Optimize Sentetik Yüzeyler Hepatosellüler Fenotip kullanma Stabilize

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makalede, uzun vadede polimer kaplı yüzeylere geliştirilmesi üzerinde durulacak, kök hücre istikrarlı kültür, insan hepatositleri türetilmiş.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Biyolojik maddeler, yaygın olarak, pluripotent kök hücreleri 1 bakım ve farklılaşması kullanılmıştır. Sağlarken, bu biyolojik substratların tanımlanmamış bileşenlerin sayısız içerir. Matrigel kök hücre kültürü ve farklılaşması için yaygın olarak kullanılan bir alt-tabakadır. Ne yazık ki, değişken bileşim hücre fonksiyonu fenotipi etkiler. Alternatif, daha tanımlı biyolojik matris çeşitli 2-7 kullanılıyor olsa, onların hayvansal kökenli veya kötü ölçeklenebilirlik onlara endüstriyel üretimi için uygun bir aday haline getiriyor. Bu nedenle, kök hücre araştırmalarında önemli hedefler tanımlanır kompozisyon ve güvenilir performansı ile sentetik alternatifleri, kimlik vardır.

Tanımsız hücre kültürü yüzeylerin sınırlamaları aşmak için bir girişim, kimya ve biyoloji arasında disiplinler arası işbirliği hücre fenotipi desteklemek için kapasite ile sentetik malzemeler tespit ettik. Synthetik yüzeyler, etkili ölçeklenebilir maliyet ve in vivo ortamda taklit, karmaşık 3D yapılarına imal edilebilir. Bu özelliklere bağlı olarak, sentetik alt-tabakalar, çoğu hücre tipinde yaygın olarak 8-10 farklılaşmasını desteklemek ve sürmek için kullanılmıştır.

Gelişmiş ve yüksek kapasiteli testler büyük kütüphanelerinden, sentetik malzemelerin hızlı tarama kolaylaştırdı ve biyomedikal araştırma ve geliştirme 11-13 geniş uygulamaları ile esnek özelliklere sahip yeni malzemeler teslim ettik. Yüksek verim, polimer mikro-dizi tarama teknolojisini kullanarak, hızla insan kök hücresi elde edilen hepatositlerin bakımı için uygun olan basit bir poliüretan (PU134), tespit. Bu polimer, hepatosit farklılaşımı ve fonksiyon 14-16 ile ilgili olarak, hayvan kaynaklı alt tabakalara üstün olduğu bulunmuştur. Biz sonradan etkilerini erişmek için kaplama koşulları, topografya ve sterilizasyon işlemini optimizehepatosit fonksiyonları ve ömrünü stabilize polimer performansı. Bu hücre tabanlı modelleme ve rejeneratif tıp uygulamalarında hepatosit biyolojinin temel anlayış açısından önemli etkileri vardır.

Burada anlatılan teknoloji sentetik bir polimerin yüzey hücre fenotipi korumak için optimize edilebilir nasıl bir örneğini temsil eder. Verimli bir serumsuz hepatosit farklılaşma protokol ile bu teknolojinin kombinasyonu in vitro olarak modelleme ve rejeneratif tıpta kullanım için hepatosit ölçeklenebilir üretim sağlamak için bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PHNGAD (poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio) 1. sentezi

Şema 1

Şema 1: PHNAGD sentezi PHNAGD sentezinin şematik gösterimi.. PHNAGD 1,6-Hexanodiol reaksiyonu, dietilen glikol, neoppentyl glikol ve adipik asit ile hazırlandı. PHNAGD, poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio.

  1. Herhangi bir artık suyun ayrılması için bir vakumlu fırın içinde 48 saat boyunca 40 ° C 'de monomerler 1,6-heksandiol, di (etilen glikol) ve neopentil glikol için ısıl işlem uygulanır. Vakum altında oda sıcaklığına soğumuş izin verin.
  2. Bir Dean-Stark aparatı ile karıştırıldı çubuğu ile donatılmış ve bağlı olan, bir iki-boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye, her monomer ve adipik asit (55 mmol), 22 mmol ekleyin.
  3. Bir vakum altında bütün tertibatım yerleştirin, yavaşça GLA ısıtmakşişe içine kimyasal maddenin ilave edilmesi sırasında nem emilmesini önlemek için, 6 saat boyunca 40 ° C, ssware.
  4. Damla katalizör titanyum (IV) butoksit 0.0055 mol damla şırınga ile ilave edin.
  5. 24 saat boyunca, bir N2 atmosferi altında 180 ° C'de, reaksiyon karışımı, karıştırın ve Dean-Stark tuzağı içinde kalan suyun toplanması. Ürün oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

PU134 2. sentezi

Şema 2

Şema 2: PU134 sentezi PU134 bir 4,4 '-metilenbis (fenil izosiyanat) 2.0 eşdeğer bir PHNGAD 1.0 eşd reaksiyonu ile hazırlandı poliüretan 134. sentezinin şematik temsili, 1.0 ilave edildi. bir 1,4-bütandiol zincir uzatıcının eşdeğer.

  1. 4, iki eşdeğeri ile poliol PHNGAD bir eşdeğeri (Mn ~ 1800 Da, 3.2 mmol) karıştırınSusuz N '4-metilenbis (fenil izosiyanat) (6.4 mmol) N, N-dimetilformamid (12 mi).
  2. Bir N2 atmosferi altında 70 ° C de, reaksiyon karışımı, ilave edin.
  3. , Şırınga ile, katalizör ekleme damla damla titanyum (IV) butoksit (0.8% wt).
  4. 1 saat sonra, zincir uzatıcı 1,4-bütandiol (3.2 mmol) bir eşdeğeri ilave edin. 90 ° C de sıcaklığı artar ve bir N2 atmosferi altında 24 saat için karıştırın.
  5. Reaksiyonu takiben, çökelti oluşacak kadar reaksiyon çözelti içine damla damla (de kullanılabilir heksan ya da su), dietil eter ilave edilerek çökeltme poliüretan toplar.
  6. 5 dakika boyunca 5,300 x g'de çözümü santrifüj.
  7. Süpernatant süzün ve çözücü buharlaşana kadar bir vakum fırınında 40 ° C'de kurutunuz.
    Not: amacıyla reaksiyonun nihai ürünün molekül ağırlığı dağılımına ilişkin parametreler doğru sahip olduğundan emin olmak için işlevsel Groupolimer ve ergitme ve cam geçiş sıcaklıklarının PS, çeşitli analitik teknikler ve yöntemler, jel geçirgenlik kromatografisi veya Ramazan spektroskopi gibi, kullanılabilir.

PU134 Çözümleri 3. hazırlanması

  1. Bir cam şişe içine 200 mg PU134 tartılır.
  2. Kloroform, 1 kloroform ve toluen bir kombinasyonu: a çözücüler sayısındaki% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilir PU134 1 oranında, tetrahidrofuran, ve kombinasyon 1 tetrahidrofuran ve diklorometan arasında: 1 oranında.
    Not: Sağ çözücünün seçimi, kullanımı polimere bağlı olarak değişir. Değişik çözücüler polimerin çözünürlüğünü etkiler farklı kaynama noktalarına sahiptir.
  3. Çözelti homojen hale gelir ve çökelti gözleninceye kadar, 200 mot / dakika hızda bir çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında kuvvetli bir şekilde 20 dakika süre ile çözelti çalkalayın.

PU134 Cam Slaytlar 4. Kaplama

  1. Bir rou yerleştirinSpin lak nd 15 mm 2 lamel.
  2. Bir pipet kullanılarak her PU134 solüsyonu 50 ul uygulayın. Oranı ile orantılı yüzeye hacim tutarak gerekli lamel boyutu için buna PU134 çözümün ses seviyesini ayarlayın.
  3. 23 x g 7 saniye boyunca her lamel Spin.
  4. Sterilizasyondan önce en az 24 saat boyunca oda sıcaklığında kuru hava lamel.

Lamel 5. Işınlama

  1. 12 dakika süre ile, laboratuar ışınlama kullanılarak 10 Grays bir dozunun uygulanmasıyla polimer kaplı lamel Gama-ışın tedavisi.
  2. 16 dakika her iki taraf için bir 30 W, UV ampulü kullanarak polimer kaplı lamel ışın UV.
  3. Slayt boyutuna uygun olarak uygun bir doku kültürü plakasında, polimer kaplı lamel yerleştirin.

6. Taramalı Elektron Mikroskobu

  1. Basınç 5 x 10 milibar -1 atmosferinde 200 saniye boyunca püskürtme ile altın kaplama polimer lamel.
  2. Microg yakalayınİkincil elektron görüntüleme modunda 20 kV bir hızlandırma voltajı bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak polimer ile kaplanmış lamel raphs.

7. Atomik Kuvvet Mikroskobu Gözlemler

  1. Polimer yüzeyin 20 x 20 um tarama alanı içinde, bir.
  2. 1.32 Hz 1.60 Hz tarama hızı ayarlayın.
  3. Taranan bölgede 512 x 512 piksel çözünürlüğe ayarlayın.
  4. Kök ortalama resim veri düzleminden alınan yükseklik sapmalarının ortalaması kullanılarak kaplamanın karesi (RMS veya Rq) hesaplayın ortalama olarak ifade edilen:

    Nerede Zi akım Z değeri ve N belirli bir alanda nokta sayısıdır.
  5. Kullanarak görüntünün 7,5 sapmasını hesaplayın ve ortalama yüzey pürüzlülüğüne (Ra),

    Burada Z (X) t tarif fonksiyonuduro yükseklikte (Z) ve değerlendirme uzunluğu "L" üzerinden örnek konumuna (x) cinsinden analiz yüzey profili. Ra orta düzlemine yüzey nisbetle ortalama değeri temsil eder.

8. Hücre Kültürü ve Farklılaşma

  1. Kültür ve Hay 17'de tarif edildiği gibi, insan embriyonik kök hücre çizgisi (HESC) H9 ayırt eder.
  2. Bir ayırma reaktifi kullanılarak hücreleri ayırmak ve Szkolnicka 18,19 'de anlatıldığı gibi bir serumsuz ortam varlığında, farklılaşma gün, 9 ile kaplanmış dilimlerin üzerine PU134 bunları Replate.
    Not: Enzimatik Çözülme fiziksel hücre ayrılması için tercih edilir.

9. Sitokrom P450 üzerinde fonksiyonel denemeler

  1. Üreticinin talimatlarına CYP3 aktivitesini ölçmek.
  2. Hücreler olmaksızın HESC türetilmiş Gün 13 ve Gün 19 hepatositleri ve ortam inkübe - negatif kontrol olarak, uygun olan substr37 ° C'de 5 saat boyunca yedi.
  3. , Hücreler ve ortamdan süpernatantlar toplamak üreticinin talimatlarına göre analizini gerçekleştirmek.
  4. Yüzey alanı (cm2) için CYP aktivite ve normalize seviyesini ölçer.

10. immün

  1. Yıkama HESC 1 dakika boyunca PBS ile hepatositleri türetilmiş, iki kez tekrarlanır.
  2. 10 dakika boyunca -20 ° C'de buz soğukluğunda% 100 hücreleri düzeltmek için, metanol, yer ekleyin.
  3. 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın ve hücreler iki kez tekrarlayın.
  4. PBS / T (% 0.1 Tween), oda sıcaklığında 1 saat boyunca /% 10 BSA ile hücreleri inkübe edin.
  5. PBST solüsyonu aspire ve PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA içinde seyreltilmiştir ve uygun bir primer antikor ekleyin, hafif çalkalama O / N 4 ° C'de inkübe edin.
  6. 5 dakika boyunca PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA hücreleri yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
  7. PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA içinde, uygun bir antikor seyreltik hücrelere eklenir ve hafif çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe.
  8. 5 dakika boyunca PBS ile hücreleri yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
  9. Her bir oyuğa hava kabarcıkları sayısını azaltmak için hafifçe bir lamel ekleyin: (1000 DAPI içeren 1) Mowiol 488 ekleyin. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de duran hücrelerin. Uygun bir filtre ve floresan lambası ile bir mikroskop kullanılarak boyama dikkate alınmalıdır. Optimize edilmiş birincil ve ikincil antikorlar, Tablo 1 'de listelenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polimer çözücü polimer kaplanmış bir yüzey topografisi etkiler

Poliüretan 134 tek başına ya da toluen ya da tetrahidrofuran ya da diklorometan ve cam slaytlar farklı formülasyonlar ile kaplı dönüşü ile kombinasyon halinde, kloroform içinde çözüldü. Tarama elektron mikroskopi (SEM) ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) (Şekil 1) polimer kaplamaların fiziksel özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Toluen veya kloroform kullanılarak elde edilen kaplama PU134 çökeltme (Şekil 1A) ile düzgün olmayan bir kaplama gösteren, homojen bir şekilde gerçekleşmemiştir. Bunun aksine, tetrahidrofuran, çok daha düzgün bir yüzey (Şekil 1A) spin kaplama sağlayan uygun bir çözgen içinde oldu. Yüzey topoğrafyası kare (RMS) ve ortalama pürüzlülüğü (Ra), ortalama kök kullanarak AFM ile ölçülmüştür. PU134 çözünmüş tetrahidrofuran inci karşılaştırıldığında pürüzler bir% 40 azalma sergiledie diğer çözücüler (Şekil 1B ve 1C). Bu veriler, bir çözücü olarak tetrahidrofuran içinde kullanımı Biyolojik uygulama için PU134 daha düzgün bir kaplama sağlar göstermektedir.

Polimer topografya hepatosit fonksiyonu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir

HESC verimli yetişkin karaciğerde 17-20 bulunan işlevlerin çoğunu sergileyen, in vitro hepatik endoderm için ayırt edilebilir. Karaciğer endoderm farklılaşma sağlandı ve Günü'nde 9 hepatoblast-benzeri hücreler sitokeratin 19 (1.2 ±% 99), α-fetoprotein (0.6 ±% 99) ve hepatik nükleer faktör 4α (% 97 ± ifade hücrelerinin çoğunluğu ile, belirgindi 2.6); ve albumin düşük seviyelerde (1.7 ±% 20) (Şekil 2). Bu noktada hücreler, ifade ve farklı polimer ile kaplanmış yüzeyler üzerine kaplandı TrypLE kullanılarak aynldı. Metabolik fonksiyonu bir önlem olarak, sitokrom P450 function 4 days sonrası replating değerlendirildi. Bu, tetrahidrofuran / PU134 kaplanmış yüzeylerin (Şekil 3) üzerine kaplandı hücrelerinde, metabolik etkinlikteki 2 kat artış gözlenmiştir. Önceki 21 yaklaşımlar ile elde edilen bu sonuçlar, hepatosit HESC metabolik aktivite PU134 daha homojen bir şekilde kaplanması ile daha iyi olduğunu göstermektedir, bu tutarlıdır.

Polimerin biyolojik olarak aktif özelliklerine yüzey sterilizasyonu etkiler

PU134 performansı üzerinde sterilizasyon etkisi de araştırılmıştır. Polimer kaplı cam slaytlar, UV veya gama ışınlarına maruz bırakılmıştır. PU134 kaplı cam lam faz kontrast görüntüleme hiçbir büyük bir fark UV, gama ışıması ya da (Şekil 4A) göstermemişlerdir. Bu gözlemler SEM analizi (Şekil 4B) ile doğrulanmıştır. PU134 biyolojik performans sonrası şarjı 10 gün sonra elde edilen HESC hepatositleri kullanılarak incelenmiştir. HESC türetilmişγ-yayılan PU134 kaplı cam lam üzerine kaplandı hepatositler UV ışıma PU134 kaplanmış cam slaytlar (Şekil 4C) ile kaplandı hücreleri üzerinde CYP3 aktivitesinde 3 misli bir artış göstermiştir. Bu gözlemler, gama ışınlama bizim için en uygun sterilizasyon tekniği olduğunu gösterdi.

Şekil 1
Şekil 134, poliüretan kaplı yüzey 1. optimizasyonu (A). Cam slaytlar, farklı çözücüler içinde çözülmüş PU134 bir% 2 çözeltisi ile kaplandı. Farklı kaplanmış cam slaytlar Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) görüntüleri tetrahidrofuran çözücüler (siyah ve beyaz ok) toluen, kloroform ya da bunların karışımları ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman, homojen bir kaplanmış yüzeyin varlığı ve polimerin olmaması çökelir gösterir. Görüntüler x1664 büyütmede çekilen ve barlar ar ölçekler edildi Görüntülerin aşağıda gösterildiği örn. (BC) Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM), seçilen çözücüler PU134 kaplanmış yüzeylerin pürüzlülüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Ile karşılaştırıldığında pürüzlülük parametreleri RMS (root mean square ortalama) (B) ve farklı PU134 kaplanmış yüzeylerin Ra (ortalama pürüzlülük) (C) analizi, bir çözücü olarak tetrahidrofuran kullanılarak elde edilen kaplama yüzeyi yumuşak olduğunu göstermektedir koşullarının geri kalanı (n = 7). Ortalama ± SD, p <0.05 *, p <0.01 ** gösterilir ve p <0.001, tetrahidrofuran içinde çözülür PU134 kaplanmış slaytlara karşılaştırıldığında, Student t-testi ile ölçüldüğünde, *** gösterilir gösterilir olarak veriler ifade edilmiştir. Hata çubukları 1 standart sapmasını temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ays "> Şekil 2
HESC türetilmiş hepatoblasts Şekil 2. karakterizasyonu. Karaciğer belirteçleri HESC AFP, CK19, HNF4α ve Albümin (H9) arasında İmmünositokimya gösteren ifadesi hepatik endoderm türetilmiştir. Negatif kontroller, karşılık gelen immünoglobulin G (IgG) ve temsili görüntüleri gösterilir ile yapıldı. Pozitif hücrelerin ve standart sapma yüzdesi görüntü başına en az 300 hücre içeren görünümü, en az beş tesadüfi alanda kestirilmiştir. Görüntüler 20X büyütmede alınmıştır. Çubuklar 1 standart sapmayı temsil ortalama ± sd Hata gibi veri ifade edilir. HNF4α, hepatosit nükleer faktör 4α; AFP, α-fetoprotein; ALB, Albümin; CK19, sitokeratin 19, IgG keçi, immünglobülin G anti-keçi IgG fare, immünglobülin G anti-fare. tıklayınız büyük bir Versi görmek içinBu rakamın üzerinde.

Şekil 3,
Şekil HESC türetilmiş hepatositlerin fonksiyonu üzerindeki PU134 kaplı yüzey topografisinin 3. Fonksiyonel uygulamalar. Farklı çözücüler içinde çözüldü PU134 ile kaplanmış cam slaytlar üzerinde 96 saat boyunca muhafaza hESC elde edilen hepatositleri Sitokrom P450 3A aktivitesinin belirlenmesi. Tetrahidrofuran ile çözünebilir PU134 kaplanmış cam slaytlar üzerinde tutulan hücrelerde sitokrom aktivitesindeki bir artış, (n = 6). Ortalama ± SD, p <0.05 olarak ifade edilir veriler ifade edilmiştir *, p <0.01 ** gösterilir ve p <0.001 ile kaplanmış dilimlerin üzerine muhafaza HESC türetilmiş hepatositlerde karşılaştırıldığında, Student t-testi ile ölçüldüğünde, *** gösterilir PU134 tetrahidrofuran ile çözündürüldü. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler 1.


Şekil 4. kaplanmış yüzeylerin sterilizasyonunu İyileştirme. Faz kontrast görüntüleri (A) veya SEM görüntüleri, (B), γ-radyasyon ya da UV radyasyon (UV) tedaviler arasında PU134 kaplanmış yüzeyinde hiçbir bütün farklılıklar göstermektedir. Faz kontrast görüntüleri 1,664X büyütme, 40X büyütme ve SEM görüntüleri alınmıştır. PU134 kaplı cam lam üzerine 10 gün boyunca muhafaza HESC türetilen hepatositleri sitokrom P450 3A aktivitesi (C) analizi. UV ile kaplandı hücrelere kıyasla-γ yayılan PU134 kaplı cam lam üzerine kaplandı hücrelerinde sitokrom P450 3A aktivitesindeki artış PU134 kaplı cam slaytlar yayılan. Aktivite birimleri aşağıdaki mi -1 cm-2 kültür yüzeyinin nispi ışık birimleri (RLU) olarak ifade edilmiştir (n = 3). Veriler ortalama ± sd, p <0.001 olarak ifade edildi*** γ-radyasyonla sterilize PU134 kaplamalı cam lamellerde muhafaza HESC türetilmiş hepatositlerde karşılaştırıldığında, Student t-testi ile ölçülen gösterilen s. Hata çubukları 1 standart sapmasını temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birincil antikorlar,
Antijen Tür Şirket Seyreltme
HNF4α Tavşan poliklonal Santa Cruz 1/100
Albümin Fare monoklonal Sigma 1/500
AFP Fare monoklonal Abcam 1/500
Sitokeratin 19 Fare monoklonal Dako 1/50
IgG Fare monoklonal Dako 1/500
İkincil antikorlar
Anti-tavşan 568 Alexa Un Keçi Invıtrogen 1/400
Anti-fare 488 Alexa Un Tavşan Invıtrogen 1/500

Bu çalışmada kullanılan ve optimize edilmiş birincil ve ikincil antikorlar ve konsantrasyonları Tablo 1. listesi. HNF4α, hepatosit nükleer faktör 4α; AFP, α-fetoprotein; IgG, İmmunoglobulin G.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kök hücrelerden hepatositleri üretmek için kullanılan mevcut yöntemlerin çoğu hayvan menşeli tanımlanmamış matrisler dayanır. Bu alt-tabakalar uygulama için önemli bir engel temsil eden hücre fonksiyonu ve stabilitesini etkileyen, pahalı ve son derece değişken olabilir. Bu nedenle, kök hücre elde edilen hepatositlerin kültürünü destekleyen sentetik malzemeler için bir ekran ısırttı. Biz belirledik, sağlam bir hepatosit farklılaşma yaklaşımı ile kombinasyon halinde PHNGAD, MDI ve bir genişletici, bu polimerleştirilmesiyle oluşturulan basit bir poliüretan (PU134), hepatosit fenotipini stabilize eder ve Matrigel 15 ile karşılaştırıldığında hücre fonksiyonunu iyileştirir.

Örneğin vitronektin 22, 23 veya 521 laminin matrigel yaygın olarak kullanılan kültür biyolojik matrisler, mevcut ve ayırt kök hücre Taşıma, kısa süreli bakım için etkilidir. Bunun aksine, PU134 kaplı yüzeyler için mükemmel bir hepatocy alt-tabaka teminte kültür. Ayrıca, yüzey topografyası ve polimer sterilizasyon optimizasyonu hücre performansı, güvenilir performansı ile ölçekte insan karaciğer modeller sunmada önemli bir faktör de gelişmelere yol açmıştır.

Zincir uzatıcı ve fenil izosiyanat, doğası gereği prosesteki kritik aşamalardan biri temsil eder; ortadan kaldırılmasına veya önemli ölçüde polimer yüzeyine zarar verecek ya da parçanın değiştirilmesiyle ve bu nedenle hücre tutunması ve kök hücre elde edilen hepatositlerin fonksiyonel aktivitesi gibi. Polimerin bir bileşim bu tür etkiler, hepatosit fonksiyonunda yer alan hücre dışı matris proteinlerinin önemli absorbe polimerin kapasitesine sahip bir esneklik ve ıslatılabilme 24 gibi fiziksel parametrelerin etkiler. Buna ek olarak, katalizör değişiklikler, reaksiyon süresi ve sıcaklık, polimerin moleküler ağırlık dağılımını etkiler.

Çözücü seçimi, polimer yeniden çözündürülmesi içinoptimize edilmiş bir polimer kaplı yüzeyi elde başka bir kritik noktaya sunuyor. Biz, çözücünün doğası hücrelerin 25-31 işlevinde doğrudan etkiye sahiptir kaplanmış yüzey topografisi etkilediğini gözlemlemişlerdir. Buna ek olarak, dönme süresi ve hızı da bu muntazam ve homojen bir kaplama elde etmek çok önemlidir. Hücrelerin aktivitesi, kullanılan sterilizasyon işlemi ile etkilenebilen olarak dikkate almak için bir başka aşama olarak, polimer kaplı yüzey üzerine tatbik edilen sterilizasyon işlemdir. Bu, farklı sterilizasyon prosedürleri 32-34 için polimer yapısı içinde hassas alan (lar) varlığına bağlı olabilir.

Şu pluripotent kök hücre tabanlı cep modelleri fenotipik ve fonksiyonel sınırlamaları sahip. Bu yüzey, bu optimize edilmiş polimer kaplı biyolojik subst kullanımı ile ilişkili bazı sınırlamaları engellemeyi, bu alanda bir ilerlemeyi temsil etmektedir inanıyoruzoranları. Ayrıca, 3D ile polimerin kullanma olasılığı daha fazla hücre kalitesini iyileştirebilir, ilgi konusu dokuda bulunan çeşitli hücre türlerine ek desteklemek için matrisler.

Sonuç olarak, sentetik malzemelerin kullanımı, pluripotent kök hücrelerinden insan soma sunumunda giderek önem kazanmaktadır. Biz sağlam bir iyileştirilmiş yüzey ve kaplama işlemi gelişmiş ve güvenilir hücre tabanlı modelleme ve rejeneratif tıp için önemli etkileri olan fonksiyonel insan hepatositlerini ulaştırmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

YSS STK, FibromEd Ürünler Ltd Direktörü, kurucusu ve FibromEd Ürünleri Ltd MB ve JPI bir hissedar olan kurucu ortaklar olduğunu

Acknowledgments

YSS, MB ve FK Fonuna ilişkin EPSRC Takip tarafından desteklenmiştir. BL-V ve DS her MRC Doktora Studentships tarafından desteklenmiştir. KC İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics