Protein Analiz Sürekli Tanıma Desenler oluşturma Elektronik Dil

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hassas ve hızlı protein algılama yöntemleri tıbbi teşhis ve Proteomikte çok önemlidir. Böyle bioçipler gibi klasik protein-tespit diziler, "kilit ve anahtar" tanıma ilkesine dayalı ve bu aptamers, antikorlar, veya taklitçi gibi belirli reseptörleri gerektirir.

Son yıllarda, insan koku duyusunun ve tadına bakma esinlenerek diferansiyel algılama alternatif 1 olarak ortaya çıkmıştır. Bu elektronik burun / dil (eN / eT) yaklaşımı hedef moleküller için son derece spesifik veya seçici olması gerekmez çapraz-reaktif reseptörleri (crrs), bir dizi Analitlerin farklı bağlanmanın dayanmaktadır böylece zahmetli aşmak için izin yüksek ölçüde seçici reseptörleri geliştirme süreci. Onun teşhisine izin veren, bir parmak izi gibi, her bir örnek için ayrı bir desen oluşturur tüm reseptörlerinin birleşik yanıttır.

ELEC gelişimi için iki önemli zorluklaretkin bir protein algılama tronic burun / yay yapısal olarak benzer bir analit ve bağlanma olayı için uygun olan iletim sistemine arasında ayrım yeteneğine sahip algılama elemanlarının üretimi. Şimdiye kadar yapılan çalışmalar dizi gelişme 2 için çeşitli yaklaşımlar bildirdi. Bir çalışmada Örneğin proteinlerin bir dizi-bazlı kimlik çeşitli amino asitler veya proteinler ve ücret için farklı çevresel birimlere afinite için bir hidrofobik çekirdeğin sahip diferansiyel reseptörleri sağlamak dipeptidlerin için karboksil grupların birleştirilmesi ile, tetra-carboxyphenylporphyrin türevlerinden hazırlanabilir crrs kullanılarak geliştirilmiştir kazandıran farklı bağlama. Bu sistemi kullanarak, farklı proteinler ve protein karışımları analitlerle etkileşimin ardından 3,4 reseptörlerinin floresanlık sönmesini ölçülerek tespit edilmiştir. Başka bir çalışmada, hexasubsti bir birleştirici şekilde sentezlendi, tripeptid ve boronik asit kısımları içeren 29 crrs oluşan bir kütüphanedeğiştirilmemiş benzen iskele bir göstergesi alım kolorimetrik algılama 5,6 proteinleri algılama için geliştirilmiştir. Böyle bir tasarımla, her reseptör glikoproteinlerden proteinlerinin ayrımında destekli peptid kollardaki varyans göre protein ve boronik asitler ile farklı bağlama kapasitesini göstermiştir. Daha yakın zamanda, bir anyonik floresan polimer poli (p-phenyleneethynylene) (PPE) konjüge edilmiş farklı katyonik fonksiyonalize altın nanopartiküllerinin oluşan bir dizi tespit etmek ve tanımlamak için proteinleri 7 oluşturuldu. Rekabetçi protein için farklı tanıma desen üreten bir protein analit arasındaki bağlanma ve floresan yeniden PPE / altın nano partiküler kompleksleri söndürüldü. Bu çalışmada, fonksiyonalize nanopartikül-protein etkileşimleri nanopartikül uç gruplarının fizikokimyasal özellikleri değiştirilerek ayarlanmıştır. Ayrıca bu yaklaşım, karmaşık ve protein açısından zengin bir ortamda bu protein analizi için etkili olduğu gösterilmiştirfizyolojik ilgili konsantrasyonlarda insan serumu gibi, böylece hastalık durumlarının 8 teşhisi için gerçek örnekleri profil olarak eT potansiyelini gösteren.

Çok umut verici olsa da, bu sistemler bazı sınırlamaları vardır. Onlar tasarımı ve oldukça karmaşık yapılara sahip 5 ila 29 crrs sentezlenmesi gerektirir. Buna ek olarak, her bir ölçüm takip sıfırlanır koku sistemi farklı olarak, protein, numune başına bir algılama dizisi hazırlamak gerekir. Son olarak, gerçek zaman bağlanma olguları arasında son derece zordur.

Bu bağlamda, bir kombinatoryal yaklaşım, farklı fiziko-kimyasal özelliklere sahip, basit ve kolayca erişilebilir moleküllerinin küçük bir numara kullanarak sürülmüştür (negatif yüklü bir nötr, pozitif yüklü, hidrofilik, hidrofobik, vb.) Yapı blokları (BB) 9 gibi. Ile karışımlar değişen BBS ve kontrollü oranlarda karıştırılması ve izin vererek bir altın yüzey tarafından monteprizma, protein bağlanması için uygun özelliklere sahip birleşik yüzeyler bir dizi oluşturuldu. Özellikle, bu sistem üzerindeki kendinden düzenlenen tek tabakalar, hızlı ve verimli bir şekilde üretilebilir olması için çeşitli birleştirici çapraz-reaktif reseptörleri (CoCRRs) sağlayacak şekilde, son derece farklı bir şekilde yüzey özellikleri, bir dizi kolay bir ayarlama sağlar. Protein algılama optik tespit sistemi kullanılarak gerçekleştirildi, plazmon rezonans görüntüleme (SPRI) yüzey. Kısaca, bir LED'den gelen geniş bir ışın, polarize ışık monokromatik prizma yüzeyi üzerindeki bütün CoCRR dizi aydınlatır. Bir yüksek çözünürlüklü CCD video kamera CoCRR dizinin bütün noktalar arasında gerçek-zamanlı farkı görüntüler sağlar. Bu bağlayıcı olaylar ve kinetik süreçler 10 hakkında detaylı bilgi veren CoCRR dizinin yüzeyinde yerel tüm değişiklikleri yakalar. Bu arada, görüntüleme yazılımı yardımı ile, noktalar karşılık SPR görüntüleri otomatik olarak yansıtma Versu varyasyonları dönüştürülürSensogramlar adı verilen kinetik bağlanma eğrileri, bir dizi üreten bir zaman. Bu nedenle, bağlama SPRI etkinlikleri etiketi içermeyen, eş zamanlı, paralel ve gerçek zamanlı gözlem sağlar. Ayrıca, elde edilen CoCRR dizi protein analizi için yeniden üretilebilir ve tekrar kullanılabilir.

Bu protokol, yapı blokları olarak sadece iki küçük molekülleri kullanarak elektronik dil birlikteliğinin yapımını da açıklar ve SPRI ile elde edilen kesintisiz tanıma kalıpları temel alan ortak proteinlerin analizi için uygulanmasını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çeşitli Çözümleri ve Protein Örneklerinin 1. Hazırlık

  1. , 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl ihtiva eden fosfat tampon çözeltisi (PBS-G) 100 mi, pH 6.8 'de% 10 gliserol hazırlayın.
  2. PH 7.4 olan 10 mM HEPES, 150 mM NaCl,% 0.005 Tween 20 içeren HEPES tampon çözeltisi 250 ml hazırlayın.
  3. PBS-G 0.2 mM'de laktoz (Şekil 1) sülfatlanmış yapı bloğunun 1 (BB1), laktoz ve yapı taşı 2 (BB2) içinde bir stok çözelti hazırlayın.
  4. 1 uM A rakis hypogaea lektin (AHL) 500 nM, miyoglobin de ve 500 nM'de lisozim: HEPES, protein çözeltisinin 1 ml hazırlayın.
  5. Ultra-saf su içinde% 1 SDS ile 20 ml hazırlayın.

CoCRR Array 2. Hazırlık

  1. % 75 oksijen,% 25 argon, 0.6 mbar, gücü 40 W: Bu koşullar altında 3 dakika boyunca plazma temizleyici ile kullanımdan önce 48 saat prizma altın yüzeyini temizleyin
  2. Onbir saf ve karışık Solutio hazırlayın[BB1] / ile BB1 ​​ve BB2 ns ([BB1] + [BB2]), PBS-G içinde 0,1 mM toplam bb konsantrasyonda% 10 artışlar ile, 0 ile% 100 arasında oranları.
  3. Depozit toplam 44 noktanın (Şekil 2), her oran için dört kat olarak temassız bir gözcü kullanılarak prizma yüzeyi üzerindeki bu saf ve karışık çözümler 8 nl damlacıkları.
    Not: PBS-G çözeltisine,% 10 gliserol, solvent buharlaşması ve çökelme sonrası bb konsantrasyon değişimini azaltmak için çok önemlidir.
  4. Ultra saf su 1 ml içeren bir Petri kabı içinde prizma yerleştirin ve altın yüzeyde BB1 ​​ve BB2 kendini düzenlemesinden RT'de göre O / N bırakın. Burada, bu karışık SAM ortalama yüzey bileşimi yerleştirme karıştırılmış çözeltisinin bileşimi (Şekil 3) 11 yansıttığı varsayılmaktadır.
  5. Ultra-saf su ile iyice yıkayın ve daha sonra prizmanın bir argon akışı altında kurutun.

3. Protein Algılama SPRI tarafından

  1. Incubato ayarlayınR'nin SPRI cihaz, protein algılama sırasında sıcaklık değişiminin neden olduğu kırılma indeksi değişiklikleri önlemek için 25 ° C sıcaklıkta yerleştirilir.
  2. (PEEK), bir bilgisayar kontrollü bir şırınga pompası, gaz alıcı ve 6 bağlantı noktası, orta basınçlı enjeksiyon valfına bağlanan akış hücresinin (Şekil 4) 10 ul polieter eter keton olmayan bir işlevselleştirilmiş durulama prizma yerleştirin. Taze süzülmüş ve tampon HEPES çalışan degaze ile akış sistemi doldurun.
  3. Durulama prizma çıkarın ve akış hücresi CoCRR dizi içeren prizma yerleştirin. 100 ul / dakika akış hızında, HEPES. CCD kamera yardımı ile hızlı çalışan tampon geçirilerek prizma yüzeyi üzerinde mevcut olan hava kabarcıklarını.
  4. Dizinin iyi bir tezat görüntü ve SPRI sistemine entegre yazılım yardımı ile esaslı ilgi alanı için aynı çapa sahip bir daire çizerek, her nokta için çalışma alanı tanımlayın.
  5. Yansıtan temsil plazmon eğrileri, İztüm noktalar için olay açısı, fonksiyonunda ivity eğrileri.
  6. Yansıtma eğrilerinin en yüksek yamacında çalışma açısının (kinetik eğrileri kaydedilmiş olacak hangi pozisyon) seçin. Kinetik ölçümleri için seçilen çalışma açısına düzeltmek için tarama ayna döndürün.
  7. Tüm noktalar için yansıma sinyal istikrarlı ve sürekli kadar akış sisteminde HEPES çalışmaya devam eder.
  8. Konumu "yük" enjeksiyon valfi ile numune döngü (500 ul) içine şırınga ile 1 ml AHL çözüm enjekte. Ardından "enjeksiyon" konumuna enjeksiyon valfi koydu. Tüm protein enjeksiyonu için kullanılan akış hızı 100 ml / dak idi.
  9. Tüm noktalar aynı anda zamana karşı yansıtma değişimlerini izleyerek kinetik ölçümler başlayın.
  10. Proteini enjekte sonunda, 8 dakika boyunca tampon maddesi ile dizi yıkayın. Son olarak, yeniden 1 ml% 1 SDS ile enjekte edilir.
  11. Diğer p için aynı prosedürü tekrarlayınroteinler.

4. Veri İşleme ve Analizi

  1. Akış hücreye protein çözeltisi girişi sonra, bağlayıcı molekül ortaya çıkar ve plazmon eğrilerinin bir kayma ve yansıtma bir varyasyonunu neden olur. Adı geçen görüntü edinim program sensogramlarını (Şekil 5B) vererek SPR görsel Şekil 5A verir gri skala seviyelerinin, ölçülen ışık şiddeti değerleri dönüştürür ve zamana karşı yansıtma değişimini üretir.
  2. [BB1] karşı her proteini enjekte sonunda yansıtma (R%) çizmek için bir matematik bilgisayar yazılımını kullanın / ([BB1] + [BB2]) Her bir numune için 2D sürekli evrim profili (CEP) oluşturmak için oranı (Şekil 5C).
  3. [BB1] / ([BB1] + [BB2]) sensörgramlar içinde oranı Ekle (Şekil 5B) her proteinin (Şekil 5D) için 3D sürekli evrim manzara (CEL) oluşturmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ortak protein analizi için elektronik dil yeteneğini prob, üç proteinler kullanıldı: AHL, miyoglobin ve lizozomunu. Şekil 6'da gösterildiği gibi, her bir protein için, ayrı bir 2D sürekli bir gelişim profil CEP, ve arkadaşları tarafından elde edilmiştir.

Buna ek olarak, her bir protein için, zamana bağlı bir sürekli model tanıma gerçek zamanlı adsorpsiyon ve desorpsiyon kinetiğini takip edebilir SPRI, sayesinde, 3D sürekli evrim yatay (CEL) oluşturuldu denir. Şekil 7'de, bu üç karakteristik proteinlerin cels gösterilmiştir.

Şekil 1
Bu protokolde kullanılan iki yapı taşlarından Şekil 1. Kimyasal yapıları CoCRR dizi hazırlamak için.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2
Şekil 2, dört kere, her oranına sahip bir temassız piezoelektrik gözcü kullanarak BB1 ve BB2 saf ve karışık çözeltilerinin 44 damlacıkları yatırma sonra prizma bir verilmedi. Prizma 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpü yanında yerleştirilmiştir.

Şekil 3,
Için çeşitli oranlarda karışımları ve BB1 BB2 saf ve karışık çözeltileri hazırlanmıştır diferansiyel 11 reseptörlerini içeren ve sağlayan CoCRR dizinin Şekil 3 şematik gösterimi altın sürülür öz monteprizma yüzü.

Şekil 4
Microfluidic sistemi ile kombine SPRI algılama sistemi 4. şematik gösterimini Şekil.

Şekil 5,
2B sürekli evrim profili ve 3D sürekli evrim manzara: gelişmiş elektronik dil ile sürekli tanıma desen iki tip nesil veri tedavisinin Şekil 5. şematik gösterimi.

Şekil 6,
Şekil 6. continuouEvrim s profilleri üç saf proteinler için:. AHL (500 nM), miyoglobin (1 uM) ve lisozim (500 nM), Bunlar [BB1 karşı proteini enjekte sonunda yansıtma (R%) değişimini çizilmesi ile oluşturulmuştur ] / ([BB1] + [BB2]) oranı.

Şekil 7
Tat 7. Yatay Şekil: elektronik dil tarafından üretilen AHL, miyoglobin ve lizozim karakteristik 3D Kareleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu eT yapımı için en kritik adımlar sisteminin iyi tekrarlanabilirlik sağlamak için varız. Örneğin, BB1 ve BB2 ait on saf ve karışık solüsyonlarda gliserol% 10 unu ilave, kullanımdan önce, standart bir prosedür ile prizma altın yüzey temizleme BB prizma altın yüzey üzerinde kendi kendine montaj sırasında çözücü buharlaşmasını önlemek için, Her [BB1] için birden çok tekrar / ([BB1] + [BB2]) oranı, vs bırakılması. SPRI protein tespiti için olduğu gibi, çalışma açısının seçimi kritiktir. Genellikle, bu yansıtma eğrilerinin en yüksek eğiminde sabitlenir. Buna ek olarak, bu gibi çalışma sıcaklığı, akış hızı, her bir protein tespiti için standart deney koşulları, kullanımı çok önemlidir. Her bir protein enjeksiyonundan sonra, CoCRR dizi reseptörlerine herhangi bir zarar vermeden, sistemin tüm tekrar üretimine olanak sağlayan uygun bir solüsyon ile yeniden kullanım için yeniden oluşturulmalıdır.

e_content "> kullanılan iki olmayan şeker bağlayıcı proteinler miyoglobin ve lisozim ile bir lektin AHL birlikte, ortak bir protein ayrıca geliştirilmiş eT, daha önce 9 Başka şeker bağlayıcı proteinlerin çalışma için tek etkili olmadığını göstermektedir, ancak bunlarla Bunlar. HEPES (pH 7.4) içinde çeşitli ücretler için seçilmiştir:., Şekil 6'da gösterildiği gibi, AHL (izoelektrik noktası (pl) 6.0), miyoglobin (pl 7.2) ve lisozim (pl 11) Özellikle, her bir protein benzersiz bir sahiptir yanıt modeli. AHL biraz negatif HEPES şarj edilir. onun CEP bu negatif yüklü BB2 zengin CoCRRs daha güçlü bir etkileşim olduğunu gösterir. Büyük olasılıkla, bu proteinin pozitif yüklü etki alanı ve BB2 zengin CoCRRs arasındaki etkileşim nedeniyle Hatta daha yüksek bir konsantrasyonda, AHL ve lizozim CEP'lerın için CEP içinde miyoglobin kıyaslarken. HEPES'te küresel nötr miyoglobin, için, tüm CoCRRs elde sinyaller arasında pek fark yoktur. sinyal çok lo olduğunuwer. HEPES, pozitif yüklü bir lisozim için olduğu gibi, maksimum sinyal saf BB2 içeren CoCRR elde edildi.

3B sürekli bir gelişim manzara oluşturulan her bir protein için, gerçek zamanlı adsorpsiyon ve desorpsiyon kinetikleri takip edebilen SPRI avantajlar sayesinde. Zamana bağlı tanınma özelliğinin Bu tür bir protein analizi için ek parametrelerin farklılaşması getirir. Özellikle, iki analitlerin CoCRRs bir dizi için benzer afinitesi gösteren fakat etkileşim kinetikleri farklı analiz için son derece yararlı olabilir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, cels kolayca ayırt edilebilir. Bu sonuçlar CoCRRs ile üç proteinin etkileşim, hidrofobik nötr ve yüklü amino asit kalıntılarının, dağıtım olarak yüzey özelliklerine bağlı olduğunu göstermektedir. CEP ve CEL Hem protein ayrımcılık ve ProSpec için "parmak izi" olarak kullanılabilirtif tanımlama. Bu nedenle, ortak eT proteinlerinin analizi için etkilidir.

Burada tarif edilen protokol protein analizi için ET oluşturmak için kombinatoryal yaklaşım kullanır. Sentezlemek için yapısal olarak karmaşık ve zahmetli olan moleküllerin bir dizi kullanan diğer yaklaşımlardan farklı olarak, sadece iki küçük moleküller, bu çalışmada iyi bir çözünürlüğe sahip proteinleri ayırt edebilen, çapraz-reaktif bir dizi reseptör hazırlamak için kullanıldı. Ayrıca, önceki araştırmaya göre, ET, tekrar üretilebilir ve kararlı 9 tekrar kullanılabilir. Ayrıca, Spri gerçek zamanlı olarak bağlayıcı olayları izleme ve görülmemiş güvenilirliği ile yeni sürekli tanıma modellerini üretme sağlar. Yakın gelecekte, tamamlayıcı fizikokimyasal özellikleri ile ek BBs sıvı veya gaz kompleks karışımların analizi için dizilerde CoCRR çeşitliliğini artırmak için tanıtılacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
  3. Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
  4. Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
  5. Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
  6. Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
  7. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
  8. De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
  9. Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
  10. Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
  11. Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics