich ve işbirlikçileri (2009) küremsi hacmi yarı autom ölçmek için özel yazılım kullanılıratically 5. Monazzam ve çalışma arkadaşları kağıt 10'da tarif edildiği gibi bir yöntem, yalnızca görüntüleri küçük bir sayısı için küremsi boyutunu ölçmek için, bir yarı-otomatik bir yöntemdir. Bu nedenle, 3D tümör sferoitlerin için, sağlam, esnek, otomatik ve hazır kullanımlı görüntü analiz araçları için açık bir ihtiyaç vardır.

Bu çalışmada, biz SpheroidSizer tanımlamak - Bir MATLAB tabanlı ve açık kaynak kodlu bir yazılım uygulaması otomatik olarak ve doğru tümör küremsiler boyutunu ölçmek için. SpheroidSizer aynı oturumda 3D sferoidlerin görüntülerin birçok farklı toplu işlemek için tasarlanmıştır. Etkin kontur algoritması 12-14 kullanan SpheroidSizer sağlam arka aydınlatma kademeli değişikliği görmezden ve görüntüde sferoitleri tanımak, görüntü kontrastı değişikliği tolere edebilir. Ayrıca, örneğin, enkaz numune kökenli, çok olağan eserler tolere edebilir. Kullanıcıların kalite contro gerçekleştirmek böylece akışı tasarlanmıştırl sırasında veya sonrasında hesaplama. Analiz sonucunda elle yazma kolayca yerinde gerçekleştirilebilir. Paralel hesaplama araç kutusundan yararlanarak, analiz hızı, daha bir kullanıcının bilgisayarında aynı anda hesaplama üzerinde çalışmak için birden fazla işlem çekirdeği koordine ederek artırdığını olabilir. Ayrıca, SpheroidSizer aşağı analiz araçları ile kolay enterfazı sağlamak için iki farklı formlarda sonuçları verir.

Protocol

Önceki kağıt 15'te tarif edildiği gibi 1. 3D tümör oluşumu sferoidler, ilaç tedavileri ve görüntü toplama gerçekleştirilir.

2.. Yazılım Yükleme

  1. Görüntü analizi için kullanılan bilgisayara lisanslı MATLAB yazılımı yükleyin. Matlab'dan aşağıdaki toolboxes da yüklü olması gerekmektedir - Sinyal İşleme Araç kutusu, Görüntü İşleme araç, ve Paralel Hesaplama araç kutusu * (* paralel hesaplama modu için gerekli sadece).
    NOT: yazılım indirilen ve bağlı bilim adamları tarafından kullanılmak üzere ücretsiz böylece Birçok üniversite grubu lisansı satın almak ve korumak.
  2. SpheroidSizer.zip dosyadan SpheroidSizer program yüklemek (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Yerel dosya sisteminde zip dosyasını kaydedin.
    2. SpheroidSizer dosyayı açın.
    3. Sonradan t olarak anılacaktır belirlenmiş bir dizin / klasöründeki dosyaları kaydetmeO "Kurulum Dizini".
      NOT: SpheroidSizer yaygın Windows 7 işletim sistemi üzerinde test edilmiştir. Bu minimal ayarlamalar (test değil) ile alternatif işletim sistemleri üzerinde çalışması bekleniyor.

