El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hay vincular y regeneración de tissuesis uno de themain objetivos de la ciencia médica porque una lesión en un tejido ororgan puede ser incapacitante y, en algunos casos, letal. En el contexto, los trabajadores de la salud y los investigadores están buscando constantemente las técnicas, métodos y herramientas para proporcionar nueva Alternativasa terapéutica promover allí proceso par-regeneración del tejido dañado. Por lo tanto, las ciencias biomédicas se han centrado en el estudio de las células madre mesenquimales (MSCs), especialmente células madre adultas, porque este linaje de células representa un modelo ideal para estudiar el proceso de regeneración de tejidos, debido a su potencial para diferenciarse a ectodérmico, mesodérmico y endodérmico linajes de células Sin embargo, para hacer terapia con las MSC en una realidad, la caracterización del potencial thetherapeutic de MSC debe ir acompañada de la implementación de nuevas técnicas de cultivo celular utilizando biomateriales y andamios celulares que garantizan el comportamiento deseado de las MSC en el tejido del huésped.

in vitro, pero no para la extrapolación y la aplicación en sistemas abiertos complejos, tales como humano o en ensayos in vivo. Las técnicas que se centran en asegurar la adhesión celular a las topografías azar, tales como materiales de huesos porosos, han sido estudiados por la adhesión del material hasta el fondo de los pocillos de cultivo y colágenos y polímeros de agarosa empleado. Para estos métodos, las células que fueron sembradas en la superficie fueron retenidos en los poros y en la superficie superior. Sin embargo, este aspecto no se puede asegurar en un in vivosistema, en el que los fluidos corporales que rodean el biomaterial podrían arrastrar las células desde el sitio deseado en andamios porosos es el uso de la estimulación ultrasónica, que requiere un equipo sofisticado, pero promueve la expresión de marcadores osteoblásticas en ensayos in vitro 5. El uso de cultivos continuos requiere biorreactores, que garantizan una distribución homogénea de los nutrientes en el medio de cultivo; sin embargo, un porcentaje significativo de las células cultivadas se pierde cuando se reemplaza el medio de cultivo debido a la velocidad de flujo que se utiliza en esta técnica y la adherencia de medio a las paredes del equipo. Estos problemas aumentan la masa celular que es necesario para este tipo de cultivo y el tiempo para la obtención de un número suficiente de células 7. Por lo tanto, la metodología presentada en este trabajo representa una técnica que deben extrapolarse a los sistemas in vivo porque las células se siembran en micro-masa en un material de la superficie superior, y después de la appropricomió tiempos de incubación, el 60% de la masa celular inicial se adhiere. Además, esta técnica no requiere la adición de inductores osteoblásticas (por ejemplo, dexametasona, ácido ascórbico, o beta-glicerofosfato) o estímulos ultrasónicos para inducir la diferenciación osteoblástica y el mantenimiento del fenotipo de los osteoblastos porque NKB es un osteoconductor y andamios osteoinductores 8, el método para el cultivo de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSC) en el hueso biomaterial macroporoso se presenta en este trabajo representsapossibility para insertar las células en el tejido óseo dañado y inducir la diferenciación al linaje osteoblástico.

Protocol

Esta investigación se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki con respecto a la conducta ética de los seres humanos de investigación que involucra y fue aprobado por la Junta Ética de Investigación de la Facultad de Medicina de la UNAM (proyecto número 101-2012).

1. Aislamiento de mesenquimales humanas de células madre

  1. Preparación del reactivo
    1. Preparar la solución tamponada con fosfato salino (PBS) y suplemento con solución de antibiótico-antimicótico al 1%.
    2. Preparar medio de Eagle modificado por Dulbecco, alta glucosa (HG-DMEM), y añadir 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% solution.Sterilize antibiótico-antimicótico este medio de cultivo por filtración a través de un filtro de 0,2 micras.
    3. Preparar una solución de colagenasa II en 100 U / ml en HG-DMEM sin FBS o solución antibiótico-antimicótico.
    4. Esterilizar los siguientes instrumentos quirúrgicos, que son necesarios para el aislamiento, por autoclave: tijera estándars, pinzas de disección simples, de punta fina y unas pinzas dentadas y un mango de bisturí (# 4).
  2. Aislamiento de células madre mesenquimales de membrana amniótica humana
    1. Mantenga el cordón umbilical con una mano y con la otra mano, separe la membrana amniótica (MA), que se parece a una lámina translúcida, para obtener un fragmento de aproximadamente 5 cm 2. Si la sección de corion está presente en la muestra, separar el corion subyacente por disección manual de como la sección de corion es más grueso que el amnios.
    2. Eliminar la sangre residual con tres lavados de 5 ml de PBS y eliminar los coágulos con los simples pinzas. Hacer un pequeño corte en la mañana con el bisturí para generar fragmentos de aproximadamente 0,5 cm 2.
  3. La digestión enzimática de la membrana amniótica
    1. Incubar la AM con 5 ml de 0,125% de tripsina / EDTA 0,5 mM solución a 37 ° C durante 30 min en un tubo cónico de 50 ml a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Centrifugar a 250xg y 25 ° C durante 5 min y luego eliminar la solución de tripsina descartando el sobrenadante.
    2. Añadir 15 ml de solución de colagenasa tipo II y se incuba durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 con agitación ocasional de acuerdo con Leyva et al. 9
    3. Inmediatamente después de la digestión con colagenasa II, añadir 15 ml de PBS y centrifugar a 250 xg y 25 ° C durante 10 min.
    4. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 15 ml de solución de PBS y centrifugar a 250 xg y 25 ° C durante 15 min. Eliminar el sobrenadante.
    5. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM-HG agitando suavemente.
  4. Expansión de las células madre mesenquimales
    1. Semilla 2 ml de suspensión de células (1 x 10 4 células / cm 2) en frasco de cultivo, y añadir 2 ml de HG-DMEM y se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Eliminar el de células no adherentes cambiando el medio de cultivo después de 5-7día.
    2. Después de este tiempo, cambiar el medio de cultivo cada 3 días durante un período adicional de 7-10 días para obtener una confluencia celular del 90%.
    3. Recuperar las células y se incuban durante 5 minutos a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% con solución de tripsina / EDTA 0,125% (tripsina).
    4. Inmediatamente después de tripsinización, recoger las células con una pipeta y transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min.
    5. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de HG-DMEM.
    6. Cultivo en suspensión de células en dos matraces de cultivo de 75 cm 2 (5 ml en cada matraz), y mantener el cultivo hasta 90% de confluencia.
    7. Repita los pasos 1.4.3. a 1.4.6, hasta el noveno paso o subcultura.
    8. Recuperar las células por tripsinización como en los pasos 1.4.3 al 1.4.5 para citometría de flujo u otros estudios.

2. Preparación de la matriz ósea disco poroso (NKB)

  1. Para humedecer los discos NKB(Diámetro, 12 mm; espesor, 2 mm)., Incubar cada disco durante la noche con 3 ml de HG-DMEM sin ​​FBS en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C, de acuerdo con Fassina et al 5
  2. Después de que el proceso de humectación, coloque el disco en un tubo cónico de 50 ml y centrifugado a 250 xg durante 5 min para eliminar el exceso de medio de cultivo. Colocar el disco en una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
    1. Añadir 500 l de HG-DMEM y se incuba durante 30 min a 25 ° C. Asegúrese de que no hay burbujas en el disco NKB para favorecer la correcta distribución de los nutrientes y células.
    2. Si se observan burbujas en el disco, agitar y añadir 300 l de medio de cultivo y se incuba durante 15 minutos en una atmósfera húmeda de CO2 al 5% a 37 ° C. Después de este tiempo eliminar 300 l de medio de cultivo succión a través de la pared del cultivo celular bien y confirmar que no se forman burbujas.
  3. Coloque el disco en una nueva placa de 24 pocillos utilizando pinzas simples.

  1. Seed una suspensión celular (5 x 10 05 a.m.-hMSC en 100 l de HG-DMEM) a partir de tres subcultivos, en la superficie del disco biomaterial previamente mojado y se incuba durante 30 min en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 a 37 ° C. Realice este paso lentamente y de forma continua sobre la cara superior del biomaterial para permitir que las células interactúan con la topografía de todo andamio. Nota: Este procedimiento logra el 60% de las células unidas sobre el biomaterial se muestra en la Tabla 1.
  2. Añadir 1,5 ml de HG-DMEM a 37 ° C, y mantener el cultivo durante 3 días en un ambiente humidificado del 5% de CO 2 a 37 ° C. No generar turbulencia en la adición de medio de cultivo para evitar que la deposición de las células en el fondo del plato placa de cultivo. Este es el tiempo inicial.

4. Cell Marcadores de superficie Caracterización por Flow Cytometría

  1. Separe las células del subcultura antes de la siembra en el disco matriz. Utilice 0,25% de tripsina / EDTA 1 mM y fijarlos durante 30 min en helado 2% de formaldehído. Después de la fijación, se lavan las células una vez con PBS 0,05%.
  2. Bloquear la unión no específica mediante la incubación de las células con 20% de inmunoglobulina humana durante 3 min en hielo y se incuba 0,1 x 10 6 alícuotas de células con ficoeritrina (PerCP) conjugado con MAb contra CD73, FITC-conjugado MAb CD90, MAb conjugado con PE contra CD34 , FITC-conjugado MAb CD45 y PE conjugado MAb CD105 durante 1 hora a 25 ° C en la oscuridad. Corresponde con el isotipo conjugado con FITC MAb, PE-conjugado MAb andPerCP conjugado MAb servirá como controles negativos.
  3. Calcular los niveles de expresión de los marcadores de superficie utilizando el software de adquisición y análisis de datos.

5. Móvil de Detección de Adhesión por microscopía electrónica de barrido

  1. Enjuagar las muestras de células de disco a los 3 días de cultivo dos veces con PBSy fixthe muestras con 4% (v / v) de glutaraldehído solutionin un M de tampón Na-cacodilato 0,1 (pH 7,2).
  2. Preparar las muestras para la observación microscópica, como se informó anteriormente por Rivera-N et al. 10 y observar con un microscopio electrónico de barrido a un potencial eléctrico de 15 kV y con una ampliación de 500X y 2000X.

Ensayo de proliferación de la célula 6.

  1. Para las muestras de células-disco que contiene 1,5 ml de medio de cultivo, añadir 150 l de colorante vital (AB) de acuerdo con las directrices del fabricante y se incuban las células en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C.
  2. Inmediatamente después de la adición de AB (0 h) y cada 24 h hasta alcanzar los 7 días de cultivo celular, medir la absorbancia a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 600 nm.

7. unidad formadora de colonias (CFU) 11

  1. Cultura 100 células por 100 mm diskin cultivo de tejidos HG-DMEM y se incuba durante 14días en un ambiente humidificado del 5% de CO 2 a 37 ° C.
  2. Lavar el cultivo con PBS y se mancha con 0,5% de cristal violeta en metanol durante 5-10 min a temperatura ambiente.
  3. Lavar las placas con PBS dos veces y contar las colonias visibles usando un hemocitómetro.

Representative Results

Mesenquimatosas humanas aislamiento de células madre

Después de la separación mecánica de la AM desde el corion usando disección roma (Figura 1), una población de células adherentes se obtuvo por la tripsina y la colagenasa II digestión. Estas poblaciones de células unidas en la placa de cultivo Presenta similar a fibroblastos morfología de las células a los 3 días después de aislamiento como se muestra en la micrografía óptica (Figura 2A) y micrografía electrónica de barrido (Figura 2B) .Las placentas utilizados en este trabajo fueron obtenidos de madres donantes sanos withprevious consentimiento informado.

Caracterización de la célula mediante citometría de flujo

La población de células que se obtuvo de la AM era fuertemente reactiva a la marcadores mesenquimales superficie CD90 + (93,5% ± 6,85) y CD73 + y CD105 + (79% ± 3,46) y mostró una reacción negativa a marcadores hematopoyéticos tales como CD34 y CD45. Por lo tanto,los AM-hMSC utilizados en este trabajo fueron mesenquimales, en información accordancewith se informó anteriormente por Leyva et al. (Figura 3). Además, este resultado coincide con las características inmunofenotipo que fueron establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) para las células madre mesenquimales.

La adhesión celular en la matriz ósea

Las micrografías de barrido muestran el comportamiento de los AM-hMSC siete días después de la estratificación sobre la NKB. La superficie del biomaterial se cubrió con células esféricas (día uno), y algunas células de propagación aparentemente unidos a la superficie de la matriz bovina el séptimo día. A mayor aumento, las células se extienden parecían estar en estrecho contacto a través de procesos filipodial (FL) (Figura 4).

La proliferación celular en la matriz ósea

Los resultados del ensayo de AB mostraron una pequeña disminución en la absorbancia relativa u liendres (RAU) de la condición de la matriz (+ matriz ósea) bovina después de 1 día de incubación y luego en el quinto día, la presencia del andamio induce un aumento en la proliferación celular estadísticamente significativa en comparación con el cultivo realizado en ausencia de bovino matriz (matriz -bone) (Figura 5).

Unidad formadora de colonias

La CFU es un tradicionalmente ensayo de células madre. Las AM-hMSC aisladas en este trabajo conservan su capacidad de formar colonias discretas a los 14 días de cultivo.

Figura 1
Figura 1: Aislamiento de membrana amniótica. (A) El cordón umbilical (CU) se lleva a cabo con una mano para identificar la región en la que se obtiene la membrana amniótica. (B) La membrana amniótica (AM) se asemeja a una película translúcida sin inervaciones de sangre.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2:. Características morfológicas de las células madre de la membrana amniótica humana se observaron culturas AM-hMSC en 3 días después de aislamiento utilizando un microscopio óptico y muestran la morfología similar a fibroblastos.

Figura 3
Figura 3:. Citometría de caracterización de flujo Las células de membrana amniótica humana eran principalmente células mesenquimales porque eran positivos para los marcadores mesenquimales (CD73, CD90, CD105), como se muestra por el desplazamiento de histograma a la derecha, y negativo para los marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45), como se confirma por el desplazamiento del histograma a la izquierda. Los antígenos se muestran en los histogramas de color rojo, mientras que el control isotypesfor los fluorocromos PE y FITC se observan ennegro.

Figura 4
Figura 4:.. La adhesión celular en la matriz ósea bovina Una serie de imágenes SEM que muestra la unión de las células a los poros del biomaterial (A) la visión panorámica de un poro NKB con varias células adheridas al biomaterial en el estado esférica (CS) y aplanada (CF) en la superficie del biomaterial, también es posible apreciar el hueso lacuna indica como (Lac) a las tres día de cultivo en la matriz de bovino. (B) Amplificación de la célula en el proceso de adaptación en la superficie de el material a través de proyecciones filipodial (C) La interacción entre dos células adheridas y aplanados en la matriz de bovino (C1, la celda 1, y C2, la celda 2).. Por favor, haga clic aquí para voie una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. La proliferación de células en la proliferación celular bovina matriz ósea fue evaluada por la reducción de AB y se expresa en unidades de absorbancia relativa a lo largo de 7 días de cultivo. Los resultados se muestran la influencia de la matriz ósea (+ matriz ósea) en la proliferación AM-hMSC que era estáticamente diferente en comparación con la condición negativa (-bone matriz). (* P <0,05)

Figura 6
Figura 6: ensayo de CFU de MSCs inicialmente en placas a densidades variables y se incubó durante 14 días (media * / - SD, n = 10).

Células adheridas La adhesión celular (%)
Las células de la parte inferior 187.667 ± 1.208 62.47
Las células en el andamio 312.333 ± 1.208 37.53

Tabla 1:. Eficiencia de adherencia en la matriz bovina Las células adheridas a la parte inferior de la placa plato y las células adheridas en el andamio se contaron mediante un hemocitómetro después de haber sido recuperada por trypsinization.The datos presentados en la tabla corresponden a dos experimento independiente para triplicado ± desviación estándar

Discussion

Las células madre que se obtuvieron de membrana amniótica humana (Figura 1) mostraron una morfología similar a fibroblastos, similar a las células mesenquimales (Figura 2) y eran principalmente MSCs. Además, los ensayos de citometría de flujo revelaron que estas células eran positivas para los marcadores de células mesenquimales (CD73, CD90, y CD105) y negativa para los marcadores de linaje hematopoyéticas (CD34, CD45) (Figura 3). Además, los AM-hMSC aisladas en este trabajo presentan la capacidad de formar UFC (Figura 6). Del mismo modo, las células madre mesenquimales aisladas en esta forma conservan la capacidad de unirse a osteoinductor biomaterial (Figura 4), ​​y proliferar en el cadalso (Figura 5).

Por estas razones, el método de cultivo de AM-hMSC en biomaterial hueso macroporoso que se utilizó en este trabajo representa una oportunidad para insertar las células dentro del tejido hueso lesionado e inducir su differentiation al linaje osteoblástico. Este sistema de cultivo no requiere la adición de inductores osteoblásticas para mantener el proceso de diferenciación osteoblástica fenotipo de osteoblastos y NKB porque es un material andosteoinductive osteoconductiva 8. El uso de residuos de tejido, como la placenta humana, representa una alternativa sencilla y ética para acceder a una población de células madre con el potencial de diferenciarse en MSC, en comparación con otras fuentes que frecuentemente implican métodos invasivos o bajo rendimiento celular.

El método de cultivo propuesto podría extrapolarse a sistemas in vivo porque las células se siembran en micro-masa en el material de la superficie superior, y las células colonizan y se adhieren a la totalidad de la superficie del biomaterial después de los tiempos de incubación apropiados. Por otra parte, no se requieren reactivos sofisticados, equipos y procedimientos, a diferencia de los métodos existentes en la aplicación de esta técnica son los cultureas micro-masa así como ladeposición lenta y constante de la alícuota celular en el material para asegurar que las células interactúan preferentemente con el biomaterial, y no con la parte inferior de la placa. Otro punto crítico es el uso de material pre-humedecida antes de cultivar las células, ya que esto asegura que las células tendrán los nutrientes necesarios del medio de cultivo cuando se integran en el material sin importar si están en la superficie o dentro de los poros. Finalmente, el uso de un biomaterial osteoinductivo es crítico para este proceso debido a que evita la adición de factores externos para inducir y mantener la diferenciación osteoblástica. La limitación de la técnica es que se basa en el potencial osteoinductivo de la matriz de bovino; sin embargo, el sistema de cultivo propuesto se puede extrapolar a cualquier material poroso con una distribución de poro de 20 a 200 micras. Por lo tanto, el procedimiento presentado en este trabajo es un método alternativo para el cultivo de células madre mesenquimales en diversos materiales tsombrero se emplean para la ingeniería de tejidos, especialmente para la regeneración ósea.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos la beca y el apoyo financiero proporcionado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina de la UNAM-DGAPA IN201510 y DGAPA IN216213; Salvador Correa de Instituto Nacional de Perinatología para obtener ayuda con el material biológico; y Biocriss, SA de C. V por donar Nukbone. También agradecer al Ing. Héctor Martínez de IIM, UNAM y M en C Fabiola González del CINVESTAV para la asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
  2. Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22, (4), 1338-1345 (2004).
  3. Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
  4. Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
  5. Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
  6. Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
  7. Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
  8. Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
  9. Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
  10. Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
  11. Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. Humana Press. New York, NY. (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics