Стабилизация Гепатоцеллюлярной Фенотип используя оптимизированные синтетические покрытия

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта статья будет сосредоточена на разработке полимерных покрытием поверхностей для долгосрочного, стабильного культура стволовых клеток получены человеческие гепатоциты.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Биологические материалы широко используются в поддержании и дифференциации плюрипотентных стволовых клеток 1. В то время как позволяет, эти биологические субстраты часто содержат множество неопределенных компонентов. Матригель является широко используемым субстратом для культуры и дифференциации стволовых клеток. К сожалению, его переменный состав влияет функцию клеток и фенотип. Хотя разнообразие альтернативных, более определенные биологические матриц были использованы 2-7, их животного происхождения или плохой масштабируемости делает их непригодными кандидатов для промышленного производства. Поэтому идентификация синтетические альтернативы, с определенным составом и надежной работы, являются ключевыми целями в исследовании стволовых клеток.

В попытке преодолеть ограничения неопределенных культивирования клеток субстратов, междисциплинарное сотрудничество между химией и биологией определили синтетические материалы со способностью поддерживать фенотип клеток. SynthEtic субстраты являются масштабируемыми, экономически эффективным, и могут быть изготовлены в сложных 3D структур, имитируя в естественных условиях окружающей среды. Благодаря этим свойствам синтетические субстраты были широко используются для поддержки и привод дифференцировку многих типах клеток 8-10.

Расширенный и высокой пропускной анализы способствовали оперативно провести проверку синтетических материалов, из крупных библиотек, и доставлены новые материалы с гибкими свойствами с широкого применения в биомедицинских исследованиях и разработках 11-13. Используя высокую пропускную способность, полимерной технологии скрининга микро-массив, мы быстро определили простой полиуретан (PU134), подходит для поддержания человека стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Этот полимер был найден, чтобы быть выше на животных, полученных подложек в отношении дифференцировки гепатоцитов и функции 14-16. Мы впоследствии оптимизировать процесс при нанесении покрытий, топографии и стерилизации для доступа эффектына полимерной производительности в стабилизации функцию гепатоцитов и продолжительность жизни. Это имеет важные последствия в отношении понимания основ гепатоцитов биологии для основе моделирования клеток и регенеративной медицины приложений.

Технология здесь описано представляет собой пример того, как поверхность из синтетического полимера могут быть оптимизированы, чтобы сохранить фенотип клеток. Мы считаем, что сочетание этой технологии с протоколом дифференцировки бесплатно гепатоцитов эффективность сыворотки имеет потенциал, чтобы обеспечить масштабируемое производство гепатоцитов для использования в моделировании в пробирке и регенеративной медицины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез PHNGAD (поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол)

Схема 1

Схема 1: Синтез PHNAGD Схематическое представление синтеза PHNAGD.. PHNAGD готовили по реакции 1,6-Hexanodiol, диэтиленгликоль, neoppentyl гликоля и адипиновой кислоты. PHNAGD, поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол.

  1. Применение термической обработки для мономеров 1,6-гександиол, ди (этиленгликоль) и неопентилгликоля при 40 ° С в течение 48 ч в вакуумной печи, чтобы удалить остатки воды. Разрешить к холоду до комнатной температуры под вакуумом.
  2. Добавить 22 ммоль каждого мономера и адипиновой кислоты (55 ммоль) в два-горлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой бар и соединен с ловушкой Дина-Старка.
  3. Поместите весь узел в вакууме и осторожно нагреть GLAssware при 40 ° С в течение 6 часов, с тем чтобы избежать поглощения влаги во время добавления химических в колбу.
  4. Добавить с помощью шприца, по капле, 0,0055 моль катализатора титана (IV) бутоксиду.
  5. Реакционную смесь перемешивают при 180 ° С, под атмосфере N2 в течение 24 ч, и собирают остаточной воды в ловушке Дина-Старка. Дать продукту остыть до комнатной температуры.

2 Синтез PU134

Схема 2

Схема 2: Синтез PU134 Схематическое представление синтеза полиуретана PU134 134 был подготовлен в результате реакции 1,0 экв о PHNGAD с 2,0 экв в 4,4'-метиленбис (фенилизоцианат), с последующим добавлением 1,0. экв из 1,4-бутандиол удлинителя цепи.

  1. Смешайте один эквивалент полиола PHNGAD (Mn ~ 1800 Да, 3,2 ммоль) с двумя эквивалентами 4«4-метилен (фенил изоцианат) (6,4 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (12 мл).
  2. Реакционную смесь перемешивают при 70 ° С, под атмосфере N2.
  3. Добавить с помощью шприца по каплям титанового катализатора (IV) бутоксид (0,8% мас).
  4. После 1 часа, добавляют один эквивалент удлинитель цепи 1,4-бутандиол (3,2 ммоль). Увеличение температуры на 90 ° С и перемешивают в течение 24 ч под N 2 атмосфере.
  5. После реакции, собирают осаждением из полиуретана добавлением диэтилового эфира (гексан или воды также может быть использован) по каплям в реакционный раствор до тех пор, осаждение не происходит.
  6. Центрифуга решение в 5300 мкг в течение 5 мин.
  7. Декантировать супернатант и не высохнуть при 40 ° С в вакуумном сушильном шкафу до испарения растворителя.
    Примечание: Для того чтобы гарантировать, что конечный продукт реакции обладает правильные параметры в отношении к молекулярно-массовым распределением, функциональный ГроуPS полимера и температур плавления и стеклования, различные аналитические методы и методы могут быть использованы, например, гель-проникающей хроматографии или Fitr спектроскопии.

3 Получение PU134 Solutions

  1. Взвешивают 200 мг PU134 в стеклянный флакон.
  2. Развести PU134 до конечной концентрации 2% в ряде растворителей: хлороформ, комбинации хлороформа и толуола в соотношении 1: 1, тетрагидрофуран и комбинация тетрагидрофурана и дихлорметана в соотношении 1: 1.
    Примечание: Избрание правой растворителя варьируется в зависимости от полимера, чтобы использовать. Различные растворители обладают разные температуры кипения, что может повлиять на растворение полимера.
  3. Встряхнуть раствор энергично в течение 20 мин при комнатной температуре с использованием шейкера со скоростью 200 мот / мин, до тех пор пока раствор не станет однородным и не наблюдается осадок.

4 Покрытие стеклах с PU134

  1. Поставьте Rouй 15 мм 2 покровное на спин нанесения покрытий.
  2. Применение 50 мкл раствора PU134 друг с помощью пипетки. Регулировка громкости на PU134 решения соответственно для необходимого размера покровного сохраняя объем на поверхность соотношение пропорциональный.
  3. Спин каждый покровное на 7 сек при 23 х г.
  4. Воздух сухой покровное при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часов перед стерилизацией.

5 Облучение покровное

  1. Гамма-облучение покровное с покрытием полимера с применением дозы 10 Грейс с помощью лабораторной облучатель в течение 12 мин.
  2. УФ облучение с полимерным покрытием покровное использованием 30 Вт, УФ лампы в течение 16 минут с каждой стороны.
  3. Поместите полимерным покрытием покровное в подходящем планшет для тканевых культур в соответствии с размером слайдов.

6 сканирующей электронной микроскопии

  1. Золото слой полимера покровное путем напыления на 200 сек в атмосфере 5 х 10 -1 миллибар давления.
  2. Захват мкгraphs из полимерной покрытием покровное использованием сканирующего электронного микроскопа при ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме вторичной электронной визуализации.

7. атомно-силовой микроскопии Наблюдения

  1. Сканирование площадью 20 х 20 мкм от поверхности полимера.
  2. Настройте скорость сканирования от 1,32 Гц до 1,60 Гц.
  3. Настройте разрешение 512 х 512 пикселей в отсканированном регионе.
  4. Рассчитать среднеквадратичное (RMS или Rq) покрытия с использованием средних отклонениях по высоте, взятых из средней плоскости данных изображения, выражена следующим образом:

    Где Zi является текущее значение Z, и N является число точек в пределах данной области.
  5. 7.5 Рассчитайте отклонение или среднее шероховатость поверхности (Ra) изображения с использованием,

    Где Z (х) является функцией, которая описывает тон поверхности профиля проанализированы с точки зрения высоты (Z) и в положении (х) образца по длине оценки "L". Ra представляет собой среднее значение поверхности по отношению к центральной плоскости.

8 Культура клеток и дифференцировки

  1. Культура и дифференцировать человеческие эмбриональные линии стволовых клеток (чЭСК) H9, как описано в Hay 17.
  2. Отделить клеток с использованием диссоциации реагента и replate их на предметные стекла, покрытые PU134 на 9 день процесса дифференцировки, в присутствии бессывороточной среде, как описано в Szkolnicka 18,19.
    Примечание: Использование ферментативной диссоциации клеток предпочтительно физической отряда клеток.

9. цитохрома Р450 функциональный анализ

  1. Измерьте CYP3A деятельность в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Выдержите чЭСК полученных гепатоциты на 13-й день или День 19, и средства массовой информации без клеток - в качестве отрицательного контроля, с соответствующим подстрокаели в течение 5 ч при 37 ° С.
  3. Соберите супернатанатах клеток и СМИ, проводить анализ в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Измерьте уровень CYP деятельности и нормализованного по отношению к площади поверхности (см 2).

10. Иммуноокрашивание

  1. Промыть чЭСК полученных гепатоциты с PBS, в течение 1 мин, повторить два раза.
  2. Добавить ледяным 100% метанола, чтобы исправить клетки, место в -20 ° С в течение 10 мин.
  3. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют дважды.
  4. Инкубируйте клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Аспирируйте PBST раствор и добавить соответствующее первичного антитела, разбавленного в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, инкубируют при 4 ° С и при мягком помешивании O / N.
  6. Промыть клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA в течение 5 мин и повторяют три раза.
  7. Развести соответствующего антитела в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, добавить к клеткам и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном перемешивании.
  8. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют три раза.
  9. Добавить Mowiol 488 (DAPI, содержащий 1: 1000) в каждую лунку, добавить покровное осторожно, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха. Магазин фиксированной клеток при 4 ° С в темноте. Соблюдайте окрашивания с помощью микроскопа с соответствующим фильтром и люминесцентных ламп. Оптимизированные первичные и вторичные антитела, перечислены в таблице 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Растворителя полимера влияет на топографию поверхности с полимерным покрытием

Полиуретан 134 солюбилизировали в хлороформе, либо по отдельности, либо в сочетании с толуол или тетрагидрофуран или дихлорметан, и предметные стекла с покрытием по спину с различных составов. Сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и атомно-силовой микроскопии (AFM), были использованы для характеристики физических свойств полимерных покрытий (фиг.1). Покрытие получается при использовании толуола или хлороформ не был однородным, демонстрируя неровную покрытие с PU134 осадков (рисунок 1А). В отличие от этого, тетрагидрофуран подходящего растворителя позволяет спин покрытие из гораздо более однородную поверхность (фиг.1А). Рельеф поверхности измеряли с помощью АСМ использованием среднеквадратичное (RMS) и среднее шероховатость (Ra). PU134 растворяется тетрагидрофуран выставлены снижение на 40% в шероховатости по сравнению с гое другие растворители (Рисунок 1б и 1в). Эти данные показывают, что использование тетрагидрофурана в качестве растворителя обеспечивает более равномерное покрытие PU134 для биологических применений.

Полимер топография имеет значительное влияние на функции гепатоцитов

чЭСК может быть эффективно дифференцированы с печеночной энтодермы в пробирке, демонстрируя многие из функций, найденных в печени взрослого 17-20. Печени дифференциация энтодерма индуцировали и на День 9 hepatoblast-подобные клетки были очевидны, с большинством клеток, экспрессирующих цитокератин 19 (99% ± 1,2), α-фетопротеин (99% ± 0,6) и печеночный ядерный фактор 4α (97% ± 2.6); и низкий уровень альбумина (20% ± 1,7) (Рисунок 2). В этот момент клетки отделяли с помощью TrypLE выражать и высевали на различных полимерных поверхностей с покрытием. В качестве меры метаболические функции, цитохром Р450 есоборование оценивали 4 дней после replating. Мы наблюдали 2-кратное увеличение метаболической активности в клетках пересевали на тетрагидрофуран / поверхностей PU134 покрытием (рисунок 3). Эти результаты показывают, что чЭСК полученных гепатоцитов метаболическая активность улучшена с более равномерного покрытия PU134, это соответствует предыдущих подходов 21.

Воздействие стерилизации поверхности на биологически активных свойств полимера

Исследовали также влияние стерилизации на выполнение PU134. С полимерным покрытием стеклышки подвергались УФ или гамма-облучением. Фаза контраст изображения из PU134 покрытых стеклах показали не валовые различия не размещать УФ или гамма-облучение (Рисунок 4а). Эти наблюдения были дополнительно подтверждены анализом SEM (фиг.4В). Биологическая эффективность PU134 исследовали при помощи чЭСК полученных гепатоциты на 10 дней после replating. чЭСК полученныхгепатоциты пересевали на γ-излучаемая PU134 покрытых стеклах отображается 3-кратное увеличение CYP3A деятельности над клеток высевали на УФ-излучаемая PU134 покрытием стеклах (Рисунок 4C). Эти наблюдения показали, что гамма-облучение было оптимальным техника стерилизация для наших целей.

Рисунок 1
Рис.1 Оптимизация поверхности, покрытой полиуретановой 134. (А) предметные стекла были покрыты 2% раствора PU134, растворенного в различных растворителях. Сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображения различных стеклах с покрытием показывают наличие однородной поверхности с покрытием и отсутствие полимера выпадает в осадок, когда тетрагидрофуран был использован сравнению с толуол, хлороформ, или смеси растворителей (черные и белые стрелки). Снимки были сделаны в x1664 увеличением и весы бары ар электронной показано ниже изображений. (BC) Атомно-силовая микроскопия (АСМ) был использован для анализа шероховатости PU134 покрытых поверхностей на отдельных растворителей. Анализ параметров шероховатости RMS (среднеквадратичное) (B), и Ra (средняя шероховатость) (С) из различных PU134 покрытием поверхностей показывают, что покрытие, полученное с помощью использованием тетрагидрофурана в качестве растворителя имели гладкую поверхность по сравнению с Остальные условия (N = 7). Данные представлены в виде среднего значения ± SD, р <0,05 обозначается *, р <0,01 обозначается **, и р <0,001 обозначается ***, измеряется студентов Т-тест по сравнению с горок, покрытых PU134 солюбилизированных в тетрагидрофуране. Усы представляют 1 стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

айс "> Рисунок 2
Рисунок 2 Характеристика из чЭСК полученных гепатобластов. Иммуноцитохимия показывая выражение печеночных маркеров AFP, CK19, HNF4α и альбумина в ЭСК (H9) происходит в печени энтодерму. Отрицательные контроли были выполнены с соответствующей иммуноглобулина G (IgG) и представительные изображения показаны. Процент положительных клеток и стандартное отклонение, по оценкам, по меньшей мере пяти случайных полей зрения, содержащих по меньшей мере, 300 клеток на зрения. Снимки были сделаны в 20-кратным увеличением. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение Ошибка бары представляют 1 стандартное отклонение. HNF4α, гепатоцитов ядерного фактора 4α; АФП, α-фетопротеин; ALB, альбумин; CK19, Цитокератин 19, IgG козы, Иммуноглобулин G анти-козел, IgG мыши, Иммуноглобулин G анти-мышь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную Versiна этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Функциональные последствия топографии поверхности в PU134 покрытием на функции чЭСК полученных гепатоцитов. Измерение цитохрома P450 3A деятельности на чЭСК полученных гепатоцитов поддерживается в течение 96 ч на стеклах, покрытых PU134 растворенного в различных растворителях. Улучшение в цитохрома деятельности на клетках поддерживается на PU134 покрытием стеклах солюбилизируетс тетрагидрофуране (п = 6). Данные представлены в виде среднего значения ± SD, р <0,05 обозначается *, р <0,01 обозначается **, и р <0,001 обозначается ***, измеряется студентов Т-тест по сравнению с чЭСК полученных гепатоцитов поддерживается на предметные стекла, покрытые PU134 солюбилизированы на тетрагидрофурана. Усы представляют 1 стандартное отклонение.


Фазового контраста изображения Рисунок 4 Оптимизация стерилизации поверхностей, покрытых. (А) или СЭМ изображения (B) не показывают грубые различия в покрытой поверхности PU134 между γ-излучения или УФ-излучения (УФ) лечения. Контрастные изображения Phase были приняты на 40-кратном увеличении и СЭМ-изображениях в 1,664X увеличения. (C) Анализ цитохрома P450 3A деятельности на чЭСК полученных гепатоцитов поддерживается в течение 10 дней на PU134 покрытых стеклах. Увеличение цитохрома P450 3A деятельности в клетках пересевали на γ-излучаемая PU134 покрытием стеклах по сравнению с клетками пересевали на УФ излучается PU134 покрытые стеклянные пластинки. Единицы активности выражали в виде относительных световых единиц (RLU) -1 мл см-2 в культуральной поверхности (N = 3). Данные представлены в виде среднего значения ± SD, р <0,001 яы обозначается *** измеряется студентов Т-тест по сравнению с чЭСК полученных гепатоцитов поддерживается на PU134 покрытием покровные стекла, стерилизованных γ-излучения. Усы представляют 1 стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Первичные антитела
Антиген Тип Компания Разведение
HNF4α Кролик поликлональные Санта-Крус- 1/100
Альбумин Мышиные моноклональные Sigma 1/500
AFP Мышиные моноклональные Abcam 1/500
Цитокератин 19 Мышиные моноклональные Дако 1/50
IgG Мышиные моноклональные Дако 1/500
Вторичные антитела
Анти-кролик 568 Alexa Мука Коза Invitrogen 1/400
Анти-мышь 488 Alexa Мука Кролик Invitrogen 1/500

Таблица 1 Список оптимизированных первичных и вторичных антител и концентрациях, используемых в данном исследовании. HNF4α, гепатоцитов ядерного фактора 4α; АФП, α-фетопротеин; IgG, Иммуноглобулин Г.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Многие из существующих методов, используемых для генерации гепатоциты из стволовых клеток зависят от неопределенных матриц животного происхождения. Эти субстраты могут быть дорогостоящими и весьма неоднородно, затрагивая функции клеток и стабильности, что представляет собой значительное препятствие для применения. Поэтому, мы провели экран для синтетических материалов, которые поддерживают культуру стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Мы определили, простой полиуретан (PU134), образованный в результате полимеризации PHNGAD, MDI и расширитель, который в сочетании с прочной дифференцировки гепатоцитов подхода, стабилизирует фенотип гепатоцитов и улучшает функцию клеток по сравнению с Матригель 15.

Обработка существующих биологических матриц, обычно используемые в культивирования и дифференциации стволовых клеток, таких как витронектином 22 ламинином 521 23 или матригеле, эффективен на короткий срок обслуживания. В противоположность этому, поверхность PU134 покрытием обеспечивают превосходную субстрат для hepatocyТе культуры. Кроме того, оптимизация топографии поверхности и полимерной стерилизации привели к дальнейшему улучшению производительности клеток, ключевой фактор в предоставлении модели печени человека в масштабе с надежной работы.

Природа удлинителя цепи и фенилизоцианата представляет собой один из критических стадий процесса; как устранение или замена любого компонента значительно ухудшить поверхность полимера и поэтому сотовой привязанности и функциональной активности стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Состав полимера влияет на физические параметры, такие как эластичность и смачиваемости 24, который оказывает воздействие на способность полимера абсорбировать ключевых белков внеклеточного матрикса, участвующих в функции гепатоцитов. Кроме того, вариации в катализаторе, время реакции и температура влияют на молекулярно-массовое распределение полимера.

Выбор растворителя для растворения полимера повторнопредставляет другой критической точки в получении оптимизированной с полимерным покрытием поверхности. Мы наблюдали, что природа растворителя влияет на топографию поверхности с покрытием, которая имеет прямые последствия в зависимости от клеток 25-31. Кроме того, время прядения и скорость также имеет решающее значение в получении этой равномерное и однородное покрытие. Еще один шаг, чтобы принять во внимание это процедура стерилизации наносится на поверхность с полимерным покрытием, так как активность клеток может зависеть от используемого стерилизационной обработке. Это может быть связано с наличием чувствительной зоны (зон) в структуре полимера к различным процедурам стерилизации 32-34.

Современные модели стволовых клеток на основе клеток плюрипотентные обладают фенотипические и функциональные ограничения. Мы считаем, что это оптимизированная с полимерным покрытием поверхности представляет собой шаг вперед в области, обходя некоторые ограничения, связанные с использованием биологического SUBSTставки. Кроме того, возможность использования полимера внутри 3D матриц для поддержки крепления различных клеточных типов, найденных в интересующей ткани, могут дополнительно улучшить клеток верность.

В заключение, использование синтетических материалов становится все более важным в оказании человека сомы из плюрипотентных стволовых клеток. Мы разработали оптимизированную процедуру поверхности и покрытия, которая является надежной и надежно обеспечивает функциональные гепатоциты человека приводит к существенным последствиям для основе моделирования клеток и регенеративной медицины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DCH является CSO, директор, основатель и акционер в FibromEd продукции ООО МБ и JPI являются учредителями в FibromEd Продукты Лтд

Acknowledgments

DCH, MB и FK при поддержке одного EPSRC следовать по фонда. BL-V и DS друг были поддержаны MRC PhD studentships. KC поддержали финансирование из Великобритании регенеративной медицины платформы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics