Língua Eletrônica Geração de padrões contínuos reconhecimento para análise de proteínas

Bioengineering

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Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

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Abstract

Introduction

Métodos de detecção de proteínas precisas e rápidas são muito importantes no diagnóstico e proteômica médicos. Matrizes de detecção de proteínas clássicos, tais como biochips, baseiam-se no princípio do reconhecimento "lock-e-chave" e requerem receptores específicos, tais como anticorpos, aptâmeros, ou miméticos.

Nos últimos anos, o diferencial de sensoriamento inspirado pelo olfato humano e gustação surgiu como uma alternativa 1. Este nariz / língua eletrônica (EN / ET) abordagem é baseada na ligação dos analitos a uma série de receptores de reação cruzada (CRRs), que não precisam ser altamente específica ou selectiva para as moléculas-alvo diferencial, assim, permitir a superar o laborioso processo de desenvolvimento altamente selectivos receptores. É a resposta combinada de todos os receptores que cria um padrão distinto para cada uma das amostras, como uma impressão digital, permitindo a sua identificação.

Os dois principais desafios para o desenvolvimento de electronic nariz / lingueta para a detecção de proteína são eficazes na produção de elementos sensores que têm a capacidade de distinguir entre os analitos estruturalmente semelhantes, e o sistema de transdução apropriado para o evento de ligação. Até agora, os estudos relataram várias abordagens para o desenvolvimento de matriz 2. Por exemplo, num estudo de uma identificação à base de proteínas de matriz foi desenvolvido usando CRRs preparados a partir de derivados de tetra-carboxyphenylporphyrin por acoplamento de grupos carboxilo para vários aminoácidos ou dipéptidos para proporcionar receptores diferenciais possuindo um núcleo hidrofóbico de afinidade para as proteínas e as periferias carregadas para distintos transmitir diferencial obrigatório. Usando este sistema, as proteínas diferentes e misturas de proteínas foram identificadas através da medição da fluorescência de têmpera dos receptores após interacção com os analitos 3,4. Em outro estudo, uma biblioteca de 29 CRRs contendo tripéptido e radicais de ácidos borónicos sintetizado de uma forma combinatória num hexasubstituído andaime benzeno foi desenvolvido para a detecção de proteínas com uma detecção colorimétrica indicador de absorção de 5,6. Com uma tal concepção, cada receptor demonstrou a capacidade de ligação diferencial com proteínas com base na variância nos braços de péptidos, e dos ácidos borónicos assistidas em diferenciação de proteínas de glicoproteínas. Mais recentemente, uma matriz composta de diferentes catiónicos funcionalizado nanopartículas de ouro conjugadas com um poli aniónico fluorescente polímero (p-phenyleneethynylene) (PPE) foi desenvolvido para detectar e identificar proteínas 7. A ligação competitiva entre analitos de proteína e temperada de EPI complexos de nanopartículas / ouro regeneradas fluorescência, produzindo padrões de reconhecimento distintos para as proteínas. Neste estudo, as interacções proteína-nanopartícula funcionalizados foram ajustadas variando as propriedades físico-químicas dos grupos terminais de nanopartículas. Além disso, demonstrou-se que esta abordagem é eficaz para análise de proteínas em meio complexo rico e proteína talcomo soro humano em concentrações fisiologicamente relevantes, demonstrando assim o potencial de eT em perfis de amostras reais para o diagnóstico de estados de doença 8.

Apesar de muito promissora, estes sistemas têm algumas limitações inerentes. Eles exigem projetar e sintetizar 5-29 CRRs com estruturas bastante complexas. Além disso, ao contrário do sistema olfactivo que é reposto depois de cada medição, a detecção de proteínas requer a preparação de uma matriz por amostra. Finalmente, monitorando eventos de ligação em tempo real são extremamente difíceis.

Neste contexto, uma abordagem combinatória foi proposta por meio de um pequeno número de moléculas simples e facilmente acessíveis com diferentes propriedades físico-químicas (hidrofílicas, hidrofóbicas, de carga positiva, carregada negativamente, neutro, etc.) Como blocos de construção (BBS) 9. Ao misturar BBs em diferentes proporções e controladas e permitindo que as misturas para auto-montar sobre a superfície de ouro de umprisma, uma disposição de superfícies combinatórias que caracterizam as propriedades adequadas para a proteína de ligação foi criado. Notavelmente, as monocamadas auto-montadas sobre este sistema de permitir ajuste fácil de uma variedade de propriedades de superfície de uma forma altamente divergente, permitindo diversos receptores de reacção cruzada (CoCRRs combinatórias) para ser rápida e eficientemente produzido. Detecção das proteínas foi realizada utilizando um sistema de detecção óptica, a superfície de ressonância de plasmon (SPRI). Resumidamente, uma ampla do feixe de luz polarizada monocromática a partir de um diodo emissor de luz ilumina toda a área de matriz CoCRR sobre a superfície do prisma. A câmera de alta resolução de vídeo CCD fornece imagens diferença em tempo real em todos os pontos da matriz CoCRR. Ele captura todas as alterações locais na superfície da matriz CoCRR fornecendo informações detalhadas sobre os eventos de ligação e processos cinéticos 10. Enquanto isso, com a ajuda de software de imagem, imagens SPR correspondentes aos pontos são automaticamente convertidos em variações de refletividade versus de tempo, gerando uma série de curvas de ligação cinética chamados sensorgramas. Assim, SPRI permite uma observação, síncrona, em paralelo, livre de marcador e em tempo real de eventos de ligação. Além disso, a matriz CoCRR obtido é regenerável e reutilizável para análise de proteínas.

Este protocolo descreve a construção da língua electrónico através de apenas duas pequenas moléculas como blocos de construção e ilustra a sua aplicação para a análise de proteínas comuns com base em padrões de reconhecimento contínuos obtidos com SPRI.

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Protocol

1: Preparação de várias soluções e as amostras de proteínas

  1. Preparar 100 ml de solução tampão de fosfato (PBS-G), que contém 50 mM de NaH 2 PO 4, 50 mM de NaCl, e 10% de glicerol a pH 6,8.
  2. Preparar 250 ml de solução tampão HEPES contendo 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20 a pH 7,4.
  3. Preparar a solução estoque de bloco 1 (BB1) lactose e bloco 2 (BB2) sulfatada lactose (Figura 1) em 0,2 mM em PBS-G.
  4. Prepare 1 ml de soluções de proteína em HEPES: Uma lectina raque hypogaea (AHL) a 500 nm, a mioglobina a 1 uM, e lisozima em 500 nM.
  5. Preparar 20 ml de SDS a 1% em água ultrapura.

2: Preparação da Matriz CoCRR

  1. Limpar a superfície de ouro do prisma 48 h antes da utilização com um líquido de limpeza de plasma durante 3 min nas seguintes condições: 75% de oxigénio, 25% de árgon, 0,6 mbar, potência a 40 W.
  2. Prepare onze solutio puro e misturadons de BB1 ​​e BB2 com [BB1] / ([BB1] + [BB2]) relações entre 0 e 100%, em incrementos de 10% numa concentração total BB de 0,1 mM em PBS-G.
  3. Depósito 8 gotas nl destas soluções puras e mistas na superfície do prisma através de um observador não-contato em quadruplicado para cada relação, com 44 pontos no total (Figura 2).
    NOTA: 10% de glicerol em PBS-G é muito importante para reduzir a evaporação do solvente e a alteração da concentração de BB após a deposição.
  4. Inserir o prisma dentro de um prato de Petri contendo 1 ml de água ultrapura e deixá-lo O / N à temperatura ambiente durante a auto-montagem de BB1 ​​e BB2 sobre a superfície de ouro. Aqui, assume-se que a composição média de superfície na mistura SAM reflecte a composição da solução mista, a deposição de (Figura 3) 11.
  5. Lave bem o prisma com água ultrapura e seque-a sob um fluxo de argônio.

3. Protein Sensing por SPRI

  1. Defina o incubator em que o aparelho SPRI é colocado a 25 ° C, para evitar alterações de índice de refracção induzidas por variação da temperatura durante a detecção da proteína.
  2. Inserir um prisma não-funcionalizado de lavagem em 10 mL de éter do poliéter-cetona (PEEK), célula de fluxo ligado a uma bomba de seringa controlada por computador, um desgaseificador e uma válvula de injecção de média pressão 6-porta (Figura 4). Preencha o sistema de fluxo com recém filtrados e desgaseificados correndo HEPES tampão.
  3. Remover o prisma enxaguamento e inserir o prisma que contém a matriz CoCRR na célula de fluxo. Executar HEPES a uma taxa de fluxo de 100 mL / min. Com a ajuda da câmara CCD de remover as bolhas de ar presentes na superfície do prisma, através da passagem de tampão rodando rapidamente.
  4. Definir a área de estudo para cada ponto de desenho de um círculo com o mesmo diâmetro para a zona de interesse com base numa imagem de bom contraste a matriz e com a ajuda do software integrado no sistema SPRI.
  5. Traçar curvas de plasmons, que representam refletirivity curvas em função do ângulo de incidência, para todos os pontos.
  6. Escolha o ângulo (posição na qual curvas cinéticas será gravado) que trabalham na maior inclinação das curvas de refletividade. Gire o espelho de varredura para corrigir o ângulo de trabalho selecionado para medições cinéticas.
  7. Continuar a correr através do sistema de HEPES fluxo até que a reflectividade do sinal para todos os pontos é estável e constante.
  8. Injectar 1 mL de solução de AHL com uma seringa para dentro do circuito da amostra (500 ul) com a válvula de injecção na posição de "carga". Em seguida, coloque a válvula de injeção para a posição "injeção". A taxa de fluxo utilizada para toda a injecção de proteína foi de 100 ul / min.
  9. Comece medidas cinéticas por monitorar variações de refletividade contra o tempo simultaneamente em todos os pontos.
  10. No final da injeção de proteína, lavar a matriz com tampão de corrida para 8 min. Finalmente, injectam-se 1 ml de 1% de SDS a regenerá-lo.
  11. Repetir o mesmo procedimento para a outra proteins.

4 Processamento de Dados e Análise

  1. Após a entrada da solução de proteína na célula de fluxo, ligação molecular ocorre e induz uma mudança das curvas de plasmon e uma variação da reflectividade. O software de aquisição de imagem converte os valores de intensidade de luz medidos os níveis de cinzento da escala, dando imagens SPR Figura 5A, e gera a variação da ref lectividade em função do tempo, dando sensorgramas (Figura 5B).
  2. Use um software de computação matemática para traçar a refletividade (R%) no final de cada injeção de proteína em relação ao [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Relação de gerar perfil 2D contínua evolução (CEP) para cada amostra (Figura 5C).
  3. Adicionar o [BB1] / ([BB1] + [BB2]) em relação sensorgramas (Figura 5B) para gerar 3D paisagem evolução contínua (CEL) para cada uma das proteínas (Figura 5D).

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Representative Results

Para investigar a possibilidade de a lingueta electrónica para análise de proteína comum, foram usadas três proteínas: AHL, mioglobina e lisozima. Para cada proteína, um perfil 2D distinta contínua evolução, PEC foi gerado pelo eT, como mostrado na Figura 6.

Além disso, graças à SPRI, que é capaz de controlar os adsorção e dessorção cinética em tempo real, para cada uma proteína padrão de reconhecimento contínuo dependente do tempo, denominado 3D paisagem evolução contínua (CEL), foi gerado. Na Figura 7, Cels característicos destas três proteínas são mostrados.

Figura 1
Estruturas Figura 1 químicas dos dois blocos de construção utilizados neste protocolo para preparar a matriz CoCRR.51901 / "target =" 51901fig1highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 Uma foto de um prisma depois de depositar os 44 gotas das soluções puras e mistas de BB1 e BB2 usando um não-contato piezoelétrico spotter com cada relação em quadruplicado. O prisma foi colocado ao lado de um tubo Eppendorf de 1,5 ml.

Figura 3
Figura 3 ilustração esquemática da matriz contendo 11 CoCRR receptores diferenciais que foram preparados com soluções puras e mistas de BB1 e BB2 em várias proporções e permitindo que as misturas para a auto-montagem em ouro a surface do prisma.

Figura 4
Figura 4 Desenho esquemático do sistema de detecção SPRI combinado com um sistema de microfluidos.

Figura 5
Figura 5 Ilustração esquemática do tratamento de dados para a geração de dois tipos de padrão de reconhecimento contínuo com desenvolvida língua eletrônica: perfil evolução contínua 2D e 3D contínua evolução da paisagem.

Figura 6
Figura 6 Continuous perfis de evolução para três proteínas puras:. AHL (500 nM), mioglobina (1 uM), e lisozima (500 nM) foram gerados através da representação gráfica da variação da reflectividade (R%) no fim da injecção de proteína versus a [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) ratio.

Figura 7
Figura 7 Paisagem de gosto: Cels 3D característicos da AHL, a mioglobina e lisozima gerada pela língua eletrônica.

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Discussion

Os passos mais críticos para a construção deste eT são dedicados a garantir uma boa reprodutibilidade do sistema. Por exemplo, a limpeza da superfície de ouro do prisma com um procedimento normalizado antes da utilização, a adição de 10% de glicerol em onze soluções puras e mistas de BB1 ​​e BB2 para eliminar a evaporação do solvente durante o BBS de auto-montagem em ouro na superfície do prisma, depositando várias repetições para cada [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Relação, etc. Tal como para a detecção da proteína por SPRI, a escolha do ângulo de trabalho é crítica. Normalmente, este é fixado na maior inclinação das curvas de refletividade. Além disso, é muito importante utilizar condições experimentais normalizadas para cada detecção de proteínas, tais como a temperatura de trabalho, a taxa de fluxo, etc. Depois de cada injecção de proteínas, a matriz CoCRR deve ser regenerado para ser reutilizado com uma solução adequada que permite a regeneração completa do sistema, sem qualquer dano para os receptores.

e_content "> Para demonstrar que o eT desenvolvida não é apenas eficaz, para o estudo de proteínas de ligação de açúcar como previamente relatado 9, mas também para proteínas comuns, uma lectina a AHL em conjunto com duas proteínas de ligação não--açúcar mioglobina e lisozima foram usadas. Eles Foram escolhidos para terem uma variedade de taxas de HEPES (pH 7,4):. AHL (ponto isoeléctrico (pi) 6.0), mioglobina (pI 7,2) e lisozima (11 pi) Nomeadamente, como mostrado na Figura 6, cada proteína possui uma única padrão de resposta. AHL é ligeiramente carregada negativamente em HEPES. seu CEP mostra que tem maior interação com os CoCRRs rico em BB2 carregadas negativamente. Provavelmente, isso se deve à interação entre o domínio de carga positiva da proteína e CoCRRs BB2-ricos . Para mioglobina, que é globalmente neutro em HEPES, não há muita diferença entre os sinais obtidos com todos os CoCRRs. Ao comparar mioglobina no CEP para os CEPs de AHL e lisozima, mesmo com uma concentração mais elevada do sinal é muito lower. Tal como para a lisozima, a qual é carregada positivamente em HEPES, o sinal de máxima foi obtida com o CoCRR contendo BB2 puro.

Graças às vantagens da SPRI capazes de monitorar os adsorção e dessorção cinética em tempo real, para cada proteína a contínua evolução da paisagem 3D foi gerada. Este tipo de reconhecimento de padrões em função do tempo traz parâmetros complementares de diferenciação para análise de proteínas. Particularmente, pode ser extremamente útil para a análise de dois analitos que apresentam a afinidade semelhante para um conjunto de CoCRRs mas que diferem na sua cinética de interacção. Como mostrado na Figura 7, os Cels são facilmente distinguíveis. Estes resultados demonstram que a interacção das proteínas com as três CoCRRs é dependente das suas características de superfície, tais como a distribuição de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, neutras e carregadas. Ambos CEP e CEL pode ser utilizado como "impressões digitais" para a discriminação de proteína e prospecidentificação tiva. Assim, o eT é eficaz para análise de proteínas comuns.

O protocolo aqui descrito utiliza uma abordagem combinatória para construir o eT para análise de proteínas. Ao contrário de outras abordagens que utilizam uma série de moléculas que são estruturalmente complicado e trabalhoso, para sintetizar, apenas duas pequenas moléculas foram usadas para preparar a matriz de receptor de reacção cruzada de proteínas capazes de se diferenciarem com boa resolução em estudo. Além disso, de acordo com o inquérito anterior, a eT é estável, reprodutível e reutilizável 9. Além disso, SPRI permite monitorar eventos de ligação em tempo real e gerando novos padrões de reconhecimento contínuos com confiabilidade sem precedentes. Num futuro próximo, BBs adicionais com propriedades físico-químicas complementares serão introduzidas para aumentar a diversidade da CoCRR nas matrizes para a análise de misturas complexas em gás líquido ou em.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

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References

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