ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה יתמקד בפיתוח משטחים מצופים פולימר לטווח ארוך, תרבות היציבה של תאי גזע המופקת hepatocytes האנושי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

חומרים ביולוגיים היו בשימוש נרחב בתחזוקה וההתמיינות של תאי גזע pluripotent 1. תוך שהוא מאפשר, מצעים ביולוגיים אלה לעתים קרובות מכילים מספר עצום של מרכיבים בלתי מוגדרים. Matrigel הוא מצע נפוץ לתרבית תאי גזע ובידול. לרוע המזל, ההרכב משתנה משפיע על תפקוד תא ופנוטיפ. למרות מגוון רחב של מטריצות חלופיות, מוגדרות יותר ביולוגיות היה בשימוש 2-7, מן החי או מן מדרגיות עניים שלהם הופכת אותם למועמדים שאינם מתאימים לייצור תעשייתי. לכן זיהוי של חלופות סינתטיות, עם הרכב מוגדר וביצועים אמין, הן מטרות מרכזיות במחקר בתאי גזע.

בניסיון להתגבר על המגבלות של מצעי תרבית תאים לא מוגדרים, שיתופי פעולה בין תחומיים בין הכימיה והביולוגיה זיהו חומרים סינטטיים עם היכולת לתמוך בפנוטיפ תא. Synthמצעי etic הם ניתנים להרחבה, חסכוניים, ויכולים להיות מיוצרים לתוך מבנים מורכבים 3D, מחקה את סביבת in vivo. בשל מאפיינים אלה מצעים סינטטיים היו בשימוש נרחב כדי לתמוך ולהוביל בידול של סוגי תאים רבים 8-10.

מבחני תפוקה מתקדמים וגבוהים הקלו סינון המהיר של חומרים סינטטיים, מספריות גדולות, ונמסרו חומרים חדשים בעלי תכונות גמישות עם יישומים רחבים במחקר ופיתוח ביו 11-13. ניצול תפוקה גבוהה, טכנולוגית הקרנת מיקרו מערך פולימר, אנו במהירות זיהינו פוליאוריטן פשוט (PU134), מתאים לתחזוקה של תאים כבדים בתאי גזע אנושיים נגזרים. פולימר זה נמצא להיות עדיף על מצעים מן החי בנוגע לבידול hepatocyte ותפקוד 14-16. לאחר מכן יש לנו אופטימיזציה תהליך תנאי ציפוי, הטופוגרפיה ועיקור כדי לגשת להשפעותעל ביצועי פולימרים בייצוב תפקוד הפטוציט ותוחלת חיים. יש לכך השלכות משמעותיות בכל קשור להבנת יסודות הביולוגיה הפטוציט לדוגמנות תא מבוססת ויישומי רפואה רגנרטיבית.

הטכנולוגיה שתוארה כאן מייצגת דוגמא לאופן שעל פני השטח של פולימר סינטטי יכול להיות מותאמים כדי לשמר את הפנוטיפ של תאים. אנו מאמינים כי שילוב של טכנולוגיה זו עם פרוטוקול בידול hepatocyte סרום ללא יעיל יש את הפוטנציאל לספק ייצור להרחבה של תאים כבדים לשימוש במודלים במבחנה ורפואת רגנרטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 סינתזה של PHNGAD (פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) חומצת -alt-adipic] דיאול)

תכנית 1

1 תכנית: סינתזה של PHNAGD ייצוג סכמטי של הסינתזה של PHNAGD.. PHNAGD הוכן על ידי התגובה של 1,6-Hexanodiol, גליקול דיאטילן, גליקול neoppentyl וחומצת adipic. PHNAGD, פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) החומצה -alt-adipic] דיאול.

  1. החל טיפול בחום למונומרים 1,6-hexanediol, di (אתילן גליקול) וגליקול neopentyl ב40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעה בתנור ואקום כדי להסיר כל שאריות מים. לאפשר לקור עד לRT תחת ואקום.
  2. הוספת 22 mmol של כל מונומר וחומצת adipic (55 mmol) לבקבוק תחתון עגול שני צוואר מצויד בבר עורר ומחובר למנגנון דיקן-סטארק.
  3. מניחים את כל ההרכבה תחת ואקום ובעדינות לחמם את glassware בC ° 40 ל6 שעות, כדי להימנע מכל ספיגת לחות במהלך התוספת של החומר הכימי לתוך הבקבוק.
  4. הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפה, 0.0055 mol של טיטניום הזרז (IV) butoxide.
  5. מערבבים את תערובת התגובה ב180 ° C, תחת אווירת N 2 ל24 שעות, ולאסוף שאריות מים במלכודת הדיקן-סטארק. אפשר למוצר להתקרר לRT.

.2 סינתזה של PU134

תכנית 2

תכנית 2: סינתזה של PU134 ייצוג סכמטי של הסינתזה של פוליאוריטן 134. PU134 הוכנה על ידי התגובה של 1.0 equiv של PHNGAD עם 2.0 equiv של 4,4'-Methylenebis (isocyanate פניל), ואחריו התוספת של 1.0. equiv של מאריך שרשרת 1,4-butanediol.

  1. מערבבים מקבילה של PHNGAD polyol אחד (Mn ~ 1,800 Da, 3.2 mmol) עם שני שווה של 4"4-Methylenebis (isocyanate פניל) (6.4 מילימול) בN נטול מים, N -Dimethylformamide (12 מ"ל).
  2. מערבבים את תערובת התגובה על 70 מעלות צלזיוס, תחת אווירת N 2.
  3. הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפת טיטניום הזרז butoxide (WT 0.8%) (IV).
  4. אחרי שעה 1, להוסיף שווה ערך אחד מאריך שרשרת 1,4-butanediol (3.2 מילימול). להעלות את הטמפרטורה ב90 ° C ומערבבים ל24 שעות תחת אווירת N 2.
  5. בעקבות התגובה, לאסוף פוליאוריטן על ידי משקעים על ידי הוספת אתר diethyl (הקסאן או מים יכולים לשמש גם) שחרר חכם לפתרון התגובה עד הממטרים מתרחש.
  6. צנטריפוגה הפתרון ב5,300 XG למשך 5 דקות.
  7. למזוג supernatant ולהתנגב ב40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום עד מתאדה הממס.
    שים לב: על מנת להבטיח כי המוצר הסופי של התגובה יש את הפרמטרים הנכונים בנוגע לחלוקת המשקל המולקולרית, grou הפונקציונליps של הפולימר, וטמפרטורת ההיתוך והמעבר זכוכית, ניתן להשתמש בטכניקות אנליטיות שונות ושיטות, כגון כרומטוגרפיה חלחול ג'ל או ספקטרוסקופיה פיטר.

.3 הכנת פתרונות PU134

  1. שוקל 200 מ"ג של PU134 לתוך בקבוק זכוכית.
  2. לדלל PU134 לריכוז סופי של 2% במספר הממסים: כלורופורם, שילוב של כלורופורם וטולואן ב1: 1, tetrahydrofuran, ושילוב של tetrahydrofuran וdicloromethane ב1: 1.
    הערה: בחירתו של הממס הנכון משתנה בהתאם לפולימר לשימוש. ממסים שונים יש נקודות רתיחה שונות שיכול להשפיע על solubilization של הפולימר.
  3. לנער את הפתרון נמרצות ל20 דקות ב RT באמצעות שייקר במהירות של 200 mot / דקה, עד שהפתרון הופך הומוגנית ולא משקע הוא ציין.

.4 ציפוי של זכוכית שקופיות עם PU134

  1. הנח ROU15 מ"מ 2 coverslip nd על coater הספין.
  2. החל 50 μl של פתרון PU134 לכל באמצעות פיפטה. כוון את עוצמת הקול של פתרון PU134 בהתאם לגודל coverslip נדרש שמירה על הנפח על פני השטח יחסי יחס.
  3. ספין כל coverslip ל7 שניות ב23 x גרם.
  4. coverslip האוויר היבש ב RT לפחות 24 שעות לפני העיקור.

.5 הקרנה של Coverslip

  1. Gamma-להקרין coverslip מצופה פולימר על ידי יישום מינון של 10 אפורים באמצעות irradiator מעבדה ל12 דקות.
  2. UV- להקרין coverslip מצופה פולימר באמצעות 30 W, הנורה UV ל16 דקות מכל צד.
  3. מקום coverslip מצופה הפולימר בצלחת תרבית הרקמה מתאימה בהתאם לגודל השקופית.

.6 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק

  1. coverslip זהב מעיל פולימר על ידי מקרטעות ל200 שניות באווירה של 5 x 10 -1 מיליבר של לחץ.
  2. ללכוד את micrographs של coverslip מצופה הפולימר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק במתח מאיץ של 20 ק במצב שני אלקטרונים הדמיה.

.7 תצפיות מיקרוסקופית כוח האטומי

  1. לסרוק שטח של 20 x 20 מיקרומטר של משטח הפולימר.
  2. הגדר את קצב סריקה מ1.32 הרץ ל1.60 הרץ.
  3. הגדר את רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים באזור שנסרק.
  4. לחשב את שורש ממוצע ריבוע (RMS או RQ) של הציפוי על ידי שימוש בממוצע של סטיות גובה נלקחו ממטוס נתוני תמונה הממוצע, הביע כ:

    איפה זי הוא ערך Z הנוכחי, וN הוא מספר הנקודות בתוך השטח נתון.
  5. 7.5 חשב את הסטייה או מתכוון חספוס פני השטח (Ra) של התמונה באמצעות,

    כאשר Z (x) היא הפונקציה שמתארת ​​tהוא משטח הפרופיל מנותח במונחים של גובה (Z) ומיקום (x) של המדגם על פני אורך ההערכה "L". Ra מייצג את הערך הממוצע של פני השטח ביחס למישור המרכז.

.8 תרבות והתמיינות של תאים

  1. תרבות ולבדל את שורת תאי גזע עוברית (hESC) H9 האנושי כפי שמתואר בHay 17.
  2. לנתק את התאים באמצעות מגיב ניתוק וreplate על גבי שקופיות מצופים PU134 ביום 9 של תהליך ההתמיינות, בנוכחותו של מדיום סרום ללא כלתאר בSzkolnicka 18,19.
    הערה: השימוש בתא דיסוציאציה האנזימטית הוא מועדף לניתוק תא פיזי.

.9 ציטוכרום P450 Assay פונקציונלי

  1. למדוד את פעילות CYP3A הבאה הוראות היצרן.
  2. דגירה hepatocytes hESC נגזר ביום 13 או יום 19, ותקשורת ללא תאים - כביקורת שלילית, עם substr המתאיםאכלתי במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאסוף supernatants מהתאים ותקשורת, לבצע את assay לפי הוראות יצרן.
  4. מדוד את רמת פעילות CYP והיחסי מנורמלים לשטח הפנים (2 סנטימטר).

10. Immunostaining

  1. לשטוף hESC נגזר hepatocytes עם PBS, 1 דקות, חוזר שתי פעמים.
  2. הוספת מתנול קרח קר 100% לתקן תאים, מקום ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות וחזור פעמיים.
  4. דגירה תאים עם PBS / BSA / 10% עבור שעה 1 ב RT T (tween 0.1%).
  5. לשאוב את פתרון PBST ולהוסיף הנוגדן הראשוני המתאים מדולל PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם O תסיסה עדין / N.
  6. שטוף תאים עם PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%) במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים.
  7. לדלל את הנוגדן המתאים בPBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), להוסיף לתאי דגירה בחושך בRT עבור שעה 1 עם תסיסה עדינה.
  8. שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים.
  9. הוספת Mowiol 488 (המכיל 1 DAPI: 1,000) זה טוב, להוסיף coverslip בעדינות כדי להפחית את מספר בועות אוויר. חנות קבועה תאים על 4 מעלות צלזיוס בחושך. שים לב מכתים באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורת ניאון. הנוגדנים ראשוניים ומשניים המותאמים מופיעים בטבלה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ממס פולימר משפיע על הטופוגרפיה של פני השטח מצופה פולימר

פוליאוריתן 134 היה solubilized בכלורופורם, לבד או בשילוב עם טולואן או tetrahydrofuran או dichloromethane ושקופיות זכוכית ספין מצופות בניסוחים השונים. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שמשו לאפיין את התכונות הפיסיקליות של חומרי ציפוי הפולימר (איור 1). הציפוי שהושג באמצעות טולואן או כלורופורם לא היה הומוגנית, מדגים ציפוי אחיד עם הממטרים PU134 (איור 1 א). בניגוד לכך, tetrahydrofuran היה ממס מתאים המאפשר ציפוי הספין של הרבה יותר אחיד פני השטח (איור 1 א). טופוגרפיה משטח נמדדה על ידי AFM באמצעות שורש הממוצע והחספוס רבועים (RMS) הממוצע (Ra). PU134 tetrahydrofuran המומס הציג ירידה של 40% בחספוס בהשוואה לthממסים דואר אחרים (איור 1 ו1C). נתונים אלה מראים כי השימוש בtetrahydrofuran כממס מספק ציפוי אחיד יותר של PU134 ליישום ביולוגי.

יש טופוגרפיה פולימר השפעה משמעותית על תפקוד הפטוציט

hESC יכול להיות מובחן ביעילות להאנדודרם כבד במבחנה, מציג רב של הפונקציות הנמצאות בכבד המבוגר 17-20. בידול האנדודרם בדיה היה מושרה וביום 9 תאים כמו hepatoblast-ניכרו, עם רוב של תאים לבטא cytokeratin 19 (99% ± 1.2), α-חלבון עוברי (99% ± 0.6), ו4α גורם גרעיני כבד (97% ± 2.6); ורמות נמוכות של אלבומין (20% ± 1.7) (איור 2). בשלב זה התאים היו מנותקים באמצעות TrypLE להביע וreplated על גבי המשטחים מצופים פולימר השונים. כמדד לתפקוד מטבולים, f ציטוכרום P450משיחה הוערכה 4 ימים לאחר replating-. אנו נצפו עלייה של פי 2 בפעילות חילוף חומרים בתאי replated על tetrahydrofuran / משטחי PU134 מצופים (איור 3). תוצאות אלו מראות כי פעילות המטבולית hESC נגזרת הפטוציט משופרת עם ציפוי אחיד יותר של PU134, זה עולה בקנה אחד עם גישות קודמות 21.

השפעות עיקור וציור על המאפיינים ביו של הפולימר

ההשפעה של עיקור על ביצועי PU134 נחקרה גם. שקופיות זכוכית מצופים פולימר נחשפו לקרינת UV או קרינת גמא. הדמיה בניגוד שלב של שקופיות זכוכית PU134 מצופים לא הראתה הבדלי ברוטו לפרסם UV או קרינת גמא (איור 4 א). תצפיות אלה אושרו עוד יותר על ידי ניתוח SEM (איור 4). הביצועים הביולוגיים של PU134 נבדקו באמצעות hepatocytes hESC נגזר ב10 ימים לאחר replating-. hESC נגזרhepatocytes replated על שקופיות זכוכית PU134 מצופות הקרין γ מוצג עלייה של פי 3 בפעילות CYP3A על תאי replated בשקופיות-הקרין UV PU134 מצופים זכוכית (איור 4C). תצפיות אלה הראו, כי גמא קרינה הייתה טכניקת העיקור האופטימלית למטרות שלנו.

איור 1
איור 1 אופטימיזציה של המשטח המצופה פוליאוריטן 134. שקופיות () זכוכית היו מכוסות בפתרון 2% מPU134 מומס בממסים שונים. סריקת תמונות מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) של שקופיות זכוכית מצופים השונות להראות הנוכחות של משטח מצופה הומוגנית והעדר הפולימר שוקע כאשר tetrahydrofuran שימש לעומת טולואן, כלורופורם או תערובות של הממסים (שחור וחצים לבנים). התמונות צולמו בהגדלה x1664 וסולמות ברים ar דואר שמוצג להלן התמונות. (BC) מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) הועסק לנתח את החספוס של משטחי PU134 המצופים בממסים שנבחרו. ניתוח של RMS הפרמטרים חספוס (השורש הממוצע רבוע) (ב) ורא (החספוס הממוצע) (ג) למשטחי PU134 המצופים השונים מראה כי הציפוי שהושג על ידי שימוש בtetrahydrofuran כממס היה המשטח החלק ביותר בהשוואה ל שאר התנאים (n = 7). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן, p <0.05 הוא כונה *, p <0.01 הוא כונה **, וp <0.001 הוא כונה ***, שנמדד על ידי סטודנטים מבחן t בהשוואה לשקופיות מצופות PU134 solubilized בtetrahydrofuran. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ays "> איור 2
אפיון דמות 2 של hepatoblasts hESC נגזר. ביטוי מראה Immunocytochemistry של סמנים כבדי AFP, CK19, HNF4α ואלבומין בhESC (H9) נגזר האנדודרם כבד. בקרות שליליות בוצעו עם אימונוגלובולינים המקביל G (IgG) ותמונות נציג מוצגות. אחוז התאים החיוביים וסטיית תקן נאמד מלפחות חמישה שדות אקראיים מבט המכילים לפחות 300 תאים לכל תצוגה. התמונות צולמו בהגדלה 20X. נתונים מבוטאים ממוצע ± סטיית תקן שגיאת ברים מייצגים 1 סטיית תקן. HNF4α, הפטוציט 4α גורם גרעיני; AFP, α-חלבון עוברי; ALB, אלבומין; CK19, cytokeratin 19, עז IgG, אנטי עז Immunoglobulin G, IgG עכבר, אנטי עכבר Immunoglobulin G. אנא לחץ כאן לצפייה בversi גדולה יותר על של נתון זה.

איור 3
איור 3 השלכות תפקודיות של הטופוגרפיה של פני השטח PU134 המצופים על התפקוד של תאים כבדים hESC נגזרים. מדידה של פעילות ציטוכרום P450 3A בתאים הכבדים שמקורם בhESC נשמרה במשך 96 שעה על שקופיות זכוכית מצופים בPU134 מומס בממסים שונים. שיפור בפעילות ציטוכרום על תאים נשמרו בשקופיות זכוכית מצופה PU134 solubilized עם tetrahydrofuran (n = 6). הנתונים באים לידי ביטוי כ± SD, עמ 'ממוצע <0.05 הוא כונה *, p <0.01 הוא כונה **, וp <0.001 הוא כונה ***, שנמדד על ידי סטודנטים מבחן t בהשוואה לתאים כבדים hESC נגזרו נשמרו בשקופיות מצופות PU134 solubilized על tetrahydrofuran. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן 1.

together.within-page = "תמיד"> איור 4
איור 4 אופטימיזציה של העיקור של המשטחים המצופים. בניגוד שלב תמונות () או תמונות SEM (ב) אינם מלמדים על הבדלים גולמי במשטח המצופה PU134 בין γ-קרינה או קרינת UV (UV) טיפולים. בניגוד שלב תמונות צולמו בתמונות בהגדלת 40X וSEM בהגדלה 1,664X. ניתוח (C) של פעילות 3A ציטוכרום P450 על hepatocytes נגזר hESC נשמרה במשך 10 ימים בשקופיות זכוכית PU134 מצופים. עלייה בפעילות 3A ציטוכרום P450 בתאי replated על שקופיות זכוכית PU134 מצופים-הקרין γ בהשוואה לתאי replated על UV הקרינה שקופיות זכוכית PU134 מצופים. יחידות של הפעילות באות לידי ביטוי כיחידות ביחס אור (RLU) מ"ל -1 סנטימטר -2 של משטח התרבות (n = 3). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן, p <0.001 is מצוין *** נמדד על ידי סטודנטים מבחן t בהשוואה לתאים כבדים hESC נגזרים שמרו על coverslips זכוכית PU134 המצופה מעוקר על ידי γ-קרינה. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נוגדנים ראשוניים
Antigen סוג חברה דילול
HNF4α ארנב polyclonal סנטה קרוז 1/100
אלבומין חד שבטי עכבר Sigma 1/500
AFP חד שבטי עכבר Abcam 1/500
Cytokeratin 19 חד שבטי עכבר Dako 1/50
IgG חד שבטי עכבר Dako 1/500
נוגדנים משני
נגד ארנב 568 Alexa קמח עז Invitrogen 1/400
אנטי עכבר 488 Alexa קמח ארנב Invitrogen 1/500

רשימת .1 טבלה של נוגדנים מותאמים ראשוניים ומשניים וריכוזים ששמשו במחקר זה. HNF4α, הפטוציט 4α גורם גרעיני; AFP, α-חלבון עוברי; IgG, Immunoglobulin G.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רבים מהשיטות הנוכחיות משמשות ליצירת תאים כבדים מתאי גזע להסתמך על מטריצות מוגדרות מן החי. מצעים אלה יכולים להיות יקרים ומשתנים מאוד, המשפיעים על תפקוד תא ויציבות, המייצג חסם משמעותי ליישום. לכן, ביצענו מסך לחומרים סינטטיים התומכים בתרבות של תאים כבדים שמקורן בתאי גזע. אנו זיהינו, פוליאוריטן פשוט (PU134), שהוקם על ידי polymerizing PHNGAD, MDI ומאריך, שבשילוב עם גישת בידול hepatocyte חזקה, מייצב את הפנוטיפ הפטוציט ומשפר את תפקוד תא בהשוואה לmatrigel 15.

הטיפול בתאי גזע קיימים מטריצות ביולוגיות, שימוש נפוץ בculturing והבחנה כגון vitronectin 22, laminin 521 23 או matrigel, הוא יעיל לתחזוקה לטווח קצרה. בניגוד לכך, משטחי PU134 מצופים לספק מצע מעולה לhepatocyתרבות te. יתר על כן, לאופטימיזציה של טופוגרפיה משטח ועיקור פולימר הובילה לשיפורים נוספים בביצועי תא, גורם מרכזי באספקת דגמי כבד אנושיים בקנה המידה עם ביצועים אמינים.

טבעו של מאריך השרשרת וisocyanate פניל ​​מייצג את אחד השלבים הקריטיים בתהליך; כחיסול או החלפה של רכיב או יפגע במשטח הפולימרים באופן משמעותי ולכן קובץ מצורף הסלולרי ופעילות פונקציונלית של תאים כבדים שמקורן בתאי גזע. ההרכב של הפולימר משפיע על פרמטרים פיזיים כגון גמישות ויכולת רטיבות 24, שבו יש השפעות הקיבולת של הפולימר לספוג חלבוני מטריצה ​​תאית מפתח מעורב בתפקוד הפטוציט. בנוסף, שינויים בזרז, זמן תגובה וטמפרטורה משפיעים על חלוקת המשקל המולקולרית של הפולימר.

הבחירה של הממס לsolubilize הפולימר מחדשמציג עוד נקודה קריטית בקבלה של משטח מצופה פולימר מותאם. ראינו כי הטבע של הממס משפיע על הטופוגרפיה של פני השטח המצופה, אשר יש לה השלכות ישירות בתפקוד של התאים 25-31. בנוסף, הזמן מסתובב ומהירות הם קריטיים גם בקבלת ציפוי אחיד והומוגנית זו. צעד נוסף שיש לקחת בחשבון הוא הליך העיקור מיושם על פני השטח מצופה פולימר, כפעילות של התאים יכולה להיות מושפעת על ידי טיפול העיקור בשימוש. זה יכול להיות בגלל הנוכחות של אזור רגיש (ים) בתוך המבנה של הפולימר לנהלי עיקור השונים 32-34.

דגמים הנוכחיים pluripotent תאי גזע מבוסס תאים בעלי פנוטיפ ומגבלות תפקודיות. אנו מאמינים כי פולימר מותאם זה מצופה משטח מייצג מראש בתחום, עקיפת חלק מהמגבלות הקשורים לשימוש של subst הביולוגישיעורים. יתר על כן, האפשרות של שימוש בפולימר בתוך 3D מטריצות לתמוך בקובץ המצורף סלולריים מסוגים שונים הנמצאים ברקמות של עניין של, עשוי לשפר עוד יותר את איכות תא.

לסיכום, השימוש בחומרים סינטטיים הופך חשוב יותר ויותר במסירה של סומה האנושית מתאי גזע pluripotent. פיתחנו הליך פני השטח וציפוי מותאם שהוא חזק ואמין מספק hepatocytes האנושי פונקציונלי עם השלכות משמעותיות על מודלים מבוססים תא ורפואת רגנרטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DCH הוא CSO, מנהל, מייסד ובעל מניות בFibromEd המוצרים בע"מ MB וJPI הם בעלי מניות מייסד בFibromEd מוצרים בע"מ

Acknowledgments

DCH, MB וFK נתמכו על ידי מעקב EPSRC על קרן. BL-V וDS היו כל נתמך על ידי תעודת סטודנט לתואר שלישי MRC. KC נתמכה על ידי מימון מבריטניה רפואת רגנרטיבית הפלטפורמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics