Lengua electrónica Generar Patrones reconocimiento continuo para el análisis de proteínas

Bioengineering

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Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

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Abstract

Introduction

Métodos de detección de proteínas precisos y rápidos son muy importantes en el diagnóstico médico y la proteómica. Arrays de proteínas de detección de clásicos, como los biochips, se basan en el principio de reconocimiento "tecla de bloqueo-y-" y requieren receptores específicos como aptámeros, anticuerpos, o miméticos.

En los últimos años, la detección diferencial inspirado por el olfato humano y gustation ha surgido como una alternativa 1. Esta nariz electrónica / lengua enfoque (en / eT) se basa en la unión de analitos a una matriz de receptores de reacción cruzada (CRRS), que no necesitan ser muy específica o selectiva de las moléculas diana diferencial por que permitan superar la laboriosa proceso de desarrollo de receptores altamente selectivos. Es la respuesta combinada de todos los receptores que crea un patrón distinto para cada muestra, como una huella digital, lo que permite su identificación.

Los dos retos clave para el desarrollo de elecTronic nariz / lengua para la detección de proteína eficaz son la producción de elementos de detección que tienen la capacidad de distinguir entre los analitos estructuralmente similares y el sistema de transducción apropiado para el evento de unión. Hasta ahora, los estudios han reportado varios enfoques para el desarrollo matriz 2. Por ejemplo, en un estudio se desarrolló una identificación basada en matrices de proteínas usando CRRS preparados a partir de derivados de tetra-carboxyphenylporphyrin mediante el acoplamiento de los grupos carboxilo a varios aminoácidos o dipéptidos para proporcionar receptores diferenciales que poseen un núcleo hidrófobo de afinidad por las proteínas y las periferias cargadas para distintas impartir unión diferencial. Usando este sistema, diferentes proteínas y mezclas de proteínas se identificaron mediante la medición de la fluorescencia enfriamiento de los receptores de la interacción con los analitos 3,4. En otro estudio, una biblioteca de 29 CRRS tripéptido que contienen restos de ácido borónico y sintetizado de una manera combinatoria en un hexasubstituido andamio benceno fue desarrollado para la detección de proteínas con una detección colorimétrica-indicador de la absorción de 5,6. Con un diseño de este tipo, cada receptor mostró capacidad de unión diferencial con proteínas sobre la base de la varianza en los brazos de péptidos, y los ácidos borónicos asistidos en la diferenciación de las proteínas de glicoproteínas. Más recientemente, una matriz compuesta de diferentes nanopartículas de oro funcionalizadas catiónicos conjugados con un poli fluorescente aniónico polímero (p-phenyleneethynylene) (PPE) se ha creado para detectar e identificar proteínas 7. La unión competitiva entre analitos de proteínas y se extinguió PPE complejos de nanopartículas / oro fluorescencia regeneradas, produciendo patrones de reconocimiento para proteínas distintas. En este estudio, las interacciones proteína-nanopartículas funcionalizadas se sintonizan mediante la variación de las propiedades fisicoquímicas de grupos terminales de nanopartículas. Además, se ha demostrado que este enfoque es eficaz para el análisis de proteínas en un medio rico en proteína compleja y talescomo suero humano a concentraciones fisiológicamente relevantes, lo cual demuestra el potencial de eT en perfiles de muestras reales para el diagnóstico de enfermedades 8.

Aunque muy prometedores, estos sistemas tienen algunas limitaciones inherentes. Requieren el diseño y la síntesis de de 5 a 29 CRRS con estructuras muy complicadas. Además, a diferencia del sistema olfativo que se restablece después de cada medición, detección de proteínas requiere la preparación de una matriz por muestra. Finalmente, vigilancia de los eventos de unión en tiempo real son extremadamente difícil.

En este contexto, un enfoque combinatorio se propuso mediante el uso de un pequeño número de moléculas simples y de fácil acceso con diferentes propiedades fisicoquímicas (hidrófilas, hidrófobas, cargado positivamente, cargado negativamente, neutral, etc.) Como bloques de construcción (BBS) 9. Mediante la mezcla de los BB en variables y proporciones controladas y permitiendo que las mezclas que se auto-ensamblan en la superficie de oro de unprisma, se ha creado una serie de superficies combinatorias que ofrece propiedades adecuadas para la unión a proteínas. En particular, las monocapas auto-ensambladas en este sistema permiten una fácil puesta a punto de una gama de propiedades de la superficie de una manera muy divergentes, lo que permite diversos receptores de reacción cruzada combinatorias (CoCRRs) para ser producido con rapidez y eficacia. Detección de proteínas se realizó utilizando un sistema de detección óptica, la superficie de formación de imágenes por resonancia de plasmón (SPRI). En pocas palabras, un amplio haz monocromático de luz polarizada a partir de un LED se ilumina toda la zona CoCRR matriz en la superficie del prisma. Una cámara de video CCD de alta resolución proporciona imágenes de diferencia en tiempo real a través de todos los puntos de la matriz CoCRR. Captura todos los cambios locales en la superficie de la matriz CoCRR proporcionar información detallada sobre los eventos de unión y procesos cinéticos 10. Mientras tanto, con la ayuda de software de imágenes, imágenes SPR correspondientes a los puntos se convierten automáticamente a las variaciones de reflectividad versus tiempo, generando una serie de curvas de unión cinéticos llamados sensogramas. Por lo tanto, SPRI permite una observación libre de etiquetas, síncrono, paralelo y en tiempo real de los eventos de unión. Además, la matriz CoCRR obtenido es regenerable y reutilizable para el análisis de proteínas.

Este protocolo describe la construcción de la lengua electrónica mediante el uso de sólo dos moléculas pequeñas como bloques de construcción e ilustra su aplicación para el análisis de proteínas comunes basados ​​en patrones de reconocimiento continuas obtenidas con SPRI.

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Protocol

1 Preparación de diferentes soluciones y muestras de proteínas

  1. Preparar 100 ml de solución tampón de fosfato (PBS-T) que contiene 50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 50 mM, y 10% de glicerol a pH 6,8.
  2. Preparar 250 ml de solución tampón HEPES que contiene HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de Tween 20 a pH 7,4.
  3. Preparar la solución madre de bloque de construcción 1 (BB1) bloque de la lactosa y la construcción de 2 (BB2) sulfatado lactosa (Figura 1) en el 0,2 mM en PBS-T.
  4. Preparar 1 ml de las soluciones de proteína en HEPES: una lectina hypogaea raquis (AHL) a 500 nm, la mioglobina en 1 m, y lisozima a 500 nM.
  5. Preparar 20 ml de SDS al 1% en agua ultrapura.

2 Preparación de la matriz CoCRR

  1. Limpie la superficie de oro del prisma de 48 horas antes de su uso con un limpiador de plasma durante 3 minutos bajo estas condiciones: 75% de oxígeno, 25% de argón, 0,6 mbar, potencia de 40 W.
  2. Preparar once solutio puros y mixtosns de BB1 ​​y BB2 con [BB1] / ([BB1] + [BB2]) proporciones entre 0 y 100% en incrementos de 10% a una concentración total de BB 0,1 mM en PBS-T.
  3. Depósito 8 gotas nl de estas soluciones puras y mixtas sobre la superficie del prisma utilizando un observador sin contacto por cuadruplicado para cada relación con 44 puntos en total (Figura 2).
    NOTA: 10% de glicerol agregado en PBS-T es muy importante para reducir la evaporación del disolvente y el cambio de concentración BB después de la deposición.
  4. Coloque el prisma interior de una placa de Petri que contiene 1 ml de agua ultrapura y dejarlo O / N a temperatura ambiente durante autoensamblaje de BB1 ​​y BB2 en la superficie de oro. Aquí, se supone que la composición media de la superficie en el SAM mixta refleja la composición de la solución mixta de deposición (Figura 3) 11.
  5. Lavar a fondo el prisma con agua ultrapura y luego secarlo bajo un flujo de argón.

3. Proteína Sensing por SPRI

  1. Ajuste el incubator en la que el aparato de SPRI se coloca a 25 ° C para evitar los cambios del índice de refracción inducidos por la variación de la temperatura durante la detección de proteínas.
  2. Insertar un prisma no funcionalizado de enjuague en el 10 l poliéter éter cetona (PEEK) celular conectado a una bomba de jeringa controlada por ordenador, un desgasificador y una válvula de inyección de presión media de 6 puertos de flujo (Figura 4). Rellene el sistema de flujo de recién filtrada y desgasificada corriendo HEPES tampón.
  3. Retire el prisma de enjuague e inserte el prisma que contiene la matriz CoCRR en la celda de flujo. Ejecutar HEPES a un / caudal min 100 l. Con la ayuda de la cámara CCD eliminar las burbujas de aire presentes en la superficie del prisma pasando tampón en funcionamiento rápidamente.
  4. Definir área de estudio para cada terreno dibujando un círculo con el mismo diámetro de la zona de interés sobre la base de una imagen bien contrastada-de la matriz y con la ayuda de software integrado en el sistema de SPRI.
  5. Trazar las curvas de plasmones, que representan reflejarIVITY curvas en función del ángulo de incidencia, para todos los puntos.
  6. Elija el ángulo (posición en la que se registrarán las curvas cinéticas) trabajando al más alto pendiente de las curvas de reflectividad. Gire el espejo de exploración para fijar el ángulo de trabajo seleccionado para mediciones cinéticas.
  7. Continuar para ejecutar HEPES a través del sistema de flujo hasta que la señal de reflectividad para todos los puntos es estable y constante.
  8. Inyectar 1 ml solución AHL con una jeringa en el bucle de la muestra (500 l) con la válvula de inyección en posición de "carga". A continuación, poner la válvula de inyección a la posición "inyección". La tasa de flujo utilizado para toda la inyección de proteína fue de 100 l / min.
  9. Iniciar mediciones cinéticas por vigilar las variaciones de reflectividad en función del tiempo de forma simultánea en todos los lugares.
  10. Al final de la inyección de la proteína, enjuagar la matriz con tampón de corrida durante 8 min. Por último, se inyecta 1 ml de SDS al 1% para regenerarla.
  11. Repita el mismo procedimiento para el otro proteins.

4. Procesamiento y Análisis de Datos

  1. Después de la entrada de la solución de proteína en la célula de flujo, de unión molecular se produce e induce un desplazamiento de las curvas de plasmones y una variación de la reflectividad. El software de adquisición de imágenes convierte los valores de intensidad de luz medidos a gris niveles de escala, dando imágenes SPR Figura 5A, y genera la variación de la reflectividad en función del tiempo, dando sensogramas (Figura 5B).
  2. Utilice un software de cálculo matemático para representar la reflectividad (R%) al final de cada inyección de proteínas en comparación con el [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Relación de generar el perfil 2D continua evolución (CEP) para cada muestra (Figura 5C).
  3. Añadir el [BB1] / ([BB1] + [BB2]) en relación sensogramas (Figura 5B) para generar 3D paisaje continua evolución (CEL) para cada proteína (Figura 5D).

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Representative Results

Para probar la capacidad de la lengua electrónica para el análisis de proteínas común, se utilizaron tres proteínas: AHL, mioglobina y lisozima. Para cada proteína, un perfil continuo 2D distinta evolución, CEP, fue generada por el ET, como se muestra en la Figura 6.

Además, gracias a SPRI, que es capaz de controlar el tiempo real de adsorción y desorción cinética, para cada proteína un tiempo patrón de reconocimiento continuo dependientes, llamados 3D paisaje continua evolución (CEL), se generó. En la Figura 7, se muestran cels característicos de estas tres proteínas.

Figura 1
Estructuras Figura 1. químicas de los dos bloques de construcción utilizados en este protocolo para preparar la matriz CoCRR.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Una foto de un prisma después de depositar las 44 gotas de las soluciones puras y mixtas de BB1 y BB2 utilizando un observador piezoeléctrico sin contacto con cada relación de por cuadruplicado. El prisma se coloca junto a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.

Figura 3
Figura 3. ilustración esquemática de la matriz que contiene 11 CoCRR receptores diferenciales que se prepararon con soluciones puras y mixtas de BB1 y BB2 a varias relaciones y permitiendo que las mezclas a auto-ensamblan en el sur de orocara del prisma.

Figura 4
Figura 4. Ilustración esquemática del sistema de detección SPRI combinado con un sistema de microfluidos.

Figura 5
Figura 5. ilustración esquemática de tratamiento de datos para la generación de dos tipos de patrón de reconocimiento continuo con lengua electrónica desarrollada: perfil de evolución continua 2D y 3D paisaje evolución continua.

Figura 6
Figura 6. continuous perfiles de evolución para los tres proteínas puras:. AHL (500 nM), mioglobina (1 M), y la lisozima (500 nM) fueron generados por el trazado de la variación de la reflectividad (R%) en el extremo de inyección de la proteína en comparación con el [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) relación.

Figura 7
Figura 7. Paisaje del gusto: CELS 3D característicos de AHL, la mioglobina y la lisozima generada por la lengua electrónica.

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Discussion

Los pasos más críticos para la construcción de este eT están dedicados a asegurar una buena reproducibilidad del sistema. Por ejemplo, la limpieza de la superficie de oro del prisma con un procedimiento estandarizado antes de su uso, la adición de 10% de glicerol en los once soluciones puras y mixtas de BB1 ​​y BB2 para eliminar la evaporación del disolvente durante BBs auto-montaje en la superficie de oro del prisma, depositar múltiples repeticiones para cada [BB1] / ([BB1] + [BB2]) relación, etc. Como para la detección de proteínas por SPRI, la elección del ángulo de trabajo es crítico. Por lo general, se fija en la mayor pendiente de las curvas de reflectividad. Además, es muy importante utilizar condiciones experimentales estandarizadas para cada detección de proteínas, tales como temperatura de trabajo, velocidad de flujo, etc. Después de cada inyección de proteínas, la matriz CoCRR debe ser regenerado para su reutilización con una solución apropiada que permite la regeneración completa del sistema sin ningún daño a los receptores.

e_content "> Para demostrar que el eT desarrollado no sólo es eficaz para el estudio de las proteínas de unión de azúcar como se informó anteriormente 9, sino también para las proteínas comunes, una AHL lectina junto con dos proteínas de unión no-azúcar-mioglobina y la lisozima se utilizaron. Ellos fueron elegidos para tener una variedad de cargas en HEPES (pH 7,4):. AHL (punto isoeléctrico (pI) 6,0), mioglobina (pI 7,2) y lisozima (pI 11) En particular, como se muestra en la Figura 6, cada proteína posee una única patrón de respuesta. AHL está ligeramente cargado negativamente en HEPES. Su CEP muestra que tiene una interacción más fuerte con las CoCRRs BB2-rica cargados negativamente. Lo más probable, es debido a la interacción entre el dominio cargado positivamente de la proteína y CoCRRs BB2-ricos . Para la mioglobina, que es globalmente neutro en HEPES, no hay mucha diferencia entre las señales obtenidas con todos CoCRRs. Al comparar mioglobina en CPA a la CEPs de AHL y la lisozima, incluso a una concentración más alta de la señal es mucho lower. En cuanto a la lisozima, que está cargado positivamente en HEPES, la señal máxima se obtuvo con la CoCRR contiene BB2 puro.

Gracias a las ventajas de SPRI capaces de monitorizar en tiempo real la cinética de adsorción y desorción, para cada proteína un paisaje continua evolución 3D fue generado. Este tipo de patrón de reconocimiento en función del tiempo trae parámetros de diferenciación complementarias para el análisis de proteínas. Particularmente, podría ser extremadamente útil para el análisis de dos analitos que presentan la afinidad similar para un conjunto de CoCRRs pero que difieren en su cinética de interacción. Como se muestra en la Figura 7, los cels son fácilmente distinguibles. Estos resultados muestran que la interacción de las tres proteínas con las CoCRRs depende de sus características superficiales, tales como la distribución de residuos de aminoácidos hidrófobos, neutros y cargados. Tanto CEP y CEL se pueden utilizar como "huellas digitales" para la discriminación de proteínas y prospecidentificación tiva. Por lo tanto, el eT es eficaz para el análisis de proteínas comunes.

El protocolo descrito en este documento utiliza un enfoque combinatoria para construir el eT para el análisis de proteínas. A diferencia de otros enfoques que utilizan una serie de moléculas que son estructuralmente complicado y laborioso para sintetizar, se utilizaron sólo dos pequeñas moléculas para preparar la matriz cruzada del receptor reactivo capaz de diferenciación de las proteínas con buena resolución en el actual estudio. Además, de acuerdo con la investigación previa, el eT es estable, reproducible y reutilizable 9. Además, SPRI permite monitorizar eventos de unión en tiempo real y la generación de nuevos patrones de reconocimiento continuo con una fiabilidad sin precedentes. En un futuro próximo, BBs adicionales con propiedades fisicoquímicas complementarias serán introducidos para aumentar la diversidad de la CoCRR en las matrices para el análisis de mezclas complejas en líquido o en gas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

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References

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