Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

Chemistry

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Summary

Este artigo irá focar no desenvolvimento de superfícies de polímeros revestido de longo prazo, estável cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos humanos.

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Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

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Abstract

Introduction

Os materiais biológicos têm sido amplamente utilizados para a manutenção e diferenciação de células estaminais pluripotentes 1. Enquanto permitindo, estes substratos biológicos, muitas vezes contêm uma infinidade de componentes indefinidos. Matrigel é um substrato comumente usado para a cultura e diferenciação de células-tronco. Infelizmente, a sua composição variável influencia a função de células e fenótipo. Apesar de uma variedade de matrizes biológicas alternativas, mais definidos foram utilizados 2-7, a sua origem animal ou pobre escalabilidade os torna candidatos inadequados para o fabrico industrial. Portanto, a identificação de alternativas sintéticas, com composição definida e desempenho de confiança, são objetivos-chave na investigação sobre células estaminais.

Numa tentativa de ultrapassar as limitações dos substratos de cultura celular indefinido, a colaboração entre interdisciplinar da química e da biologia identificaram materiais sintéticos com a capacidade para suportar o fenótipo da célula. Synthsubstratos etic são escaláveis, de baixo custo, e podem ser fabricados em estruturas 3D complexas, imitando o ambiente in vivo. Devido a estas propriedades de substratos sintéticos têm sido amplamente utilizados para suportar e conduzir a diferenciação de muitos tipos de células 8-10.

Ensaios avançadas e de alto rendimento têm facilitado a rápida triagem de materiais sintéticos, a partir de grandes bibliotecas, e entregues novos materiais com propriedades flexíveis com larga aplicação em pesquisa e desenvolvimento 11-13 biomédica. Utilizando alto rendimento, tecnologia de rastreio de polímero de micro-arranjo, que rapidamente identificado um poliuretano simples (PU134), adequado para a manutenção de células estaminais derivadas de hepatócitos humanos. Este polímero verificou-se ser superior a substratos derivados de animais no que diz respeito à função e diferenciação de hepatócitos 14-16. Temos posteriormente otimizado o processo de condições de revestimento, topografia e esterilização para acessar efeitossobre o desempenho do polímero de estabilização da função de hepatócitos e tempo de vida. Isto tem implicações significativas no que diz respeito à compreensão de fundamentos da biologia dos hepatócitos para modelagem baseada em células e aplicações de medicina regenerativa.

A tecnologia aqui descrita representa um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser optimizado para preservar fenótipo celular. Acreditamos que a combinação desta tecnologia com um protocolo de diferenciação de hepatócitos sem soro eficiente tem o potencial de proporcionar uma produção escalável de hepatócitos para uso em modelagem in vitro e medicina regenerativa.

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Protocol

1. Síntese de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol)

Esquema 1

Esquema 1: Síntese de PHNAGD Representação esquemática da síntese de PHNAGD.. PHNAGD foi preparado pela reacção de 1,6-Hexanodiol, dietilenoglicol, neoppentyl glicol e ácido adípico. PHNAGD, Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol.

  1. Aplicar um tratamento de calor para os monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etileno-glicol) e neopentil glicol a 40 ° C durante 48 horas num forno de vácuo para remover qualquer água residual. Deixa-se a frio até a temperatura ambiente sob vácuo.
  2. Adicionar 22 mmoles de cada monómero e ácido adípico (55 mmol) a um balão de fundo redondo de duas tubuladuras equipado com uma barra de agitação e ligado a um aparelho de Dean-Stark.
  3. Coloque todo o conjunto sob vácuo e aquecer lentamente a ABLssware a 40 ° C durante 6 horas, a fim de evitar qualquer possibilidade de absorção de humidade, durante a adição do produto químico para o balão.
  4. Adicionar através de uma seringa, gota a gota, 0,0055 mole do catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio.
  5. Agita-se a mistura de reacção a 180 ° C, sob uma atmosfera de N 2 durante 24 h, e recolher a água residual na armadilha de Dean-Stark. Permitir que o produto a arrefecer até à temperatura ambiente.

2 Síntese de PU134

Esquema 2

Esquema 2: Síntese de PU134 Representação esquemática da síntese de poliuretano PU134 134 foi preparado através da reacção de 1,0 equivalentes de um PHNGAD com 2,0 equiv de um 4,4 '-metilenobis (fenil-isocianato), seguido pela adição de 1,0. equiv de um extensor de cadeia de 1,4-butanodiol.

  1. Misturar um equivalente do poliol PHNGAD (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) com dois equivalentes de 4'4-metilenobis (fenil isocianato) (6,4 mmol) em N, N-dimetilformamida (12 ml).
  2. Agita-se a mistura de reacção a 70 ° C, sob uma atmosfera de N 2.
  3. Adicionar através de uma seringa, gota a gota, o catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio (0,8% em peso).
  4. Após 1 hora, adicionar um equivalente do extensor de cadeia de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar a temperatura a 90 ° C e agita-se durante 24 horas sob uma atmosfera de N 2.
  5. Após a reacção, recolher o poliuretano por precipitação por adição de éter dietílico (hexano ou água pode também ser usado), gota a gota para a solução reaccional até a precipitação ocorre.
  6. Centrifuga-se a solução a 5300 xg durante 5 min.
  7. Decantar o sobrenadante e secar a 40 ° C num forno de vácuo até que o solvente se evapora.
    Nota: A fim de garantir que o produto final da reacção possuem os parâmetros de correcção relativos à distribuição do peso molecular, o grou funcionalps do polímero, e as temperaturas de fusão e de transição vítrea, de várias técnicas e métodos de análise pode ser utilizado, tais como a cromatografia de permeação em gel ou espectrometria de FITR.

3 Preparação de Soluções PU134

  1. Pesar 200 mg de PU134 em uma garrafa de vidro.
  2. Diluir PU134 para uma concentração final de 2% de uma série de solventes: clorofórmio, uma combinação de clorofórmio e de tolueno na proporção 1: 1, tetra-hidrofurano, e uma combinação de tetra-hidrofurano e diclorometano na proporção 1: 1.
    Nota: A escolha do solvente direita varia dependendo do polímero a ser usado. Diferentes solventes possuem diferentes pontos de ebulição, que podem afectar a solubilização do polímero.
  3. Agitar a suspensão vigorosamente durante 20 min à temperatura ambiente usando um agitador a uma velocidade de 200 mot / min, até a solução se tornar homogénea e é observado nenhum precipitado.

4 Revestimento de Vidro Slides com PU134

  1. Coloque uma rouDN 15 mm 2 lamela no aplicador de rotação.
  2. Aplicar 50 ul da solução a cada PU134 usando uma pipeta. Ajustar o volume da solução em conformidade PU134 para o tamanho lamela necessário manter o volume à superfície relação proporcional.
  3. Gire cada lamela de 7 seg a 23 x g.
  4. Ar lamela seco à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes da esterilização.

5. Irradiação de Coverslip

  1. Gamma-irradiar polímero lamela revestida através da aplicação de uma dose de 10 Grays utilizando um irradiador de laboratório durante 12 min.
  2. UV irradiar polímero revestido lamela usando a 30 W, lâmpada UV por 16 min cada lado.
  3. Coloque a lamela revestida com polímero em uma placa de cultura de tecido apropriado de acordo com o tamanho do diapositivo.

6. Microscopia Eletrônica de Varredura

  1. Ouro revestimento por pulverização catódica lamela polímero para 200 segundos em uma atmosfera de 5 x 10 -1 milibares de pressão.
  2. Capture a micrographs da lamela polímero revestido usando um microscópio eletrônico de varredura em uma tensão de aceleração de 20 kV em modo de imagem de elétrons secundários.

7. Observações Microscopia de Força Atômica

  1. Digitalizar uma área de 20 x 20 um de a superfície do polímero.
  2. Configurar uma taxa de varredura de 1,32 Hz a 1,60 Hz.
  3. Configure uma resolução de 512 x 512 pixels na região digitalizada.
  4. Calcular a raiz quadrada da média (RMS ou QR) do revestimento usando a média dos desvios de altura retirados do plano médio de dados de imagem, expressa como:

    Quando Zi é o valor actual Z, e N é o número de pontos dentro da área dada.
  5. 7.5 Calcule o desvio ou média rugosidade da superfície (Ra) da imagem, usando,

    Quando Z (x) é a função que descreve tele superfície perfil analisados ​​em termos de altura (Z) e posições (x) da amostra ao longo do comprimento de avaliação de "L". Ra representa o valor médio da superfície em relação ao plano central.

8 Cultura e diferenciação celular

  1. Cultura e diferenciar o humano linha de células-tronco embrionárias (hESC) H9, conforme descrito no Hay 17.
  2. Separar as células utilizando um reagente de dissociação e replate los para PU134 lâminas revestidas no Dia 9 do processo de diferenciação, na presença de um meio isento de soro como descrito no Szkolnicka 18,19.
    Nota: O uso de uma célula de dissociação enzimática é preferido ao descolamento celular física.

9. citocromo P450 Ensaio Funcional

  1. Medir a actividade do CYP3A seguindo as instruções do fabricante.
  2. Incubar hESC hepatócitos derivados no dia 13 ou no dia 19, e meios de comunicação, sem células - como controle negativo, com o substr apropriadocomeu durante 5 horas a 37 ° C.
  3. Colete sobrenadantes de células e meios de comunicação, realizar o ensaio de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Medir o nível de actividade de CYP e normalizada em relação à área de superfície (2 cm).

10. Imunocoloração

  1. Lavar células estaminais embrionárias humanas hepatócitos derivados com PBS, durante 1 min, repetir duas vezes.
  2. Adicionar gelo frio 100% de metanol para fixar as células, em lugar de -20 ° C durante 10 min.
  3. Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir duas vezes.
  4. Incubar as células com PBS / T (0,1% de tween) / 10% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente.
  5. Aspirar a solução de PBST e adicionar o anticorpo primário adequado diluídos em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, incubar a 4 ° C com agitação suave S / N.
  6. Lavar as células com PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1% durante 5 minutos e repetir três vezes.
  7. Diluir o anticorpo apropriado em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, adicionar às células e incuba-se no escuro à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave.
  8. Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir três vezes.
  9. Adicionar MOWIOL 488 (contendo DAPI 1: 1000) a cada poço, adicione uma lamela suavemente para reduzir o número de bolhas de ar. Loja células fixas, a 4 ° C no escuro. Observe a coloração utilizando um microscópio com filtro apropriado e lâmpada fluorescente. Os anticorpos primários e secundários optimizados estão listadas na Tabela 1.

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Representative Results

Solvente de polímero influencia a topografia da superfície de polímero revestido

Poliuretano 134 foi solubilizado em clorofórmio, quer isoladamente ou em combinação com tolueno ou tetra-hidrofurano ou diclorometano, e as lâminas de vidro de spin-revestidos com as diferentes formulações. A microscopia electrónica de varrimento (SEM) e de microscopia de força atómica (AFM), foram utilizados para caracterizar as propriedades físicas dos revestimentos de polímeros (Figura 1). O revestimento obtido utilizando tolueno ou clorofórmio não era homogéneo, o que demonstra um revestimento irregular com PU134 precipitação (Figura 1A). Em contraste, o tetra-hidrofurano foi um solvente apropriado que permite a rotação de um revestimento muito mais uniforme superfície (Figura 1A). A topografia de superfície foi medida por AFM usando o root mean square (RMS) e da rugosidade média (Ra). PU134 tetrahidrofurano dissolvido exibiu uma redução de 40% na rugosidade em relação ao the outros solventes (Figura 1B e 1C). Estes dados demonstram que o uso de tetra-hidrofurano como solvente fornece um revestimento mais uniforme da PU134 para aplicação biológica.

Polymer topografia tem um impacto significativo sobre a função dos hepatócitos

células estaminais embrionárias humanas podem ser diferenciadas de forma eficiente a endoderme hepática in vitro, exibem muitas das funções encontradas no fígado adulto 17-20. Diferenciação endoderme hepática foi induzida e no Dia 9 células hepatoblast semelhante eram aparentes, com a maioria das células que expressam a citoqueratina 19 (99% ± 1,2), α-fetoproteína (99% ± 0,6), e hepática 4α factor nuclear (97% ± 2,6); e os baixos níveis de albumina (20% ± 1,7) (Figura 2). Neste ponto, as células foram destacadas usando TrypLE expressar e novamente semeadas para as superfícies revestidas de polímeros diferentes. Como uma medida da função metabólica, citocromo P450 função foi avaliada quatro dias pós-repique. Observou-se um aumento de 2 vezes da actividade metabólica das células plaqueadas de novo em tetrahidrofurano / superfícies revestidas PU134 (Figura 3). Estes resultados demonstram que células estaminais embrionárias humanas derivadas da atividade metabólica dos hepatócitos é melhorado com um revestimento mais uniforme PU134, o que é coerente com o anterior se aproxima de 21.

Impactos esterilização superficial sobre as propriedades bioativas do polímero

O efeito da esterilização no desempenho PU134 também foi investigada. Polymer lâminas de vidro revestidas foram expostas a radiação UV ou radiação gama. Fase de imagiologia de contraste de lâminas de vidro revestidas PU134 não mostraram diferenças grosseiras deixar UV ou radiação gama (Figura 4A). Estas observações foram ainda confirmados pela análise de SEM (Figura 4B). O desempenho biológico da PU134 foi examinada utilizando células estaminais embrionárias humanas derivadas de hepatócitos em 10 dias pós-replating. hESC derivadashepatócitos novamente semeadas em lâminas de vidro revestidas PU134 irradiada-γ apresentado um aumento de 3 vezes na actividade do CYP3A sobre as células novamente semeadas em lâminas de vidro revestidas PU134 irradiada com UV (Figura 4C). Estas observações demonstram que a irradiação gama é a técnica de esterilização óptima para os nossos objectivos.

Figura 1
Figura 1 Optimização da superfície revestida de poliuretano 134. Lâminas (A) de vidro foram revestidas com uma solução a 2% de PU134 dissolvido em diferentes solventes. Scanning Electron Microscopy imagens (SEM) das lâminas de vidro revestidas diferentes mostram a presença de uma superfície revestida homogénea e a ausência de polímero precipita quando tetrahidrofurano foi utilizada em comparação com o tolueno, o clorofórmio ou misturas de solventes (as setas pretas e brancas). As imagens foram tiradas com ampliação de x1664 e escalas bares ar e por baixo das imagens exibidas. (BC) Microscopia de Força Atômica (AFM) foi empregado para analisar a rugosidade das superfícies revestidas PU134 sobre os solventes selecionados. A análise dos parâmetros de rugosidade RMS (root mean square) (B) e Ra (a média de rugosidade) (C) das diferentes superfícies PU134 revestidos mostram que o revestimento obtido utilizando tetra-hidrofurano como um solvente tinha a superfície mais suave, quando comparado com o resto das condições (n = 7). Os dados estão expressos como média ± sd, p <0,05 é denotado *, p <0,01 ** é denotada, e p <0,001 *** é denotada, medido pelo teste t de Student, em comparação com as lâminas revestidas com PU134 solubilizadas em tetrahidrofurano. As barras de erro representam um desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ays "> Figura 2
Figura 2 Caracterização dos hepatoblasts hESC derivados. Imunocitoquímica mostrando a expressão de marcadores hepáticos AFP, CK19, HNF4α e albumina em células estaminais embrionárias humanas (H9) derivada endoderme hepática. Os controlos negativos foram realizados com imunoglobulina correspondente G (IgG) e imagens representativas são mostrados. A porcentagem de células positivas e desvio-padrão foram estimados a partir de, pelo menos, cinco campos aleatórios de vista que contenham pelo menos 300 células por vista. As imagens foram tiradas com ampliação de 20x. Os dados são expressos como a média ± dp de erro barras representam um desvio padrão. HNF4α, Hepatocyte fator nuclear 4α; AFP,-fetoproteína α; ALB, albumina; CK19, Cytokeratin 19, cabra IgG, imunoglobulina G anti-cabra, IgG de rato, imunoglobulina G anti-mouse. Clique aqui para ver um versi maioresem dessa figura.

Figura 3
Figura 3. implicações funcionais da topografia da superfície PU134 revestido sobre a função de células estaminais embrionárias humanas derivadas de hepatócitos. Medição da actividade do citocromo P450 3A em hepatócitos derivados de células estaminais embrionárias humanas mantidas durante 96 horas em placas de vidro revestidas com PU134 dissolvido em diferentes solventes. Uma melhoria na actividade do citocromo em células mantidas em lâminas de vidro revestidas PU134 solubilizado com tetra-hidrofurano (n = 6). Os dados estão expressos como média ± sd, p <0,05 é denotado *, p <0,01 ** é denotada, e p <0,001 *** é denotada, medido pelo teste t de Student, em comparação com células estaminais embrionárias humanas hepatócitos derivados mantidos em lâminas revestidas com PU134 solubilizado em tetrahidrofurano. As barras de erro representam 1 desvio padrão.


Figura 4 Otimizando a esterilização das superfícies revestidas. Imagens de contraste de fase (A) ou imagens de MEV (B) não apresentam diferenças brutas na superfície PU134 revestido entre γ-radiação ou radiação UV (UV) tratamentos. Imagens de contraste de fase foram tiradas em 40x e SEM imagens com ampliação de 1,664X. (C) A análise da atividade 3A do citocromo P450 em hESC hepatócitos derivados mantido por 10 dias em lâminas de vidro revestidas PU134. Um aumento na actividade 3A do citocromo P450 em células plaqueadas de novo em lâminas de vidro revestidas PU134 irradiada-γ quando comparado com as células novamente semeadas em lâminas de vidro de UV irradiada PU134 revestidos. As unidades de actividade são expressos como unidades de luz relativas (RLU) -2 ml -1 cm de superfície de cultura (n = 3). Os dados são expressos em média ± sd, p <0,001 is denotados *** medido pelo teste t de Student, em comparação com células estaminais embrionárias humanas hepatócitos derivados mantidos em lamelas de vidro revestidas esterilizadas PU134 γ por radiação. As barras de erro representam um desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os anticorpos primários
Antigen Tipo Empresa Diluição
HNF4α Coelho policlonal Santa Cruz 1/100
Albumina Monoclonal Sigma 1/500
AFP Monoclonal Abcam 1/500
Cytokeratin 19 Monoclonal Dako 1/50
IgG Monoclonal Dako 1/500
Anticorpos secundários
Anti-coelho Alexa Flour 568 Cabra Invitrogen 1/400
Anti-rato Alexa Flour 488 Coelho Invitrogen 1/500

Tabela 1 Lista de anticorpos e as concentrações de primários e secundários optimizadas utilizados neste estudo. HNF4α, Hepatocyte fator nuclear 4α; AFP,-fetoproteína α; IgG, imunoglobulina G.

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Discussion

Muitos dos actuais métodos utilizados para gerar células estaminais a partir de hepatócitos de confiar em matrizes indefinidas de origem animal. Estes substratos podem ser caros e altamente variável, afetando a função celular e estabilidade, o que representa uma barreira significativa à aplicação. Por isso, foi realizada uma triagem dos materiais sintéticos que apoiam a cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos. Foram identificadas, um poliuretano simples (PU134), formada por polimerização de PHNGAD, MDI e um extensor, que em combinação com um método de diferenciação de hepatócitos robusto, estabiliza o fenótipo dos hepatócitos e melhora a função das células quando comparada com matrigel 15.

Manipulação de células-tronco matrizes biológicas, muito utilizados na cultura existentes e diferenciadores, como vibronectina 22, laminina 521 23 ou Matrigel, é eficaz para a manutenção de curto prazo. Em contraste, as superfícies revestidas PU134 proporcionar um substrato superior para hepatocycultura te. Além disso, a otimização da topografia da superfície e esterilização polímero conduziram à realização de melhorias no desempenho da célula, um fator-chave no fornecimento de modelos de fígado humano em escala com desempenho confiável.

A natureza do extensor de cadeia e de isocianato de fenilo representa uma das fases críticas do processo; como a eliminação ou substituição de qualquer um dos componentes que prejudicam significativamente a superfície do polímero e, por conseguinte, a fixação celular e actividade funcional das células estaminais derivadas de hepatócitos. A composição do polímero afecta parâmetros físicos, tais como a elasticidade e capacidade de humedecimento 24, que tem impactos a capacidade do polímero para absorver as proteínas da matriz extracelular chave envolvidos na função de hepatócitos. Além disso, as variações no catalisador, o tempo de reacção e temperatura afecta a distribuição do peso molecular do polímero.

A selecção do solvente para solubilizar o polímero de reapresenta outro ponto crítico na obtenção de uma superfície de polímero revestido otimizado. Observou-se que a natureza do solvente afecta a topografia da superfície revestida, o que tem consequências directas da função das células 25-31. Além disso, o tempo de fiação e velocidade também são cruciais para a obtenção deste revestimento uniforme e homogênea. Um outro passo para tomar em consideração é o processo de esterilização aplicado sobre a superfície do polímero revestido, tal como a actividade das células pode ser influenciada pelo tratamento de esterilização utilizados. Isto pode ser devido à presença de zonas sensíveis (s) no interior da estrutura do polímero a diferentes procedimentos de esterilização 32-34.

Modelos de celulares atuais de células-tronco pluripotentes baseados possuem características fenotípicas e limitações funcionais. Nós acreditamos que este polímero optimizado superfície revestida representa um avanço no campo, evitando algumas das limitações associadas com o uso de subst biológicataxas. Além disso, a possibilidade de utilizar o polímero no interior de matrizes 3D para suportar a ligação de diferentes tipos celulares presentes no tecido de interesse, pode ainda melhorar a fidelidade da célula.

Em conclusão, o uso de materiais sintéticos está se tornando cada vez mais importante na entrega de soma humano a partir de células-tronco pluripotentes. Temos desenvolvido um procedimento de superfície e revestimento otimizado que é robusto e oferece de forma confiável hepatócitos humanos funcionais, com implicações significativas para a modelagem baseada celular e medicina regenerativa.

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Disclosures

DCH é CSO, Diretor, fundador e acionista da FibromEd Products Ltd. MB e JPI são acionistas fundadores em FibromEd Products Ltd.

Acknowledgments

DCH, MB e FK foram apoiados por uma Siga EPSRC no Fundo. BL-V e DS foram todos suportados pela MRC studentships doutoramento. KC foi apoiado pelo financiamento da Plataforma Medicina Regenerativa Reino Unido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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