अनुकूलित सिंथेटिक सतहों hepatocellular Phenotype का प्रयोग स्थिर

Chemistry

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Summary

यह लेख लंबी अवधि के लिए बहुलक लेपित सतहों के विकास पर ध्यान दिया जाएगा, स्टेम सेल के स्थिर संस्कृति मानव hepatocytes निकाली गई.

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Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

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Abstract

Introduction

जैविक सामग्री व्यापक रूप से pluripotent स्टेम सेल 1 के रखरखाव और भेदभाव में इस्तेमाल किया गया है. सक्षम करते हुए, इन जैविक substrates अक्सर अपरिभाषित घटकों के असंख्य होते हैं. Matrigel स्टेम सेल संस्कृति और भेदभाव के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया सब्सट्रेट है. दुर्भाग्य से, अपने चर रचना सेल समारोह और फेनोटाइप को प्रभावित करती है. वैकल्पिक, अधिक परिभाषित जैविक matrices की एक किस्म 2-7 इस्तेमाल किया गया है, उनके जानवर मूल या गरीब scalability उन्हें औद्योगिक निर्माण के लिए अनुपयुक्त उम्मीदवारों बनाता है. इसलिए, स्टेम सेल अनुसंधान में महत्वपूर्ण लक्ष्यों को परिभाषित संरचना और विश्वसनीय प्रदर्शन के साथ सिंथेटिक विकल्पों की पहचान कर रहे हैं.

अपरिभाषित सेल संस्कृति substrates की सीमाओं को पार करने की कोशिश में, रसायन शास्त्र और जीव विज्ञान के बीच अंतःविषय सहयोग सेल phenotype का समर्थन करने की क्षमता के साथ सिंथेटिक सामग्री की पहचान की है. सिंथेटिक्सetic substrates, प्रभावी स्केलेबल लागत रहे हैं, और इन विवो वातावरण नकल उतार, जटिल 3D संरचनाओं में निर्मित किया जा सकता. कारण इन गुणों के लिए सिंथेटिक substrates व्यापक रूप से कई प्रकार की कोशिकाओं में 8-10 के भेदभाव का समर्थन और ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

विकसित और उच्च throughput assays के बड़े पुस्तकालयों से, सिंथेटिक सामग्री की तेजी से जांच में मदद की, और जैव चिकित्सा अनुसंधान और विकास 11-13 में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ लचीला गुणों के साथ उपन्यास सामग्री को जन्म दिया है. उच्च throughput, बहुलक सूक्ष्म सरणी स्क्रीनिंग तकनीक का उपयोग, हम तेजी से मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स के रखरखाव के लिए उपयुक्त एक सरल polyurethane (PU134), की पहचान की. इस बहुलक hepatocyte भेदभाव और समारोह 14-16 के संबंध में पशु व्युत्पन्न substrates के लिए बेहतर हो पाया था. हम बाद में प्रभाव का उपयोग करने के लिए कोटिंग की स्थिति, स्थलाकृति और नसबंदी प्रक्रिया अनुकूलित हैhepatocyte समारोह और उम्र स्थिर में बहुलक प्रदर्शन पर. इस सेल आधारित मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए hepatocyte जीव विज्ञान की बुनियादी बातों को समझने के संबंध में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.

यहाँ वर्णित प्रौद्योगिकी एक सिंथेटिक बहुलक की सतह सेल phenotype संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है. हम एक कुशल सीरम मुक्त hepatocyte भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ इस तकनीक के संयोजन में इन विट्रो मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग के लिए hepatocytes की एक स्केलेबल उत्पादन प्रदान करने की क्षमता है कि विश्वास करते हैं.

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Protocol

PHNGAD (पाली [1,6-hexanodiol / neopentyl ग्लाइकोल / डि (इथाइलीन ग्लाइकॉल) -alt-वसीय अम्ल] diol) की 1 संश्लेषण

योजना 1

योजना 1: PHNAGD का संश्लेषण PHNAGD के संश्लेषण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.. PHNAGD 1,6-Hexanodiol की प्रतिक्रिया, Diethylene ग्लाइकोल, neoppentyl ग्लाइकोल और वसीय अम्ल द्वारा तैयार किया गया था. PHNAGD, पाली [1,6-hexanodiol / neopentyl ग्लाइकोल / डि (इथाइलीन ग्लाइकॉल) -alt-वसीय अम्ल] diol.

  1. किसी भी अवशिष्ट पानी को निकालने के लिए एक वैक्यूम ओवन में 48 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर monomers 1,6-hexanediol, डि (इथाइलीन ग्लाइकॉल) और neopentyl ग्लाइकोल को गर्मी उपचार लागू करें. वैक्यूम के अंतर्गत आर टी करने के लिए नीचे ठंडा करने की अनुमति दें.
  2. एक डीन-स्टार्क तंत्र के लिए एक उभारा बार से लैस और जुड़े एक दो गर्दन दौर नीचे कुप्पी के लिए प्रत्येक monomer और वसीय अम्ल (55 mmol) की 22 mmol जोड़ें.
  3. एक वैक्यूम के तहत पूरे विधानसभा प्लेस और धीरे GLA गर्मीफ्लास्क में रसायन के अलावा दौरान किसी भी नमी अवशोषण से बचने के क्रम में 6 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस, पर ssware.
  4. , ड्रॉप द्वारा उत्प्रेरक टाइटेनियम (चतुर्थ) butoxide की .0055 मोल ड्रॉप, सिरिंज के माध्यम से जोड़ें.
  5. 24 घंटे के लिए एक एन 2 वातावरण के तहत 180 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण, हलचल, और डीन-स्टार्क जाल में अवशिष्ट पानी इकट्ठा. उत्पाद आरटी को शांत करने के लिए अनुमति दें.

PU134 के 2 संश्लेषण

योजना 2

योजना 2: PU134 के संश्लेषण PU134 एक 4,4'-METHYLENEBIS (फिनाइल आइसोसाइनेट) के 2.0 equiv साथ एक PHNGAD 1.0 equiv की प्रतिक्रिया से तैयार किया गया था polyurethane 134 के संश्लेषण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, 1.0 के अलावा द्वारा पीछा किया. एक 1,4 butanediol श्रृंखला बढ़ाने की equiv.

  1. 4 के दो समकक्ष के साथ polyol PHNGAD के एक बराबर (करोड़ ~ 1,800 दा, 3.2 mmol) मिक्सनिर्जल एन में '4-METHYLENEBIS (फिनाइल आइसोसाइनेट) (6.4 mmol), एन -Dimethylformamide (12 मिलीग्राम).
  2. एक एन 2 वातावरण के तहत 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण, हिलाओ.
  3. , सिरिंज के माध्यम से जोड़ें उत्प्रेरक टाइटेनियम ड्रॉप द्वारा ड्रॉप (चतुर्थ) butoxide (0.8% WT).
  4. 1 घंटे बाद, चेन भरनेवाला 1,4 butanediol (3.2 mmol) के एक बराबर जोड़ें. 90 डिग्री सेल्सियस तापमान में वृद्धि और एक एन 2 वातावरण के तहत 24 घंटे के लिए हलचल.
  5. प्रतिक्रिया के बाद, वर्षा होती है जब तक प्रतिक्रिया समाधान में बुद्धिमान ड्रॉप (भी इस्तेमाल किया जा सकता हेक्सेन या पानी) Diethyl ईथर जोड़कर तेज़ी से polyurethane इकट्ठा.
  6. 5 मिनट के लिए 5300 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र.
  7. सतह पर तैरनेवाला छानना और विलायक उड तक एक वैक्यूम ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर बंद सूखी.
    नोट: आदेश में प्रतिक्रिया की अंतिम उत्पाद आणविक वजन वितरण के संबंध में सही मापदंडों के अधिकारी यह सुनिश्चित करने के लिए, कार्यात्मक चल मैदानबहुलक, और पिघलने और कांच संक्रमण तापमान के पी एस, विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों और विधियों जैसे जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी या फितर स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

PU134 समाधान के 3 तैयारी

  1. एक कांच की बोतल में PU134 की 200 मिलीग्राम वजन.
  2. क्लोरोफॉर्म, 1 में क्लोरोफॉर्म और टोल्यूनि का एक संयोजन: एक विलायकों की संख्या में 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए PU134 पतला 1 अनुपात, tetrahydrofuran, और संयोजन 1 में tetrahydrofuran और dicloromethane की: 1 अनुपात.
    नोट: सही विलायक के चुनाव का उपयोग करने के लिए बहुलक पर निर्भर करता है. विभिन्न सॉल्वैंट्स बहुलक की solubilization प्रभावित कर सकते हैं कि विभिन्न क्वथनांक अधिकारी.
  3. समाधान सजातीय हो जाता है और कोई वेग मनाया जाता है जब तक, 200 चुटकुला / मिनट की गति से एक प्रकार के बरतन का उपयोग आरटी पर सख्ती 20 मिनट के लिए समाधान हिला.

PU134 साथ गिलास स्लाइड के 4 कोटिंग

  1. एक rou रखेंस्पिन coater पर एन डी 15 मिमी 2 coverslip.
  2. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए प्रत्येक PU134 समाधान के 50 μl लागू करें. अनुपात आनुपातिक सतह मात्रा रखने के लिए आवश्यक coverslip आकार के लिए तदनुसार PU134 समाधान की मात्रा समायोजित करें.
  3. 23 x जी पर 7 सेकंड के लिए प्रत्येक coverslip स्पिन.
  4. नसबंदी से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए आरटी पर शुष्क हवा coverslip.

Coverslip के 5 किरणन

  1. 12 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला irradiator का उपयोग कर 10 Grays की एक खुराक लगाने से बहुलक लेपित coverslip गामा चमकाना.
  2. 16 मिनट प्रत्येक पक्ष के लिए एक 30 डब्ल्यू, यूवी बल्ब का उपयोग बहुलक लेपित coverslip चमकाना यूवी.
  3. स्लाइड आकार के अनुसार एक उपयुक्त टिशू कल्चर प्लेट में बहुलक लेपित coverslip जगह.

6 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. दबाव के 5 एक्स 10 -1 मिलीबार के माहौल में 200 सेकंड के लिए sputtering द्वारा गोल्ड कोट बहुलक coverslip.
  2. Microg कब्जामाध्यमिक इलेक्ट्रॉन इमेजिंग मोड में 20 केवी का एक त्वरक वोल्टेज में एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग बहुलक लेपित coverslip के raphs.

7 परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों

  1. बहुलक सतह से 20 x 20 माइक्रोन के एक क्षेत्र को स्कैन करें.
  2. 1.32 हर्ट्ज से 1.60 हर्ट्ज के लिए एक स्कैन दर निर्धारित करें.
  3. स्कैन किए गए क्षेत्र में 512 x 512 पिक्सल के एक संकल्प के सेट करें.
  4. जड़ मतलब छवि डेटा विमान से ली ऊंचाई विचलन का औसत उपयोग करके कोटिंग के वर्ग (आरएमएस या RQ) मतलब की गणना, के रूप में व्यक्त किया:

    कहां जि वर्तमान जेड मूल्य है, और एन दिए गए क्षेत्र के भीतर अंकों की संख्या है.
  5. का उपयोग कर छवि के 7.5 विचलन की गणना या सतह खुरदरापन मतलब (आरए),

    कहां जेड (एक्स) टी का वर्णन है कि समारोह हैवह ऊंचाई (जेड) और मूल्यांकन की लंबाई 'एल' से अधिक नमूने की स्थिति (एक्स) के संदर्भ में विश्लेषण प्रोफ़ाइल सतह. रा केन्द्र विमान को सतह रिश्तेदार का मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है.

8 सेल संस्कृति और भेदभाव

  1. संस्कृति और घास 17 में वर्णित के रूप में मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन (hESC) H9 अलग.
  2. एक हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग कोशिकाओं को अलग करें और Szkolnicka 18,19 में वर्णन के रूप में एक सीरम मुक्त माध्यम की उपस्थिति में, भेदभाव प्रक्रिया के 9 दिन में PU134 लेपित स्लाइड पर उन्हें replate.
    नोट: एक enzymatic सेल हदबंदी का उपयोग भौतिक सेल टुकड़ी को पसंद किया जाता है.

9 साइटोक्रोम P450 कार्यात्मक परख

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन CYP3A गतिविधि को मापने.
  2. कोशिकाओं के बिना hESC व्युत्पन्न 13 दिन या 19 दिवस में hepatocytes, और मीडिया को सेते हैं - एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, उचित substr साथ37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए खा लिया.
  3. , कोशिकाओं और मीडिया से supernatants लीजिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख ले.
  4. सतह क्षेत्र (2 सेमी) करने के लिए CYP गतिविधि और सामान्यीकृत रिश्तेदार के स्तर को मापने.

10 Immunostaining

  1. धो hESC 1 मिनट के लिए, पीबीएस के साथ हेपाटोसाइट्स व्युत्पन्न, दो बार दोहराएँ.
  2. 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में बर्फ के ठंडे 100% कोशिकाओं को ठीक करने के लिए मेथनॉल, जगह जोड़ें.
  3. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और दो बार दोहराएँ.
  4. पीबीएस / टी (0.1% के बीच) आरटी पर 1 घंटे के लिए / 10% BSA के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  5. PBST समाधान Aspirate और पीबीएस / टी (0.1% के बीच) / 1% BSA में पतला उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने, कोमल आंदोलन ओ / एन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. 5 मिनट के लिए पीबीएस / टी (0.1% के बीच) / 1% BSA के साथ कोशिकाओं को धो लें और तीन बार दोहराएँ.
  7. , पीबीएस / टी (0.1% के बीच) / 1% BSA में उपयुक्त एंटीबॉडी पतला कोशिकाओं को जोड़ने और कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते.
  8. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और तीन बार दोहराएँ.
  9. , अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए हवाई बुलबुले की संख्या को कम करने के लिए धीरे एक coverslip जोड़ें: (1,000 DAPI 1 युक्त) Mowiol 488 जोड़ें. स्टोर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं तय की. उपयुक्त फिल्टर और फ्लोरोसेंट लैंप के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग धुंधला निरीक्षण. अनुकूलित प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.

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Representative Results

पॉलिमर विलायक बहुलक लेपित सतह की स्थलाकृति को प्रभावित करती है

Polyurethane 134 अकेले या टोल्यूनि या tetrahydrofuran या dichloromethane और गिलास स्लाइड विभिन्न योगों के साथ लेपित स्पिन के साथ संयोजन में या तो, क्लोरोफॉर्म में solubilized था. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) (चित्रा 1) बहुलक कोटिंग्स के भौतिक गुण विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया. टोल्यूनि या क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर प्राप्त कोटिंग PU134 वर्षा (चित्रा 1 ए) के साथ एक असमान कोटिंग का प्रदर्शन, सजातीय नहीं था. इसके विपरीत, tetrahydrofuran एक बहुत अधिक वर्दी सतह (चित्रा 1 ए) की स्पिन कोटिंग की अनुमति एक उपयुक्त विलायक था. सतह स्थलाकृति वर्ग (आरएमएस) और मतलब खुरदरापन (रा) मतलब रूट का उपयोग AFM द्वारा मापा गया था. PU134 भंग tetrahydrofuran वें तुलना में खुरदरापन में 40% की कमी का प्रदर्शनई अन्य विलायकों (चित्रा 1 बी और 1 सी). ये आंकड़े एक विलायक के रूप में tetrahydrofuran का उपयोग जैविक आवेदन के लिए PU134 का एक और अधिक समान कोटिंग प्रदान करता है कि प्रदर्शित करता है.

पॉलिमर स्थलाकृति hepatocyte समारोह पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है

hESC कुशलता वयस्क जिगर 17-20 में पाया कार्यों के कई प्रदर्शन, इन विट्रो में यकृत अन्तर्जनस्तर के लिए भेदभाव किया जा सकता है. यकृत अन्तर्जनस्तर भेदभाव प्रेरित किया गया था और दिन में 9 hepatoblast की तरह कोशिकाओं cytokeratin 19 (1.2 ± 99%), α भ्रूणप्रोटीन (0.6 ± 99%), और यकृत परमाणु कारक 4α (97% ± व्यक्त कोशिकाओं के बहुमत के साथ स्पष्ट किया गया 2.6); और albumin के निम्न स्तर (1.7 ± 20%) (चित्रा 2). इस बिंदु पर कोशिकाओं को व्यक्त करने और विभिन्न बहुलक लेपित सतहों पर replated TrypLE का उपयोग कर अलग किया गया. चयापचय समारोह के एक उपाय के रूप में, साइटोक्रोम P450 चगर्मजोशी 4 दिनों के बाद replating मूल्यांकन किया गया था. हम tetrahydrofuran / PU134 लेपित सतहों (चित्रा 3) पर replated कोशिकाओं में चयापचय गतिविधि में एक 2 गुना वृद्धि मनाया. पिछले 21 दृष्टिकोण के साथ इन परिणामों hESC व्युत्पन्न hepatocyte चयापचय गतिविधि PU134 की एक और अधिक समान कोटिंग के साथ सुधार हुआ है दिखाना है कि, यह सुसंगत है.

बहुलक का bioactive गुणों पर भूतल नसबंदी प्रभावों

PU134 प्रदर्शन पर नसबंदी का प्रभाव भी जांच की गई. पॉलिमर लेपित गिलास स्लाइड यूवी या गामा विकिरण से अवगत कराया गया. PU134 लेपित गिलास स्लाइड के चरण विपरीत इमेजिंग कोई सकल मतभेद यूवी या गामा विकिरण (चित्रा -4 ए) पोस्ट दिखाया. इन टिप्पणियों आगे SEM विश्लेषण (चित्रा 4 बी) द्वारा पुष्टि की गई. PU134 की जैविक प्रदर्शन के बाद replating 10 दिनों में hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स का उपयोग कर जांच की गई थी. hESC व्युत्पन्नγ-निकलने PU134 लेपित गिलास स्लाइड पर replated हेपाटोसाइट्स यूवी निकलने PU134 लेपित गिलास स्लाइड (चित्रा 4C) पर replated कोशिकाओं पर CYP3A गतिविधि में 3 गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया. इन टिप्पणियों गामा विकिरण हमारे उद्देश्यों के लिए इष्टतम नसबंदी तकनीक था कि प्रदर्शन किया.

चित्रा 1
चित्रा polyurethane 134 लेपित सतह के 1 अनुकूलन. (ए) गिलास स्लाइड विभिन्न सॉल्वैंट्स में भंग PU134 के 2% समाधान के साथ लेपित किया गया. विभिन्न लेपित गिलास स्लाइड की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवियों tetrahydrofuran विलायकों (काले और सफेद तीर) के टोल्यूनि, क्लोरोफॉर्म या मिश्रण के साथ तुलना में इस्तेमाल किया गया था जब एक सजातीय लेपित सतह की उपस्थिति और बहुलक का अभाव precipitates दिखा. छवियों x1664 बढ़ाई लिया और सलाखों की गिरफ्तारी तराजू गया चित्र के नीचे दिखाया ई. (ईसा पूर्व) परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) चयनित विलायकों पर PU134 लेपित सतहों का खुरदरापन विश्लेषण करने के लिए नियुक्त किया गया था. की तुलना में खुरदरापन मापदंडों आरएमएस (रूट वर्ग मतलब) (बी) और विभिन्न PU134 लेपित सतहों के रा (मतलब खुरदरापन) (सी) के विश्लेषण से एक विलायक के रूप में tetrahydrofuran का उपयोग करके प्राप्त कोटिंग smoothest सतह था कि दिखाने शर्तों के बाकी (n = 7). मतलब ± एसडी, पी <0.05 *, पी <0.01 ** चिह्नित है, और पी <0.001 tetrahydrofuran में solubilized PU134 साथ लेपित स्लाइड्स की तुलना में छात्रों टी परीक्षण द्वारा मापा, *** चिह्नित है निरूपित किया जाता है के रूप में डाटा व्यक्त कर रहे हैं. त्रुटि सलाखों 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ays "> चित्रा 2
HESC व्युत्पन्न hepatoblasts चित्रा 2 विशिष्ट वर्णन. यकृत मार्करों hESC में एएफपी, CK19, HNF4α और albumin (H9) की Immunocytochemistry दिखा अभिव्यक्ति यकृत अन्तर्जनस्तर निकाली गई. नकारात्मक नियंत्रण इसी immunoglobulin जी (आईजीजी) और प्रतिनिधि छवियों दिखाया जाता है के साथ प्रदर्शन किया गया. सकारात्मक कोशिकाओं और मानक विचलन का प्रतिशत देखने के प्रति कम से कम 300 कोशिकाओं से युक्त देखने के लिए कम से कम पांच यादृच्छिक क्षेत्रों से अनुमान लगाया गया था. छवियों 20X बढ़ाई पर ले जाया गया. सलाखों 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसडी त्रुटि के रूप में डेटा व्यक्त की है. HNF4α, यकृतकोशिका परमाणु कारक 4α; एएफपी, α भ्रूणप्रोटीन; ALB, albumin; CK19, cytokeratin 19, आईजीजी बकरी, इम्युनोग्लोबिन जी विरोधी बकरी, आईजीजी माउस, इम्युनोग्लोबिन जी विरोधी माउस. यहाँ क्लिक करें एक बड़ा versi देखने के लिएइस आंकड़े के पर.

चित्रा 3
चित्रा hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स के समारोह पर PU134 लेपित सतह की स्थलाकृति के 3 कार्यात्मक निहितार्थ. विभिन्न सॉल्वैंट्स में भंग PU134 साथ लेपित गिलास स्लाइड पर 96 घंटे के लिए बनाए रखा hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स पर साइटोक्रोम P450 3 ए गतिविधि के मापन. Tetrahydrofuran साथ solubilized PU134 लेपित गिलास स्लाइड पर बनाए रखा कोशिकाओं पर साइटोक्रोम गतिविधि में में एक सुधार (एन = 6). मतलब ± एसडी, पी <0.05 चिह्नित है के रूप में डाटा व्यक्त कर रहे हैं *, पी <0.01 ** चिह्नित है, और पी <0.001 साथ लेपित स्लाइड पर बनाए रखा hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स की तुलना में छात्रों टी परीक्षण द्वारा मापा, *** चिह्नित है PU134 tetrahydrofuran पर solubilized. त्रुटि सलाखों 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.


चित्रा 4 लेपित सतहों की नसबंदी का अनुकूलन. चरण विपरीत छवियों (ए) या ​​SEM छवियों (बी) γ विकिरण या पराबैंगनी विकिरण (यूवी) उपचार के बीच PU134 लेपित सतह में कोई सकल मतभेद दिखा. चरण विपरीत छवियों 1,664X बढ़ाई 40X बढ़ाई और SEM छवियों पर ले जाया गया. PU134 लेपित गिलास स्लाइड पर 10 दिनों के लिए बनाए रखा hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स पर साइटोक्रोम P450 3 ए गतिविधि (सी) विश्लेषण. यूवी पर replated कोशिकाओं की तुलना में γ-निकलने PU134 लेपित गिलास स्लाइड पर replated कोशिकाओं में साइटोक्रोम P450 3 ए गतिविधि में वृद्धि PU134 लेपित गिलास स्लाइड निकलने. गतिविधि की इकाइयों मिलीलीटर -1 सेमी -2 संस्कृति सतह के रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं (एन = 3). डेटा मतलब ± एसडी, पी <0.001 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं मैं*** γ-विकिरण द्वारा निष्फल PU134 लेपित गिलास coverslips पर बनाए रखा hESC व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स की तुलना में छात्रों टी परीक्षण द्वारा मापा चिह्नित है. त्रुटि सलाखों 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्राथमिक एंटीबॉडी
एंटीजन प्रकार कंपनी कमजोर पड़ने
HNF4α खरगोश पॉलीक्लोनल सांताक्रूज 1/100
Albumin माउस मोनोक्लोनल सिग्मा 1/500
एएफपी माउस मोनोक्लोनल Abcam 1/500
Cytokeratin 19 माउस मोनोक्लोनल Dako 1/50
आईजीजी माउस मोनोक्लोनल Dako 1/500
माध्यमिक एंटीबॉडी
विरोधी खरगोश 568 एलेक्सा मैदा बकरी Invitrogen 1/400
विरोधी माउस 488 एलेक्सा मैदा खरगोश Invitrogen 1/500

इस अध्ययन में इस्तेमाल अनुकूलित प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी और सांद्रता की तालिका 1 सूची. HNF4α, यकृतकोशिका परमाणु कारक 4α; एएफपी, α भ्रूणप्रोटीन; आईजीजी, इम्युनोग्लोबिन जी

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Discussion

स्टेम कोशिकाओं से हेपाटोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल मौजूदा तरीकों से कई जानवर मूल के अपरिभाषित matrices पर भरोसा करते हैं. इन substrates के आवेदन करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा का प्रतिनिधित्व, सेल समारोह और स्थिरता को प्रभावित करने, महंगी और उच्च चर हो सकता है. इसलिए, हम स्टेम सेल व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स की संस्कृति का समर्थन है जो सिंथेटिक सामग्री के लिए एक स्क्रीन प्रदर्शन किया. हम पहचान की है, एक मजबूत hepatocyte भेदभाव दृष्टिकोण के साथ संयोजन में PHNGAD, एमडीआइ और एक भरनेवाला, कि polymerizing द्वारा गठित एक सरल polyurethane (PU134), hepatocyte फेनोटाइप स्थिर और Matrigel 15 की तुलना में सेल समारोह में सुधार.

ऐसे vitronectin 22, laminin 521 23 या Matrigel के रूप में आमतौर संवर्धन में इस्तेमाल जैविक matrices, मौजूदा और फर्क स्टेम कोशिकाओं के रख रखाव, लघु अवधि के रखरखाव के लिए प्रभावी है. इसके विपरीत, PU134 लेपित सतहों hepatocy के लिए एक बेहतर सब्सट्रेट प्रदानते संस्कृति. इसके अलावा, सतह स्थलाकृति और बहुलक नसबंदी के अनुकूलन सेल प्रदर्शन, भरोसेमंद प्रदर्शन के साथ पैमाने पर मानव यकृत मॉडल पहुंचाने में एक महत्वपूर्ण कारक में और सुधार करने के लिए मार्ग प्रशस्त किया है.

श्रृंखला भरनेवाला और फिनाइल आइसोसाइनेट की प्रकृति प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है; उन्मूलन या काफी बहुलक सतह ख़राब होगा या तो घटक के प्रतिस्थापन और इसलिए सेलुलर लगाव और स्टेम सेल व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स के कार्यात्मक गतिविधि के रूप में. बहुलक की संरचना इस तरह के प्रभावों hepatocyte समारोह में शामिल कुंजी बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को अवशोषित करने के लिए बहुलक की क्षमता है, जो लोच और wettability 24, के रूप में शारीरिक मापदंडों को प्रभावित करता है. इसके अलावा, उत्प्रेरक में बदलाव, प्रतिक्रिया समय और तापमान बहुलक का आणविक वजन वितरण प्रभावित करते हैं.

विलायक का चयन बहुलक पुन solubilize कोएक अनुकूलित बहुलक लेपित सतह के प्राप्त करने में एक और महत्वपूर्ण बिंदु प्रस्तुत करता है. हम विलायक की प्रकृति कोशिकाओं 25-31 के समारोह में प्रत्यक्ष प्रभाव पड़ता है जो लेपित सतह की स्थलाकृति को प्रभावित करता है कि मनाया है. इसके अलावा, कताई समय और गति भी इस वर्दी और सजातीय कोटिंग प्राप्त करने में महत्वपूर्ण हैं. कोशिकाओं की गतिविधि इस्तेमाल किया नसबंदी उपचार से प्रभावित किया जा सकता है के रूप में ध्यान में लेने के लिए एक और कदम है, बहुलक लेपित सतह पर लागू नसबंदी प्रक्रिया है. यह अलग नसबंदी प्रक्रियाओं 32-34 बहुलक के ढांचे के भीतर संवेदनशील क्षेत्र (ओं) की उपस्थिति के कारण हो सकता है.

वर्तमान pluripotent स्टेम सेल आधारित सेल मॉडल प्ररूपी और कार्यात्मक सीमाओं के पास है. हम सतह लेपित इस अनुकूलित बहुलक जैविक subst के उपयोग के साथ जुड़े सीमाओं के कुछ circumventing, क्षेत्र में एक अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है का मानना ​​है किदरों. इसके अलावा, 3 डी के भीतर बहुलक उपयोग करने की संभावना आगे सेल निष्ठा सुधार हो सकता है, ब्याज के ऊतकों में पाया विभिन्न सेलुलर प्रकार की कुर्की का समर्थन करने के matrices.

अंत में, सिंथेटिक सामग्री के उपयोग pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानव सोमा के वितरण में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है. हम मजबूत है कि एक अनुकूलित सतह और कोटिंग प्रक्रिया विकसित की है और मज़बूती से सेल आधारित मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ कार्यात्मक मानव hepatocytes बचाता है.

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Disclosures

डी सी एच सीएसओ, FibromEd प्रॉडक्ट्स लिमिटेड में निदेशक, संस्थापक और FibromEd प्रॉडक्ट्स लिमिटेड एमबी और JPI में एक शेयरधारक हैं संस्थापक शेयरधारकों है

Acknowledgments

डी सी एच, एमबी और FK फंड पर एक EPSRC पालन द्वारा समर्थित थे. बीएल वी और डी एस प्रत्येक एमआरसी पीएचडी द्वारा समर्थित थे. के.सी. ब्रिटेन पुनर्योजी चिकित्सा प्लेटफार्म से धन के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

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