Elektronische Zunge generieren Continuous Erkennungsmuster für die Protein-Analyse

Bioengineering

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Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

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Abstract

Introduction

Präzise und schnelle Proteinerkundungsmethoden sind in der medizinischen Diagnostik und der Proteomik sehr wichtig. Klassische Proteindetektions Arrays, wie Biochips, auf der "Schloss-und-Schlüssel" Anerkennung Prinzip und erfordern spezifische Rezeptoren wie Aptamere, Antikörper oder Mimetika.

In den letzten Jahren hat Differenzmess inspiriert durch den menschlichen Geruchssinn und gustation als Alternative 1 entstanden. Diese elektronische Nase / Zunge (DE / ET) Ansatz basiert auf unterschiedlichen Bindung von Analyten auf ein Array von kreuzreaktiven Rezeptoren (CRRs), die nicht brauchen, sehr spezifisch oder selektiv für die Zielmoleküle zu sein auf der Basis ermöglichen so die mühsame zu überwinden Prozess der Entwicklung hochselektiver Rezeptoren. Es ist die kombinierte Antwort aller Rezeptoren, die ein eindeutiges Muster für jede Probe erstellt, wie ein Fingerabdruck, so dass ihre Identifikation.

Die beiden wichtigsten Herausforderungen für die Entwicklung von elektronischen Nase / Lasche wirksame Protein Erfassungs sind die Herstellung von Sensorelementen, die die Fähigkeit zu strukturell ähnlichen Analyten und das entsprechende Übertragungssystem für das Bindungsereignis zu unterscheiden. Bisher wurden Untersuchungen verschiedene Ansätze zur Entwicklung Array 2 angegeben. Beispielsweise in einer Studie einer Array-basierten Identifizierung von Proteinen wurde unter Verwendung von Tetra-CRRs carboxyphenylporphyrin Derivaten hergestellt durch Kopplung der Carboxygruppen an verschiedene Aminosäuren oder Dipeptide Differenz Rezeptoren besitzen einen hydrophoben Kern auf Affinität für Proteine ​​und verschiedene Umfänge berechnet vorsehen entwickelten Vermittlung differentielle Bindung. Mit diesem System wurden verschiedene Proteine ​​und Proteingemische durch Messen der Fluoreszenzlöschung von den Rezeptoren durch die Wechselwirkung mit den Analyten 3,4 identifiziert. In einer anderen Studie wurde eine Bibliothek von 29 CRRs Tripeptid und Boronsäurereste enthalten in einer kombinatorischen Art und Weise synthetisiert auf einem hexasubstituierte Benzolgerüst wurde zur Erfassung Proteine ​​mit einem Indikator-Aufnahme kolorimetrischen Nachweis 5,6 entwickelt. Mit einer solchen Konstruktion, zeigte jeder Rezeptor Differenzbindungskapazität mit Proteinen auf der Basis der Abweichung in den Peptid Arme und der Boronsäuren der Differenzierung von Proteinen aus Glycoproteinen begleitet. In jüngerer Zeit eine Reihe von verschiedenen kationischen funktionalisierten Goldnanopartikel mit einem anionischen fluoreszierenden Polymer Poly (p-phenylenethinylen) (PPE) konjugiert zusammen wurde geschaffen, um zu detektieren und zu identifizieren Proteine ​​7. Die kompetitive Bindung zwischen Protein Analyten und abgeschreckt PPE / Gold-Nanopartikel-Komplexen regeneriert Fluoreszenz, Herstellung verschiedene Erkennungsmuster für Proteine. In dieser Studie wurden die funktionalisierten Nanopartikel-Protein-Wechselwirkungen durch Variieren physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel-Endgruppen abgestimmt. Weiterhin wurde gezeigt, dass dieser Ansatz wirksam ist für die Proteinanalyse in komplexen und eiweißreichen Medium, wie beispielsals Humanserum bei physiologisch relevanten Konzentrationen, was zeigt, das Potenzial der eT in Profi realen Proben für die Diagnose von Krankheitszuständen 8.

Wenn auch sehr vielversprechend, haben diese Systeme einige inhärente Einschränkungen. Sie erfordern Planung und Synthese von 5-29 CRRs mit recht komplizierten Strukturen. Darüber hinaus, im Gegensatz zu dem olfaktorischen System, der sich mit folgenden jeder Messung Protein Erkundung erfordert Herstellung eines Arrays pro Probe. Schließlich sind die Überwachung in Echtzeit Bindungsereignisse extrem schwierig.

In diesem Zusammenhang wurde ein kombinatorischer Ansatz unter Verwendung einer kleinen Anzahl von einfachen und leicht zugänglichen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften als Bausteine ​​(BBS) 9 vorgeschlagen (hydrophile, hydrophobe und positiv geladene, negativ geladene, neutrale, etc.). Durch Mischen BBs in unterschiedlichen und kontrollierten Anteilen und man die Mischungen zur Selbstorganisation an der Goldoberfläche einerPrisma, ein Array von Flächen mit entsprechenden kombinatorischen Eigenschaften zum Binden von Protein wurde erstellt. Bemerkenswert ist, die selbstorganisierte Monolagen auf diesem System ermöglichen eine einfache Abstimmung der eine Reihe von Oberflächeneigenschaften in einem stark divergent, so dass diverse kombikreuzreaktive Rezeptoren (CoCRRs), um schnell und effizient produziert. Protein Erfassungs wurde unter Verwendung eines optischen Erfassungssystems, Oberflächenplasmonresonanz-Bildgebung (SPRi). Kurz gesagt, beleuchtet ein Breitstrahl monochromatisch polarisierte Licht von einem LED-Array das gesamte CoCRR Bereich auf der Oberfläche des Prismas. Eine hochauflösende CCD-Videokamera bietet Echtzeit-Differenzbilder über alle Orte der CoCRR Array. Es erfasst alle lokalen Änderungen an der Oberfläche des CoCRR Array mit detaillierten Informationen über die Bindungsereignisse und kinetischen Prozessen 10. Dessen mit Hilfe der Bildbearbeitungssoftware SPR entsprechenden Bilder Flecken werden automatisch Variationen der Reflektivität Versu umgewandelts Zeit, Erzeugen einer Reihe von kinetischen Bindungskurven genannte Sensorgrammen. So erlaubt SPRi ein Etikett frei, synchrone, parallele und Echtzeit-Beobachtung von Bindungsereignissen. Zusätzlich wird die erhaltene CoCRR Array regenerierbar und wiederverwendbar für die Proteinanalyse.

Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion des elektronischen Zunge mit nur zwei kleine Moleküle als Bausteine ​​und zeigt seine Anwendung zur Analyse von Proteinen gemeinsam, die auf kontinuierlichen Erkennungsmuster mit SPRi erhalten.

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Protocol

1. Herstellung der verschiedenen Lösungen und Protein-Proben

  1. Planen 100 ml Phosphatpufferlösung (PBS-G), der 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl und 10% Glycerin bei pH 6,8.
  2. Planen 250 ml HEPES-Pufferlösung, enthaltend 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 bei pH 7,4.
  3. Bereiten Stammlösung von Baustein 1 (BB1) Laktose und Baustein 2 (BB2) sulfatierte Laktose (Abbildung 1) bei 0,2 mM in PBS-G.
  4. Vorbereitung 1 ml der Proteinlösung in HEPES: A rachis hypogaea Lectin (AHL) bei 500 nm, Myoglobin bei 1 uM, und Lysozym bei 500 nM.
  5. Es werden 20 ml 1% SDS in ultrareinem Wasser.

2. Herstellung der CoCRR Array

  1. 75% Sauerstoff, 25% Argon, 0,6 mbar, Leistung 40 W.: die Goldoberfläche des Prismas 48 Stunden vor der mit einem Plasma-Reiniger für 3 min unter diesen Bedingungen Gebrauch zu reinigen
  2. Bereiten elf reinen und gemischten solutions BB1 und BB2 mit [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Verhältnisse zwischen 0 und 100% in Schritten von 10% bei einem Gesamt BB Konzentration von 0,1 mM in PBS-G.
  3. Hinterlegung 8 nl Tröpfchen dieser reinen und gemischten Lösungen auf der Prismenoberfläche unter Verwendung eines berührungs Spotter vierfach für jede Verhältnis mit 44 Vertiefungen insgesamt (Abbildung 2).
    HINWEIS: 10% Glycerin in PBS-g ist sehr wichtig, um die Lösungsmittelverdampfung und die Änderung der Konzentration BB nach der Abscheidung zu reduzieren.
  4. Legen Sie das Prisma in einer Petrischale mit 1 ml hochreinem Wasser und lassen Sie es O / N bei RT Selbstorganisation von BB1 und BB2 auf der Goldoberfläche. Hierin wird angenommen, dass die durchschnittliche Oberflächenzusammensetzung in der gemischten SAMs spiegelt die Zusammensetzung der Abscheidungslösung gemischt (Figur 3) 11.
  5. Gründlich waschen das Prisma mit hochreinem Wasser und trocknen Sie sie unter einem Strom von Argon.

3. Proteinerkennung durch SPRi

  1. Stellen Sie die incubator, in dem die SPRi Vorrichtung wird bei 25 ° C platziert, um Änderungen des Brechungsindex durch die Temperaturänderung während der Proteinerfassungs induzierte vermeiden.
  2. Legen Sie eine nicht funktionalisierte Spülen Prisma in der 10 ul Polyether-Ether-Keton (PEEK), die Durchflusszelle mit einem Computer gesteuert Spritzenpumpe, einem Entgaser und einem 6-Tor-Mitteldruck-Einspritzventil (4). Füllen Sie das Flusssystem mit frisch gefiltert und entgast Laufpuffer HEPES.
  3. Entfernen Sie die Spülung Prisma und legen das Prisma, das die CoCRR Array in der Durchflusszelle. Run HEPES bei einer 100 ml / min Volumenstrom. Mit Hilfe der CCD-Kamera entfernen alle auf der Prismenoberfläche vorliegenden Luftblasen, indem Laufpuffer schnell.
  4. Definieren Arbeitsbereich für jeden Punkt durch Zeichnen eines Kreises mit dem gleichen Durchmesser für den Bereich von Interesse auf der Basis eines kontrastreichen Bildes der Anordnung und mit Hilfe der integrierten Software SPRi System.
  5. Spurenplasmonenkurven, die reflektieren darstellenduktivität Kurven in Abhängigkeit von dem Einfallswinkel für alle Flecken.
  6. Wählen Sie die Arbeitswinkel (Position, an der kinetischen Kurven werden aufgezeichnet) auf der höchsten Steigung der Reflexionskurven. Drehen Sie den Scanspiegel, um den ausgewählten Arbeitswinkel für kinetische Messungen zu beheben.
  7. Weiterhin HEPES durch den Strömungssystem laufen, bis Reflexionssignal für alle Flecken stabil und konstant ist.
  8. Injizieren von 1 ml AHL-Lösung mit einer Spritze in die Probenschleife (500 ul) mit dem Einspritzventil auf Position "Last". Dann legen Sie das Einspritzventil zu "Injektion" zu positionieren. Die Flussrate für die gesamte Protein Injektion verwendet wurden 100 ul / min.
  9. Starten kinetische Messungen durch Überwachung Reflektivität Variationen gegen die Zeit gleichzeitig auf allen Flecken.
  10. Am Ende des Protein-Injektion, Spülung der Anordnung mit Laufpuffer für 8 min. Schließlich injizieren 1 ml 1% SDS, um es zu regenerieren.
  11. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere proteins.

4. Datenverarbeitung und Analyse

  1. Nach Eingabe der Proteinlösung in der Strömungszelle, molekulare Bindung auftritt, und bewirkt eine Verschiebung des Plasmonen Kurven und eine Veränderung des Reflexionsvermögens. Die Bildaufnahme-Software wandelt die gemessenen Lichtintensitätswerte Grauskalapegel, wodurch SPR Bilder 5a und erzeugt die Veränderung des Reflexionsvermögens als Funktion der Zeit, so dass Sensorgramme (5B).
  2. Verwenden Sie ein Mathe-Computing-Software, um die Reflektivität (R%) am Ende jedes Proteins Injektion gegenüber dem [BB1] Grundstück / ([BB1] + [BB2]) Verhältnis zu 2D kontinuierliche Entwicklung Profil (CEP) für jede Probe zu erzeugen (Abbildung 5C).
  3. Fügen Sie die [BB1] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis im Sensorgramme (5B), um 3D-Landschaft kontinuierliche Entwicklung (CEL) für jedes Protein (5D) zu erzeugen.

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Representative Results

Um die Fähigkeit der elektronischen Zunge für gemeinsame Protein-Analyse zu untersuchen, wurden drei Proteine ​​verwendet: AHL, Myoglobin und Lysozym. Für jedes Protein eine deutliche 2D kontinuierliche Entwicklung Profil CEP wurde die ET erzeugt wird, wie in 6 gezeigt.

Darüber hinaus dank SPRi, die in der Lage, um die Echtzeit-Adsorption und Desorption Kinetik zu überwachen, für jedes Protein eine zeitabhängige kontinuierliche Erkennungsmuster ist, die so genannte 3D-Landschaft kontinuierliche Entwicklung (CEL), generiert wurde. In 7 sind charakteristische CELs dieser drei Proteine ​​gezeigt.

Figur 1
Abbildung 1. Chemische Strukturen der beiden Bausteine ​​in diesem Protokoll verwendet, um die CoCRR Array vorzubereiten.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Ein Foto eines Prismas nach Abscheiden der Tröpfchen 44 der reinen und gemischten Lösungen BB1 und BB2 unter Verwendung eines berührungslosen Piezo Spotter mit jedem Verhältnis in vierfacher Ausfertigung. Das Prisma wurde als nächstes auf ein Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml gebracht.

Figur 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung des CoCRR Array mit 11 Differenz Rezeptoren, die mit reinen und gemischten Lösungen von BB1 und BB2 auf verschiedenen Verhältnissen hergestellt wurden und man die Mischungen zur Selbstorganisation auf der Gold surFläche des Prismas.

Figur 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung des SPRi Erfassungssystem in Verbindung mit einem Mikrofluidsystem.

Figur 5
Abbildung 5. Schematische Darstellung der Datenverarbeitung zur Erzeugung von zwei Arten von kontinuierlichen Erkennungsmuster mit entwickelten elektronischen Zunge: 2D kontinuierliche Entwicklung und 3D-Profil kontinuierliche Entwicklung Landschaft.

Figur 6
Abbildung 6. Dauer-s Entwicklungsprofile für drei reine Proteine. AHL (500 nM), Myoglobin (1 uM) und Lysozym (500 nM) wurden sie durch Auftragen der Änderung des Reflexionsvermögens (R%) am Ende der Einspritzung gegenüber dem Protein [BB1 erzeugten ] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis.

Figur 7
Abbildung 7. Landschaft von Geschmack: charakteristisch 3D CELs der AHL, Myoglobin und Lysozym durch die elektronische Zunge erzeugt.

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Discussion

Die wichtigsten Schritte zur Konstruktion dieser eT sind bemüht, eine gute Reproduzierbarkeit des Systems zu gewährleisten. Beispielsweise die Reinigung der Goldoberfläche des Prismas mit einem standardisierten Verfahren vor Verwendung Zugabe von 10% Glycerin in den elf reinen und gemischten Lösungen BB1 und BB2 zur Lösungsmittelverdampfung während BBs selbstorganisierende auf der Goldoberfläche des Prismas zu vermeiden, Abscheiden mehrerer Wiederholungen für jede [BB1] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis, etc. Als Proteinerfassung durch SPRi, ist die Wahl des Arbeitswinkels kritisch. Üblicherweise ist es bei der höchsten Steigung der Reflexionskurven festgelegt. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, standardisierten experimentellen Bedingungen für die einzelnen Proteinmessung, wie beispielsweise die Arbeitstemperatur, Durchflussrate, etc. verwenden. Nach jeder Injektion Protein muss die CoCRR Anordnung zur Wiederverwendung mit einer geeigneten Lösung, die vollständige Regenerierung des Systems ermöglicht, ohne Schäden an Rezeptoren regeneriert werden.

e_content "> nach gemeinsamen Proteine ​​mit zwei Nicht-Zucker-bindende Proteine ​​Myoglobin und Lysozym zeigen, dass die entwickelten eT ist nicht nur wirksam für die Untersuchung von Zucker-bindende Proteine, wie früher berichtet 9, sondern auch ein Lectin AHL gemeinsam verwendet. Sie wurden gewählt, um eine Vielzahl von Ladungen in HEPES (pH 7,4) haben. AHL (isoelektrischer Punkt (pI) 6,0), Myoglobin (pI 7,2) und Lysozym (pI 11) Bemerkenswert ist, wie in 6 gezeigt ist, besitzt jedes Protein einen einzigartigen Antwort-Muster. AHL geringfügig negativ in HEPES berechnet. Die CEP zeigt, daß es stärkere Wechselwirkung mit den negativ geladenen BB2 reichen CoCRRs hat. Wahrscheinlich aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem positiv geladenen Domäne des Proteins und BB2 reichen CoCRRs ist . Für Myoglobin, welche in HEPES insgesamt neutral ist, gibt es nicht viel Unterschied zwischen Signalen mit allen CoCRRs erhalten. Vergleicht Myoglobin in CEP CEPS der AHL und Lysozym, selbst bei einer höheren Konzentration der Signal viel lower. Wie für Lysozym, das in HEPES positiv geladen ist, wurde das maximale Signal mit der CoCRR mit reinem BB2 erhalten.

Durch die Vorteile der SPRi zur Überwachung des Echtzeit-Adsorption und Desorption Kinetik für jedes Protein eine 3D-Landschaft kontinuierliche Entwicklung erzeugt wurde. Diese Art von zeitabhängigen Erkennungsmuster bringt zusätzliche Differenzierung Parameter für die Proteinanalyse. Insbesondere kann es äußerst nützlich für die Analyse von zwei Analyten präsentiert die ähnliche Affinität für einen Satz von CoCRRs sondern sich in ihrer Kinetik der Wechselwirkung sein. Wie in 7 gezeigt, sind die CELs leicht unterscheidbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wechselwirkung der drei Proteine ​​mit den CoCRRs ist von deren Oberflächeneigenschaften, wie die Verteilung der hydrophoben, neutralen und geladenen Aminosäureresten. Sowohl CEP und CEL kann als "Fingerabdrücke" für das Protein Diskriminierung und ProSpec verwendet werdentive Identifikation. Somit ist die effektive eT für die Analyse von Proteinen gemeinsam.

Die hier beschriebene Protokoll verwendet eine kombinatorischen Ansatz, die ET für die Proteinanalyse zu konstruieren. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen, die eine Reihe von Molekülen, die strukturell kompliziert und aufwendig zu synthetisieren sind zu verwenden, wurden nur zwei kleine Moleküle verwendet, um die kreuzreaktiven Rezeptor-Array in der Lage zu differenzieren Proteine ​​mit guter Auflösung in Vorbereitung dieser Studie. Zusätzlich nach der vorausgegangenen Untersuchung, ist der ET stabile, reproduzierbare und wiederverwendbare 9. Darüber hinaus ermöglicht die Überwachung SPRi Bindungsereignisse in Echtzeit und zur Herstellung neuer Dauererkennungsmuster mit beispielloser Zuverlässigkeit. In naher Zukunft werden weitere BBs mit komplementären physikalisch-chemischen Eigenschaften eingeführt, um die Vielfalt der CoCRR in den Arrays für die Analyse komplexer Mischungen in flüssiger oder in gas erhöhen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

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References

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