Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse

Developmental Biology
 

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Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

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Abstract

Introduction

Il pair et régénération de tissuesis un des themain objectifs de la science médicale en raison d'une lésion dans un ororgan de tissu peut être invalidante et, dans certains cas, mortelles. Dans le contexte, les travailleurs de la santé et les chercheurs sont constamment à la recherche des techniques, des méthodes et des outils pour fournir de nouveaux Alternatives thérapeutiques promouvoir n'y processus paire régénération des tissus endommagés. Par conséquent, les sciences biomédicales ont porté sur l'étude des cellules souches mésenchymateuses (CSM), en particulier les cellules souches adultes, parce que cette lignée cellulaire représente un modèle idéal pour étudier le processus de régénération des tissus, en raison de son potentiel de se différencier pour ectodermique, mésodermique et endodermique lignées cellulaires Cependant, pour rendre la thérapie avec MSC une réalité, la caractérisation du potentiel thetherapeutic de MSC doit être accompagnée par la mise en œuvre de nouvelles techniques de culture cellulaire utilisant des biomatériaux et des échafaudages cellulaires qui garantissent le comportement souhaité des CSM dans le tissu hôte.

in vitro, mais pas pour l'extrapolation et l'application dans des systèmes ouverts complexes, tels que l'homme ou dans des essais in vivo. Les techniques qui visent à assurer l'adhésion cellulaire aux topographies aléatoires, tels que les matériaux d'os poreux, ont été étudiés par l'adhérence de la matière au fond du puits de culture et de collagènes et polymères agarose employé. Pour ces méthodes, les cellules qui ont été ensemencées sur la surface ont été retenus dans les pores et sur la surface supérieure. Cependant, cet aspect ne peut être assurée dans un in vivosystème dans lequel les fluides corporels entourant le biomatériau pourraient glisser les cellules à partir du site souhaité sur supports poreux est l'utilisation d'une stimulation ultrasonique, ce qui nécessite un équipement sophistiqué, mais favorise l'expression de marqueurs ostéoblastiques dans des essais in vitro 5. L'utilisation de cultures en continu nécessite des bioréacteurs, qui garantissent une répartition homogène des nutriments dans le milieu de culture; Toutefois, un pourcentage significatif des cellules cultivées est perdue lors du remplacement du milieu de culture en raison de la vitesse d'écoulement qui est utilisé dans cette technique et le support adhérant aux parois de l'équipement. Ces problèmes augmentent la masse cellulaire qui est nécessaire pour ce type de culture et le temps d'obtention d'un nombre suffisant de cellules 7. Ainsi, la méthodologie présentée dans ce travail représente une technique qui doit être extrapolée à des systèmes in vivo parce que les cellules sont ensemencées dans des micro-masse sur une surface supérieure de matériau, et après l'appromangé des temps d'incubation, 60% de la masse cellulaire initial est respecté. De plus, cette technique ne nécessite pas l'addition d'inducteurs ostéoblastiques (par exemple, la dexaméthasone, l'acide ascorbique, ou le bêta-glycérophosphate) ou des stimuli ultrasoniques pour induire une différenciation ostéoblastique et le maintien du phénotype des ostéoblastes car NKB est un ostéoconducteur et échafaudages ostéoinducteurs 8, le procédé pour la culture des cellules souches mésenchymateuses à partir de la membrane amniotique humain (AM-CSMh) sur macroporeuse biomatériau osseux présenté dans ce travail representsapossibility à insérer des cellules dans le tissu osseux endommagé ou induire la différenciation de la lignée ostéoblastique.

Protocol

Cette recherche a été effectuée conformément à la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale en ce qui concerne l'éthique de la recherche avec des êtres humains et a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche de la Facultad de Medicina, UNAM (numéro de projet 101-2012).

1. Isolement de cellules souches mésenchymateuses humaines

  1. Préparation du réactif
    1. Préparer la solution de tampon phosphate salin (PBS) et supplément avec une solution antibiotique-antimycotique de 1%.
    2. Préparer Eagle modifié de Dulbecco Medium, haute teneur en glucose (DMEM-HG), et à 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d'antibiotique-antimycotique solution.Sterilize ce milieu de culture par filtration à travers un filtre de 0,2 um.
    3. Préparer une solution collagénase II à 100 U / ml dans HG-DMEM sans FBS ou une solution antibiotique-antimycosique.
    4. Stériliser les instruments chirurgicaux suivants, qui sont nécessaires pour l'isolement, par autoclavage: ciseaux normes, une pince de dissection simples, à pointe fine et une pince à griffes et une poignée de scalpel (n ° 4).
  2. Isolement de cellules souches mésenchymateuses de la membrane amniotique humaine
    1. Maintenez le cordon ombilical avec une main et avec l'autre main, décoller la membrane amniotique (AM), qui ressemble à une feuille translucide, pour obtenir un fragment d'environ 5 cm 2. Si la section de chorion est présent dans l'échantillon, séparer le chorion sous-jacent par dissection manuelle que la section de chorion est plus épaisse que l'amnios.
    2. Retirer les résidus de sang avec trois lavages de 5 ml de PBS et de retirer les caillots avec la pince simples. Faire une petite incision dans l'AM avec le scalpel pour générer des fragments d'environ 0,5 cm 2.
  3. Digestion enzymatique de membrane amniotique
    1. Incuber l'heure avec 5 ml de 0,125% de trypsine / solution 0,5 mM d'EDTA à 37 ° C pendant 30 min dans un tube conique de 50 ml à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Centrifugeuse à 250xg et 25 ° C pendant 5 min, puis on élimine la solution de trypsine par élimination du surnageant.
    2. Ajouter 15 ml de solution de collagénase de type II et incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% en agitant de temps en fonction de Leyva et al. 9
    3. Immédiatement après digestion avec de la collagénase II, ajouter 15 ml de PBS et centrifuger à 250 x g et à 25 ° C pendant 10 min.
    4. Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire avec 15 ml de solution PBS et centrifuger à 250 x g et 25 ° C pendant 15 min. Jeter le surnageant.
    5. Reprendre le culot cellulaire dans 10 ml de HG-DMEM en agitant doucement.
  4. L'expansion de cellules souches mésenchymateuses
    1. Graine 2 ml de suspension de cellules (1 x 10 4 cellules / cm 2) dans la fiole de culture et ajouter 2 ml de DMEM et HG-incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Éliminer la cellule non adhérente en changeant le milieu de culture après 5-7jour.
    2. Après ce temps, changer le milieu de culture tous les 3 jours pendant encore 7 à 10 jours pour obtenir une confluence cellulaire de 90%.
    3. Récupérer les cellules et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% de solution de trypsine / EDTA 0,125% (de trypsinisation).
    4. Immédiatement après traitement à la trypsine, recueillir des cellules avec une pipette et transférer dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 250 g pendant 5 min.
    5. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 ml de HG-DMEM.
    6. Culture suspension cellulaire dans deux flacons de 75 cm2 de culture (5 ml dans chaque flacon), et maintenir la culture jusqu'à 90% de confluence.
    7. Répétez les étapes 1.4.3. à 1.4.6, jusqu'à la 9ème passage ou sous-culture.
    8. Récupérer les cellules par trypsinisation comme dans les étapes 1.4.3 à 1.4.5 pour cytométrie de flux ou d'autres études.

2. Préparation de la matrice osseuse poreuse Disk (NKB)

  1. Pour mouiller les disques NKB(Diamètre, 12 mm; épaisseur 2 mm)., Incuber chaque disque pendant une nuit avec 3 ml de DMEM sans HG-FBS dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C, selon la Fassina et al 5
  2. Après le processus de mouillage, placez le disque dans un tube conique de 50 ml et de spin à 250 g pendant 5 min pour éliminer l'excès de milieu de culture. Placez le disque dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits.
    1. Ajouter 500 ul de DMEM-HG et incuber pendant 30 min à 25 ° C. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes sur le disque NKB à favoriser la distribution correcte de nutriments et de cellules.
    2. Si des bulles sont observées sur le disque, agiter et ajouter 300 ul de milieu de culture et incuber pendant 15 min dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C. Après ce temps, retirer 300 pi de milieu de culture sucer à travers la paroi de la culture cellulaire bien et confirment qu'aucun des bulles se forment.
  3. Placez le disque dans une nouvelle plaque de 24 puits en utilisant une pince simples.

  1. Amorçage de la suspension cellulaire (5 x 10 5 AM-CSMh dans 100 ul de DMEM-HG) à partir de trois sous-cultures, sur la surface du disque préhumidifié biomatériau et incuber pendant 30 min dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Effectuer cette étape lentement et en continu sur la face supérieure du biomatériau pour permettre aux cellules d'interagir avec la topographie de l'ensemble échafaudage. Remarque: Cette procédure permet d'obtenir le 60% ​​des cellules fixées sur le biomatériau indiqué au tableau 1.
  2. Ajouter 1,5 ml de HG-DMEM à 37 ° C, et maintenir la culture pendant 3 jours dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C. Ne pas générer des turbulences dans l'addition de milieu de culture pour éviter que le dépôt de cellules sur le fond du plat de la plaque de culture. Ce est le temps initial.

4. cellulaire marqueurs de surface Caractérisation par Flow Cytometry

  1. Détacher les cellules de 9 e sous-culture avant de les ensemencer sur le disque de matrice. Utilisez 0,25% de trypsine / EDTA 1 mM et les fixer pendant 30 min dans glacée 2% de formaldéhyde. Après la fixation, laver les cellules une fois avec 0,05% de PBS.
  2. Bloquer la liaison non spécifique par incubation des cellules avec 20% d'immunoglobuline humaine pendant 3 minutes sur de la glace et incuber 0,1 x 10 6 aliquotes de cellules à la phycoérythrine (PerCP) conjugué à MAb contre CD73, MAb conjugué à FITC CD90 PE-conjugués MAb contre CD34 , MAb conjugué à FITC et CD45 PE-conjugués MAb CD105 pendant 1 heure à 25 ° C dans l'obscurité. Isotype FITC conjugué anticorps monoclonal, PE-conjugué anticorps monoclonal andPerCP conjugué anticorps monoclonal servira de contrôles négatifs.
  3. Calculer les niveaux des marqueurs de surface en utilisant un logiciel pour l'acquisition et l'analyse des données d'expression.

5. Cellule de détection d'adhérence par microscopie électronique à balayage

  1. Rincer les cellules échantillons disque à 3 jours de culture deux fois avec du PBSet fixthe échantillons avec 4% (v / v) de glutaraldéhyde solutionin un tampon 0,1 M de cacodylate de Na (pH 7,2).
  2. Préparer les échantillons en vue de l'observation microscopique, comme indiqué précédemment par Rivera-N et al. 10 et d'observer au microscope électronique à balayage à un potentiel électrique de 15 kV et à un grossissement de 500X et 2000X.

6. prolifération cellulaire Assay

  1. Pour les échantillons de cellules disques contenant 1,5 ml de milieu de culture, ajouter 150 ul de colorant vital (AB) selon les directives du fabricant et incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C.
  2. Immédiatement après l'addition de AB (0 h) et chaque 24 h jusqu'à atteindre 7 jours de culture de cellules, mesurer l'absorbance à 570 nm avec une longueur d'onde de 600 nm de référence.

7. unité formant colonie (UFC) 11

  1. Culture 100 cellules par 100 mm diskin de culture de tissus HG-DMEM et incuber pendant 14jours dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C.
  2. Laver la culture avec du PBS et tache avec 0,5% de violet cristallisé dans du methanol pendant 5 à 10 min à température ambiante.
  3. Laver les plaques avec du PBS deux fois et compter les colonies visibles en utilisant un hémocytomètre.

Representative Results

Mésenchymateuses humaines isolement de cellules souches

Après la séparation mécanique de l'AM à partir du chorion en utilisant une dissection mousse (figure 1), une population de cellules adhérentes a été obtenu par la trypsine et la collagénase II digestion. Ces populations de cellules attachées à la boîte de culture presenta cellule morphologie de type fibroblaste à 3 jours après l'isolement comme représenté sur la micrographie optique (figure 2A) et au microscope électronique à balayage (figure 2B) .Les des placentas utilisées dans ce travail ont été obtenus à partir de mères de donneurs sains withprevious consentement éclairé.

Cellule caractérisation par cytométrie en flux

La population de cellules qui a été obtenu à partir de l'heure était fortement réactif avec le marqueur mésenchymateux de surface CD90 + (93,5% ± 6,85) et CD73 + et CD105 + (79% ± 3,46) et a montré une réaction négative à des marqueurs hématopoïétiques telles que CD34 et CD45. Ainsi,les AM-CSMh utilisées dans ce travail étaient mésenchymateuses, dans l'information conformémentaux rapporté précédemment par Leyva et al. (Figure 3). En outre, ce résultat coïncide avec les caractéristiques de immunophénotype qui ont été établies par la Société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT) pour les cellules souches mésenchymateuses.

L'adhésion cellulaire sur la matrice osseuse

Les micrographies à balayage montrent le comportement des CSMh AM-sept jours après la stratification sur le NKB. La surface du biomatériau a été couvert avec des cellules sphériques (jour), et une des cellules d'étalement apparemment attachés à la surface de la matrice bovine le septième jour. A plus fort grossissement, les cellules d'étalement semblaient être en contact étroit par des procédés filipodial (FL) (Figure 4).

La prolifération cellulaire sur la matrice osseuse

Les résultats de l'essai ont montré AB une légère diminution de l'absorbance relative u les lentes (RAU) de bovin état de matrice (matrice + osseuse) après 1 jour d'incubation, puis le cinquième jour, la présence de l'échafaudage induit une augmentation de la prolifération cellulaire statistiquement significative par rapport à la culture effectuée en l'absence de bovin matrice (matrice de -bone) (figure 5).

Unité formant colonie

L'UFC est traditionnellement un dosage de cellules souches. Les AM-CSMh isolés dans ce travail préservés sa capacité à former des colonies discrètes à 14 jours de culture.

Figure 1
Figure 1: Isolement de membrane amniotique. (A) Le cordon ombilical (UC) est maintenu d'une seule main pour identifier la région dans laquelle la membrane amniotique est obtenu. (B) La membrane amniotique (AM) ressemble à un film translucide sans innervation sanguins.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 2
Figure 2:. Les caractéristiques morphologiques des cellules souches provenant de la membrane amniotique humaine cultures AM-CSMh à 3 jours post-isolement ont été observées en utilisant un microscope optique et montré la morphologie de type fibroblaste.

Figure 3
Figure 3:. Cytométrie en flux caractérisation Les cellules de membrane amniotique humaine étaient des cellules principalement mésenchymateuses parce qu'ils étaient positifs pour les marqueurs mésenchymateuses (CD73, CD90, CD105), comme indiqué par le déplacement de l'histogramme vers la droite, et négatif pour les marqueurs hématopoïétiques (CD34 et CD45), comme le confirme le déplacement de l'histogramme vers la gauche. Les antigènes sont présentés dans histogrammes du rouge, alors que le contrôle isotypesfor les fluorochromes PE et FITC sont observées dansnoir.

Figure 4
Figure 4:.. L'adhésion cellulaire à la matrice osseuse bovine Une série d'images au MEB montrant la fixation des cellules à pores du biomatériau (A) de la vue panoramique d'un pore de NKB avec plusieurs cellules adhérant au biomatériau dans l'état sphérique (CS) et aplati (CF) sur la surface du biomatériau, est également possible d'apprécier la lacune osseuse indique que (Lac) à trois jours de culture sur la matrice bovine. (B) Amplification de la cellule dans le processus d'adaptation à la surface de (C) Interaction entre deux cellules adhérentes et aplatis sur la matrice bovine matière à travers des projections filipodial (C1, une cellule, et C2, la cellule 2).. Se il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. La prolifération des cellules sur la prolifération cellulaire bovine matrice osseuse a été évaluée par réduction AB et exprimé en unités de densité optique relative le long de 7 jours de culture. Les résultats sont présentés l'influence de la matrice osseuse (+ matrice osseuse) dans les CSMh AM-prolifération qui était statiquement différent par rapport à la condition négative (-bone matrice). (* P <0,05)

Figure 6
Figure 6: UFC dosage de MSC initialement plaqué à des densités variables et incubé pendant 14 jours (moyenne * / - SD, n = 10).

Cellules respectées adhérence de cellule (%)
Les cellules sur le fond 187 667 ± 1208 62,47
Cellules sur l'échafaud 312 333 ± 1208 37,53

Tableau 1:. L'efficacité de l'adhérence sur matrice bovine Les cellules adhérant au fond de la boîte en forme de plaque et les cellules adhérentes sur l'échafaudage ont été comptées par un hémocytomètre après avoir été récupéré par trypsinization.The données présentées dans le tableau correspondent à deux expériences indépendantes pour trois exemplaires ± écart-type

Discussion

Les cellules souches qui ont été obtenues à partir de membrane amniotique humaine (figure 1) ont montré une morphologie de type fibroblaste, similaire à des cellules mésenchymateuses (figure 2) et sont principalement MSC. En outre, des essais de cytométrie en flux a révélé que ces cellules étaient positives pour les marqueurs de cellules mésenchymateuses (CD73, CD90, et CD105) et négatifs pour les marqueurs de lignée hématopoïétique (CD34, CD45) (figure 3). En outre, les AM-CSMh isolés dans ce travail présentent la capacité de former UFC (figure 6). De même, les cellules souches mésenchymateuses isolées dans ce formulaire conservé la capacité de se fixer osteoinductor biomatériau (Figure 4), et proliférer sur l'échafaud (Figure 5).

Pour ces raisons, la méthode de culture de AM-CSMh sur macroporeuse biomatériau osseuse qui a été utilisé dans ce travail représente une occasion d'insérer des cellules dans le tissu osseux blessés et induire sa différentiation à la lignée ostéoblastique. Ce système de culture ne nécessite pas l'addition d'inducteurs ostéoblastiques de maintenir le processus de différenciation ostéoblastique phénotype ostéoblastique et parce NKB est un matériau ostéoconducteur andosteoinductive 8. L'utilisation de tissus de déchets, tels que placenta humain, représente une alternative simple et éthique pour accéder à une population de cellules souches ayant le potentiel de se différencier en cellules souches mésenchymateuses, en comparaison avec d'autres sources qui impliquent fréquemment des méthodes invasives ou rendement cellulaire faible.

La méthode de culture proposé pourrait être extrapolée aux systèmes in vivo parce que les cellules sont ensemencées dans des micro-masse sur le matériau de surface supérieure, et les cellules colonisent et adhérer à la surface de biomatériau ensemble après les temps d'incubation appropriées. En outre, les réactifs sophistiqué, l'équipement et les procédures ne sont pas nécessaires, contrairement aux méthodes existantes lors de la mise en œuvre de cette technique sont les micro-masse Culturas ainsi que ladéposition lente et régulière de l'aliquote alvéolaire à la matière de se assurer que les cellules interagissent préférentiellement avec le biomatériau, et non avec le fond de la plaque. Un autre point essentiel est l'utilisation d'un matériau pré-humidifiée avant la culture des cellules, comme ce est garanti que les cellules auront les nutriments nécessaires à partir du milieu de culture quand ils sont intégrés dans le matériau, indépendamment se ils sont sur la surface ou dans les pores. Enfin, l'utilisation d'un biomatériau ostéoinducteur est essentielle à ce processus car il évite l'addition de facteurs externes pour induire et maintenir une différenciation ostéoblastique. La limitation de cette technique est qu'elle est basée sur le potentiel ostéoinducteur de la matrice bovine; toutefois, le système de culture proposé peut être extrapolé à ne importe quel matériau poreux avec une distribution de pores de 20 à 200 um. Par conséquent, la procédure présentée dans ce travail est une méthode alternative pour la culture de cellules souches mésenchymateuses dans divers matériaux tchapeau sont employés pour l'ingénierie tissulaire, en particulier pour la régénération osseuse.

Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons la bourse et le soutien financier fourni par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 et DGAPA IN216213; Salvador Correa Instituto Nacional de Perinatología de l'aide avec le matériel biologique; et Biocriss, SA de C. V pour le don Nukbone. Merci aussi à Ing. Héctor Martínez de l'IIM, UNAM et M en C Fabiola Gonzalez de CINVESTAV pour l'assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

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References

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