SpheroidSizer tarafından Görüntü Analizi için 3. Hazırlık

  1. (Piksel (mikron / pix) başına mikron görüntü mutlak ölçek) görüntüleme sistemi görüntü ölçeği / çözünürlüğünü belirlemek.
    NOT: kamera çip her pikselin büyüklüğü biliniyor ise, görüntü ölçeği objektif büyütme x piksel boyutu (mikron / pix) olarak hesaplanabilir. Bu değer, gömülü meta veriler olarak mikroskopla veya görüntüleme sistemi satıcıdan yardımı ile donatılmış görüntüleme yazılımından elde edilebilir. Bu değer Adım 4.6 gerekli olacaktır.
  2. TIFF, JPEG ve diğer yaygın resim dosyası formatları - Kabul edilen dosya formatları için herhangi bir patentli görüntü dosya formatlarını dönüştürme.
  3. Görüntü dosyaları isim ve directori düzenlemekes (Şekil 5A).
    NOT: Yazılım plakası biçime sonuçları yeniden biçimlendirmek için dizin yapısı ve dosya adları uygun bir düzen dayanır:
    1. Aşağıdaki biçimde görüntü dosyaları Adı: [plakası adı] _ [satır] [sütun] [uzantısı] veya [plakası adı] [boşluk] [satır] [sütun] [uzantı]... [Satır] alfabetik sırayı takip ve [sütun] sayısal sırasını izler.
      NOT: Serbestçe kullanılabilir otomatik toplu yeniden adlandırma yazılım bu adımda kullanıcılara yardımcı bulunabilir.
    2. Her deney bir dizin olması gerekir: Aşağıdaki şekilde deneye dayanan dizin / klasör düzenleyin. Her bir denemenin dizininin altında, her bir zaman noktası için alt-klasör olmalıdır. Her zaman noktası alt dizini altında, bütün plakalardan tüm görüntüleri olmalıdır.
      NOT: optimal biçimlendirilmiş sonuçlarında sıralanmasını analiz sonuçları için için, biz l 0 bulunuyor doldurarak her bir tanımlayıcı için basamak aynı sayıda tutmak öneririzeft, örneğin, zaman noktaları 000h, 072H, 144H ve olarak adlandırılmıştır.

SpheroidSizer ile küremsi 4. Görüntü Analizi

  1. Açık MATLAB, daha sonra "Command Window", cd '[Kurulum Dizini]' ve basın [RETURN] açın.
  2. SpheroidSizer programı başlatmak için "Command Window" tuşuna ve [RETURN] in "SpheroidSizer1_0" yazın.
  3. Tüm görüntüleri içeren deneme dizini seçmek için SpheroidSizer1.0 pencerede "Gözat" düğmesine tıklayın.
  4. Seçmek belirlenen dizin altında birden fazla iç içe görüntü klasörleri işlemek için "Klasör" metin alanının altında durumlu "Alt Klasörlerde dahil".
    NOT: geçiş, yalnızca doğrudan dizin altında görüntüler işlenir, seçili olmadığından ve tüm alt klasörlerini göz ardı edilir "KonumKlasörlerle" Eğer.
  5. Disp için "On-the-fly ekran" seçeneğini seçinizhesaplama idam ediliyor gibi kalite kontrol için kaynak görüntünün üstüne her segmente görüntüyü yatıyordu.
    NOT: "On-the-fly ekran" seçeneği seçilmiş değilse Hesaplama hızı daha hızlıdır.
  6. Program doğru bir pikselin um spheroid ölçümlerini dönüştürmek için, kutuya analiz görüntülerin "Çözünürlük" (mikron / pix görüntü ölçek / çözünürlük) belirtin.
    NOT: Görüntü ölçek / çözünürlüğü her bir deney için sabit kalır böylece tüm aynı klasörde görüntüler veya birlikte incelendiğinde aynı amacı ile aynı mikroskop altında alınmalıdır.
  7. (İsteğe bağlı) Gelişmiş kullanıcılar Kullanıcı tanımlı Ayarları 5. Adım takip edebilirsiniz.
  8. Hesaplama başlatmak için "Compute" tıklayın.
    NOT: Yazılım hesaplama geçmeden önce otomatik bir dosya kontrol yapar. Bir iletişim kutusu olmadığını gösteren - "Hata dosya var", tıklayın "Exit ve hataların listesini gösterir"ve (Adım 3.3 'e bakınız) listelenen dosya hataları düzeltmek. Sonra, yeniden hesaplama başlatmak için "Compute" tıklayın.
  9. Hesaplama duraklatmak için "Pause" düğmesine tıklayın; ve hesaplama "Devam" gösteren aynı butonuna tıklayarak devam edilebilir.
    NOT: (mikron) "Sonuç Tablosu" (mikron) "Klasör", "Dosya" (mm 3'te), "Ses", "Uzunluk" görüntüler "Genişlik" ve "Geçerli" (onay kutusu) analiz küremsilerden (Şekil 5C) hepsi için. Cilt ölçülen büyük eksen (uzunluk) ve minör eksen (genişlik) göre hesaplanır (V = 0.5 * Uzunluk * Genişlik 2). "Geçerli" onay kutusu görüntünün analiz kalite kontrolünden sonra geçerli veya geçersiz Adım 6 görmek, seçmek için kullanıcı için bir seçenektir.

5.. Gelişmiş Kullanıcı tanımlı ayarlar

  1. Spher "Gelişmiş" düğmesini tıklayınoidSizer1.0 kullanıcı-tanımlı ayarları (Şekil 5B) ayarlamak için Gelişmiş Yapılandırmaları penceresini getirmek için pencere.
  2. "Input" altında Gelişmiş Yapılandırmaları penceresinde "Format Çıktı" ilgi dosya adlarını ve "Liste Çıktı" kutularına girin.
  3. "Azaltın" kutusuna "2-10" arasında bir sayı girin. Bu, hesaplama hızını artırmak amacıyla hesaplama görüntü boyutunu azaltmak için, yazılım için bir katsayıdır. Daha büyük sayısı, daha hızlı hesaplama hızı vardır. Varsayılan "azaltın" 10 ayarlanır.
  4. "Türünü Dahil" kutusuna-be-işlenmiş görüntü dosya uzantısını girin.
  5. "_crude.jpg" Şöyle: "türünü dışla" kutusuna program tarafından işlenecek gitmiyor görüntü dosya uzantılarını veya sonları girin.
  6. 8 bit ve 16 bit col işlemek "Özel Renk" için "Hiçbiri" seçeneğini seçinya da düzgün görüntüler; Düzgün 12-bit renk görüntüleri işlemek "Özel Renk" için "12 bit" seçiniz
  7. Görüntü analizi için kullanılan bilgisayar, birden fazla CPU ve / veya multi-core işlemciler ile donatılmış ise "Paralel Computing kullanın" kontrol edin. Eğer bu doğruysa, o zaman 5.7.1 Adım gidin; değilse, o adımlar 5.7.1 ve 5.7.2 atlayın.
    NOT: Kullanılan bilgisayar seçilen yapılandırmasını desteklemiyor eğer bir hata oluşacaktır.
    1. Gelişmiş Yapılandırmaları penceresinde "Use Paralel Computing" seçeneğini işaretleyin.
      NOT: 4 veya daha fazla çekirdek bilgisayar için kullanılabilir olduğunda Sadece paralel hesaplama modunu kullanın.
    2. "# İşçi" 4-12 arasında bir sayı girin (çekirdekleri bilgisayar) kutusu.
      Not: Bu dizi eşit ya da kullanıcı bilgisayar işlem çekirdek sayısının daha az olması gerekir. 12 maksimum MATLAB paralel hesaplama araç kutusu tarafından dayatılan 12 çekirdeklerin maksimum destekler. Paralel hesaplama olacak zamaning, bitirmek için paralel hesaplama beklemek için kullanıcı soran küçük bir diyalog kutusu görüntüler idam; hesaplama durakladı ve ne de paralel hesaplama modunda yürütülen "On-the-fly ekran" özelliği olamaz.

6.. Kalite Kontrol

  1. Analiz görüntülerde bir sfero doğru sınır kontur onaylamak için "Sonuçlar Tablo" karşılık gelen hücreyi tıklayın,
    NOT: Orijinal ve kalite kontrol görüntüler inceleme için sağ tarafta görünecektir. Kullanıcı sırayla klavyede aşağı okunu kullanarak tüm görüntüleri inceleyebilirsiniz.
  2. Gerekirse, aşağıdaki iki araçları kullanarak seçilen görüntü üzerinde sfero sınır daraltın:
    1. Orijinal görüntüyü göstermek için "Manual başlat" düğmesine tıklayın. Ardından tıklayın-ve-basılı tutun sağ sfero dışında fare ve orijinal görüntü üzerinde sfero kapsayacak şekilde elips aracını sürükleyin.
      NOT: Biryönerge-kontur algoritması kullanıcı gönderilen kontur kullanarak başlatır ve istenilen sfero taslağı üzerinde yakınsama yürütür. "Sonuç Tablosu" otomatik olarak yeni sonuçlar ile güncellenecektir. "Manuel Başlatma" aracı kullanıcı elle aktif kontur için başlatma olanağı sağlar.
    2. Orijinal görüntüyü göstermek için "El Çiz" butonuna tıklayın. Sonra tam sfero sınır çizmek için fareyi veya dokunmatik özellikli ekranı kullanabilirsiniz.
      NOT: Bu taslak, doğrudan "Sonuçlar Tablo" olarak güncellenir majör ve minör eksenler oluşturmak için ölçülür. "Manuel başlat" aracı sfero istenen sınırına yaklaşmaya başarısız yalnızca "El Çiz" aracı kullanılır.
  3. Bir görüntü incelenmesi üzerine herhangi bir geçerli sfero içermiyor "Sonuçlar Tablosu" ilgili satırda "geçerli" sütuna onay kutusunun işaretini kaldırın. Bir "; Geçersiz "etiket kalite kontrol görüntünün sol üst köşesinde görünür. "Geçerli" işaretli değilse, tüm ölçümlerin değerleri ihraç biçimlendirilmiş ve çıkış sonuçları dosyalarında sfero için boş bulunmaktadır.
    NOT: Aşağıdaki klavye kısayolları "Sonuç Tablosu" nda kullanmak için kullanılabilir: Bir sonraki resim için "aşağı ok"; Geçerli / geçersiz için "v"; "El Beraberlik" aracı "Manuel başlat" aracı ve "h" için "m".

7. Kaydetme ve Dışa Aktarma

  1. Kullanıcının projeyi bitirmeden önce yazılım çıkmak gerekiyorsa, analiz ara devlet ihracat SpheroidSizer1.0 pencerede "Export Study" düğmesini tıklayın. Kaydedilecek dosyanın adını ve dizin belirtin.
  2. "İhracat Çalışması" adlı yukarıdaki ara durum sonucu geri getirmek ve kel devam etmek için "Import Çalışması" düğmesini tıklayınÜzerinde k.
    NOT: ara durum dosyaları yerel MATLAB formatında (. Mat) olan ve herhangi bir başka yazılım programları tarafından doğrudan okunabilir değildir. Yazılımı yerleşik bir güvenlik özelliği programı istemeden çıkar durumda açık bir proje otomatik ihracatını yapar. Gerektiğinde, kullanıcı ismi [Kurulum dizini] ilgili zaman damgası içeren "~ tmp" ile başlar bu dosyayı bulabilirsiniz.
  3. Sonuçları kaydetmek için SpheroidSizer1.0 pencerede "Format Sonuçları" tıklayın.
    NOT: Sonuçların iki formları denemenin dizine kaydedilir. Ihraç dosya isimleri (Protokol Adım 5.2) Gelişmiş Yapılandırmalar penceresinde yapılandırılabilir. Formatında çıktı dosyası her zaman noktası için bir artan plaka numarası sırayla orijinal plaka biçime hacmi değerini düzenleyen bir sekme delineated tablodur; ve her zaman noktaları artan bir sırayla (Şekil 5D) düzenlenmektedir. Liste oıkış dosya sipariş listeleri (Şekil 5E) şeklinde bütün ölçümlerin içeren bir sekme tarif tablodur.

Representative Results

SpheroidSizer görüntüleri büyük miktarlarda derece azaltılmış emek ve akut verimlilik artışı ile, otomatik algılama, nitelendirmesini ve 3D küremsilerin ölçümü üretmek için tasarlanmıştır. Şekil 1A SpheroidSizer iş akışını gösterir. Çekirdek hesaplama adımlar otomatik başlatma aktif kontur algoritma ve kontur ölçümü bulunmaktadır. Sonra otomatik hesaplama, kalite-kontrol özelliği herhangi bir kusurlu segmentasyon kurtarmak için "Manuel başlat" ve "El Beraberlik" araçları bir arada kullanır. Şekil 1B ayrıntılı otomatik aktif kontur algoritması göstermektedir. Başlatma adımı (0 yineleme) sfero yaklaşık konumunu ve boyutunu oluşturmak ve tahmini boyutu olan bir küresel başlatma kontur oluşturmak için temel görüntü işleme adımları kullanır. Inisiyasyon kontur aktif kontur algoritması besleniyor. Buna karşılık olarak, yerel görüntünün göre ayarlamak için dolaşırdegrade ve şekli eğrilik. Kontur (yakınlaşıyor) stabilize zaman aktif kontur algoritması bitirir, yani bu görüntü, ya da zaman için 477 yineleme yineleme önceden tanımlanmış maksimum sayıda yürütülür. Bu örnekte, başlatma kontur bilerek daha iyi algoritma vitrin büyütülür. Gerçekte, başlatma genellikle gerçek sınırına çok yakın ve çok daha az sayıda iterasyon yakınsama algoritması için ihtiyaç vardır. Daha sonra, algoritma tespit küremsi sınır morfometrik ölçümler alır. Sfero majör ve minör eksenler MATLAB görüntü işleme araç kutusu (Şekil 1C) kullanılarak ölçülür. Ana eksen uzunluğu (L) olarak adlandırılır kontur, en uzak noktaları, tek bir çift bağlantı hat segmenti olarak tanımlanmaktadır. Küçük eksen genişliği (W) olarak adlandırılır ana eksenine dik olan en uzun çizgi olarak tanımlanır. Bu durumda, L ve W değerleri bu yana çok yakın olansfero küreseldir. Sfero hacmi V = 0.5 * L * W 2 olarak hesaplanır.

SpheroidSizer özelliklerinden biri bile pürüzlü veya gürültülü arka plan aktif kontur algoritması (Şekil 2B-D) kullanan ile görüntülerde sferoitlerin sınırının onun otomatik algılama olduğunu. Parlak bir alan görüntülerin Hesaplamalı işleme genellikle istenmeyen eşikleme sonuçları üretmek için uyarlamalı eşik-tabanlı yöntemler aldatmaktadır düzensiz arka, rahatsızlanır. Çok iyi plakalar kullanılır ve kuyuların duvarları görüntülerde gölgeleme etkileri yaratabilir zaman sorun özellikle belirgindir. Etkin kontur algoritması arka kademeli gölgeleme değişikliğine duyarlı değildir Ancak, bu. 2. dengesiz gibi, düzensiz veya gürültülü arka plan ile görüntülerin birkaç örnek göstermektedir uygun başlatma ile bu parlak alan görüntülerde sfero segmentasyon tanımlamak mümkün değildir aydınlatma (Şekil 2B (Şekil 2C) ya da nekrotik çekirdek (Şekil 2D). Her şeklin alt panelinde kırmızı kontur gösterildiği gibi otomatik aktif kontur algoritması ile SpheroidSizer tüm bu görüntüler doğru bu sferoitleri çizer.

SpheroidSizer kalite-kontrol özelliği yüksek verimli bir iş akışı anahtarıdır. "Manuel Başlatma" ve "El Beraberlik" araçlar bu uygulama için değerlidir ücretsiz araçlardır. Görüntüler yüzlerce veya binlerce arasında, otomatik algoritması doğru bazı görüntülerde sferoidlerin tespit etmek mümkün değildir kaçınılmazdır. Sferoit olması ile uygunsuz tespiti, bu başlatma aşamasından neden olduğu Şekil 3A'da, gösterildiği gibi, örneğin, uygun olmayan boyut ve görüntü (üst panel) 'de başlangıç ​​kontur yer, "Manual Initialize" araç, kullanıcı için uygun bir şekilde izin çalışır spher konumunu ve boyutunu tanımlamakmanuel (alt panel) OID. Bu el tanımlanan kontur ile başlatmak ve istenilen taslağı üzerinde yakınsama yürütmek için aktif kontur algoritması tetikler. Şekil 3B orijinal görüntü gibi bu zor görüntüler için, küremsi bir rahatsız edici ve gürültülü arka planda yer almaktadır. SpheroidSizer düzgün otomatik yöntemi (üst panel) veya uygun başlatma (orta panel) ile "Manuel başlat" aracı ile sfero tespit etmek mümkün değildir. Bu durumda, "El Çizim" araç alt panelde gösterildiği gibi el ile sferoit olması ile ortaya çıkarabilmek için kullanılabilir. Program sfero majör ve minör eksenleri ölçmek ve hacmini hesaplamak için kullanıcı-tanımlı sınır kullanır. Tüm düzeltilmiş sonuçlar hemen "Sonuçlar Tablo" dahil edilir ve buna göre ihraç edilebilir.

Büyük veri setlerinde SpheroidSizer performansını belirlemek için, ilk olarak ameliyat süresini karşılaştırmakmikroskop satıcı verilen yazılımla 1) manuel ölçümler kullanılarak 288 görüntülerin aynı seti analiz; Tek çekirdekli normal dizüstü bilgisayar ile 2) SpheroidSizer; ve 3) bir çok-çekirdekli paralel işlem performansı iş istasyonu ile SpheroidSizer. Manuel ölçümler önce yazılım geliştirme bizim tipik protokolünü uygulayın: Her sfero uzunluğu ve genişliği elle çizilmiş ve satıcı programı (Şekil 4A üst paneldeki kırmızı çizgilerini görüldüğü gibi) kullanılarak ölçülür; Kullanıcı daha sonra kopya ölçümlerin değerleri aşağı. SpheroidSizer (Şekil 4A alt panelde kırmızı anahat gösterildiği gibi), küremsi sınır üreten eksenel büyük ve küçük uzunluğunun ölçülmesi ve tablolar sonuçları vererek, her bir görüntü işler. Tablo 1'de görüldüğü gibi, 288 görüntülerden hesaplamaya göre, elle görüntü başına bir sfero ölçmek için 31.67 sn ortalama alır; sadece SpheroidSizer az 2 sn & ​​alır iken # 160; tek çekirdekli normal dizüstü çalışırken; ve en az 1 sn 12-çekirdek performansı iş istasyonunda çalışırken. Bu nedenle, görüntü analizi manuel ölçümlerden daha SpheroidSizer kullanarak imajlar 18x üzerinde hızlıdır. Görüntülerin binlerce daha analiz edildiğinde o ölçüde emek azaltır. Sonra, manuel ölçü ve SpheroidSizer arasında Şekil 4A'da gösterilen 24 sferoitlerin ölçümlerinde değişkenlik karşılaştırın. 24 küremsiler iki yöntemle üç kez ölçülür; ve her bir sferoit olması ile standart sapma hesaplanır. Şekil 4B, SpheroidSizer (yeşil çizgi ve noktalar) gelen standart sapma görüldüğü gibi hala manuel ölçümler yönteminden daha küçük standart sapma göstermek kalite-kontrol adımda, düzeltilmiş üç küremsilerden haricinde sıfıra yakındır. Bütün bu SpheroidSizer daha verimli ve doğru bir görüntü analizi gerçekleştirir olduğunu göstermektedir.

e_content "> in vivo anti-tümör etkilerini test etmek için potansiyel adaylardır. insan BON-1 3B tümör sferoidler yetiştirildiği bir hsp 90 inhibitörü ile kombinasyon halinde bileşimler öğrenmek için insan BON-1 3B tümör küremsilerin kullanarak ilaç eleme işlemi yaptık Daha önceki çalışmada 15 de tarif edildiği gibi agaroz kaplı 96 oyuklu plakalar üzerine. altı seri seyreltmeleri artı ortamı ve araç ile sekiz farklı bileşikler, sırasıyla 10 nM ve 20 nM, iki kopya halinde, HSP90 inhibitörü ile tek ve kombinasyon etkileri için taranmıştır. iki sferoidler idi her bileşiğe ayrı ayrı ya da birleşik bileşiklerinin her bir konsantrasyonu için de kullanılır. toplam 384 sferoidlerle dört 96 oyuklu plakalar kullanılmıştır. bütün sferoidler, 0 ° C'de 72, 144, 168, ve 192 saat görüntülendi. 1920 görüntülerin toplam üretildi Bu deneyden. Bu kalite kontrol ve veri ihracat için ek bir 50 dakika ile 1.920 görüntülerin hesaplamalı analizi tamamlamak için SpheroidSizer sadece 30 dakika sürdü. SpheroidSizer muazzam görüntü analiz sürecini hızlandırır. Şekil 5A Protokol Adım 3.3 için bir örnek olarak, bu deney için klasör düzenlemeler ve dosya ekran resmini gösterir. Rakamlar 5B-E görüntü analizi pop-up pencereleri ve sonuçların ekran görüntüleri gösterir . tedavilerin zamana karşı bileşiği, tedavi üzerine 3D tümör küremsi büyümesi - SpheroidSizer dışa biçimlendirilmiş sonuçlar tablo 3D sferoitlerin hacimleri alarak protokol safhaları 4 için resim, 5 ve 7 olarak SpheroidSizer kullanıp grafikler yaptı. Bu deneyden elde İki temsili grafik Şekil 5F ve 5G gösterilmiştir. Şekil 5F HSP90 inhibitörü ve kladribin (yeşil hat) birleşik tedaviler 3D düşündüren, HSP90 inhibitörü (mor hattı) veya kladribin (turuncu hat) bir tedaviden daha fazla küremsiler büyümesini inhibe olduğunu gösterir ve birleştirilen hsp 90 inhibitörünün tedavi ve Kladribin anti-tümör ef gerekebilirin vivo sürdürdüğünü belirtti. Şekil 5G hsp 90 inhibitörü ve adriamisine (yeşil hat) kombine tedaviler 3D büyüme düşündüren, adriamisine (turuncu hat) veya hsp 90 inhibitörü (mor çizgi) tek tedaviden daha küremsilerden inhibe etmediğini göstermektedir ki HSP90 inhibitörü ve adriamisinin kombine tedaviler, in vivo anti-tümör etkileri olabilir. Bu deney bize daha iyi in vivo anti-tümör etkileri test etmek bileşikleri seçin ve SpheroidSizer hızlı deneysel veri analizi için anahtar oldu.

Tablo 1
Tablo 1. Çalışma süresinin karşılaştırılması manuel ölçümler ve SpheroidSizer 288 görüntülerin aynı seti analiz ederken. Arasındaki görüntü analiz edin cBu tablonun daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya yalamak.

Şekil 1
Şekil 1 SpheroidSizer -... Tekrarında farklı aşamalarında aktif kontur algoritmasının spheroid boyutunu ölçmek için bir açık kaynak yazılım uygulaması A) uygulamasının çekirdek iş akışı B) İllüstrasyon. Başlatma kontur (yineleme 0) kasten algoritma. C) majör ve minör aksiyel uzunluk ölçümleri ve SpheroidSizer tarafından hacminin hesaplanması vitrin için genişletildi unutmayın. L - büyük eksen: (uzunluk olarak anılacaktır) kontur üzerindeki en uzak nokta, tek bir çift çizgi bağlantı parçası; W - küçük eksen: (genişlik da adlandırılır) ana eksenine dik en uzun hattı.

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 2,
Nekrotik çekirdek ile sferoidlerin rahatsız edici enkaz farklı parlaklık ve kontrast ile Şekil 2. Çeşitli görüntü koşullarına karşı dayanıklılığını gösteren SpheroidSizer arasında otomatik segmentasyon, gelen Temsilcisi sonuçları. A) Tipik iyi kalitede görüntüler. B) Resimler. C) Resimler. D) Görüntüler . Her şeklin üst panelinde Görüntüler kaynak / orijinal görüntüler; her şeklin alt panelinde görüntüleri kalite-kontrol görüntüler; ve kırmızı anahat otomatik hesaplama ile çizilmiş sfero segmentasyondur.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Araçları. A) "Manual başlat" aracı başlatma sfero genelinde bir uydurma elips şeklin çizimini sağlayan "El çizin" "Manuel başlat" ve Şekil 3. İllüstrasyon, yanlış sfero segmentasyon otomatik başlatma sonra oluşur. B ) "El Çiz" aracı küremsi sınır doğru el çizim, yanlış sfero bölütlemelerle hem otomatik ve manuel başlatma meydana sağlar. Sfero etrafında mavi çizgi başlatma kontur gösterir; kırmızı anahat tespit sfero sınırıdır. A "Manuel başlat") ve B "Hand Çiz" olarak sfero) küremsi bilerek daha iyi araçlar vitrin genişlemiş olduğunu unutmayınız.

Şekil 4, Şekil 4. 24. görüntülerin aynı seti analiz SpheroidSizer ve manuel ölçümler arasındaki görüntü analizi performans karşılaştırması. A) Örnek sferoidler küremsiler uzunluk ve genişlik ölçümleri ve manuel SpheroidSizer belirlenir göstermek için. Top 24 görüntüler manuel ölçümler kullanılarak kırmızı çizgiler her sfero elle çizilmiş uzunluk / genişlik içerirler; alt 24 görüntüleri (aynı 24 görüntüler) SpheroidSizer. B) her spheroid üç ölçümlerinden uzunluğu veya genişliği standart sapma kullanılarak kırmızı anahat bilgisayar çizilmiş sfero sınır içerir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Küremsi kullanımı temsili bir örneği,Ilaç ekranında Sizer -.. A) Bu projenin gelişmiş B) bir ekran görüntüsü için klasör düzenleme ve dosya bir ekran görüntüsü BON-1 3D tümör sferoitleri kullanarak ilaç ekran toplanmıştır küremsilerin 'görüntülerde görüntü analizi SpheroidSizer. C) konfigürasyonları penceresi görüntülenir Sonuçlar Tablo. D ile SpheroidSizer1.0 pencerenin bir ekran görüntüsü) SpheroidSizer. E) ihraç format çıkış dosyasının bir ekran görüntüsü bir ekran SpheroidSizer. F ihraç liste çıktı dosyasının atış) hsp 90 inhibitörü ve kladribin hsp 90 inhibitörü ve Adriyamisin tedaviler üzerine 3D tümör sferoidlerin. G) Büyüme ile tedavileri üzerine 3D tümör küremsiler Büyüme. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. </ P>

Discussion

SpheroidSizer 3D tümör küremsiler büyüklüğü doğru belirlenmesi için - Bu çalışma, hızlı, esnek, etkin ve otomatik bir program sunar. SpheroidSizer kullanımı kolaydır ve en az kullanıcı girdisi gerektirir. SpheroidSizer doğru, düzgün ve başarılı bir şekilde çalıştırmak için en kritik adımları içerir: söz konusu sferoidler iyi kenarını dokunmadan alanının merkezinde görüntülü olduğu; bir proje olarak birlikte analiz edilecek tüm dosyaların aynı amacı ile aynı mikroskop altında görüntülü olmalıdır; analiz edilecek tüm dosyaları doğru adlandırılmış ve protokolde belirtildiği gibi düzenlenmiştir; ve doğru kullanıcı-tanımlı ayarlar hesaplama önce girilir.

SpheroidSizer avantajları görüntüde kademeli arka plan değişimi tolere hem de aktif kontur algoritmasını kullanan sferoitlerin genel küresel şekillere karşılık gelen düz hatlarını oluşturmak için kabiliyetini içerir. Aktif performansfakir başlatma veya istenilen konturundan rahatsız edici diğer yerel kenarlarından varlığı: kontur iki durumda tehlikeye girebilir. Büyük bir sferoit olması ile nekrotik çekirdek rapor edilmektedir küçük kontur ile sonuçlanan aktif kontur çeken Spesifik olarak, bizim test edilen durumda, ikinci durum, bazen olur. Bu eşik, özellikle elle ayarlanır sürece diğer otomatik eşik-tabanlı yöntemler de bu durumda acı çekiyor. Yazılım bu nedenle ileri kullanıcılar algılanmasına yardımcı ve kolay kalite kontrol özelliklerini sunarak tehlikeye segmentasyon giderilmesi için çaba koyar. Segmentasyon hatası yoksul başlatma gelen olursa, kullandığı otomatik başlatma geçersiz kılmak için "Manual başlat" aracını kullanabilirsiniz. Görüntü kalitesi aktif kontur için çok kötü olduğunda, kullanıcıların kolayca miktar besleniyor kontur "El çizin" olabilir. Örneğin CellProfiler gibi mevcut yazılım yarı otomatik bir Fashio olarak bu uygulama için uyarlanabilirn. Görüntülerin bir alt doğru ölçmek için daha fazla insan müdahalesi gerektiğinde farklı görüntüleme koşulları görüntüleri büyük miktarlarda sunulan veya zaman akışı hantal olabilir. SpheroidSizer hesaplama ve yüksek verimli görüntü analizi iş akışını yönetmek için kalite kontrolü için bir all-in-one paketi sağlar.

SpheroidSizer anda bir görüntü için bir sfero tespit sınırlıdır ve yalnızca sferoit olması ile aksiyel uzunluk ölçer. Program bir resim içinde çoklu tespit sferoidler ya da sferoitler şeklini izlemek, nekrotik çekirdeği ile bu tür küremsi miktar olarak araştırmacılar tarafından ihtiyaç duyulan daha fazla ölçümü desteklemek için uzatılabilir. Ayrıca, program in vivo ön-klinik ve klinik araştırma yaparken de kesinlikle araştırmacılar için yararlı olacaktır hayvan veya insandan çıkarılan tümörlerde, boyutunu tespit etmek ve ölçmek için modifiye edilebilir. Tespit edilen sferoitlerin post-işlem de amaç araştırılabilirkalite kontrolü için ihtiyaç duyulan insan çabasını azaltır ve daha fazla verim artırılması ing. SpheroidSizer herhangi bir hücre tipinden üretilen ve bu nedenle, geniş bir kanser araştırma eden tarafından kullanılabilir 3D tümör sferoitler için genel bir görüntü analiz uygulamasıdır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz araştırma destekleri için Raymond ve Beverly Sackler Vakfı'na teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
  2. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
  3. Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
  4. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  5. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
  6. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
  7. Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
  8. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
  9. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
  10. Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  12. Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  13. Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
  14. Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
  15. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics