Isolering av menneskelige stamceller og deres Dyrking på Porøse Bone Matrix

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det pare og regenerering av tissuesis en av themain målene for medisinsk vitenskap fordi en lesjon i en vev ororgan kan være invalidiserende, og i noen tilfeller dødelig. I sammenheng, er helsearbeidere og forskere stadig på jakt teknikker, metoder og verktøy for å gi ny terapeutisk alternativesto fremme det pair-regenerering prosessen skadet vev. Derfor har biomedisin fokusert på studiet av mesenchymale stamceller (MSC), spesielt voksne stamceller, fordi denne celle linjen representerer en ideell modell for å studere vevsregenerering prosessen, på grunn av sitt potensial til å differensiere til ectodermal, mesodermal og endodermal celle linjene Men for å gjøre behandlingen med MSC en realitet, må karakterisering av thetherapeutic potensialet i MSC være ledsaget av implementering av nye cellekultur teknikker ved hjelp av biomaterialer og cellulære stillasene som garanterer ønsket atferd av MSC i vertsvevet.

in vitro vurdering, men ikke for ekstrapolering og gjennomføring i komplekse åpne systemer, så som humane eller in vivo-tester. Teknikker som fokuserer på å sikre celleadhesjon til tilfeldige topografier, slik som porøse skjelettmaterialer, har blitt studert ved adhesjon av materialet til bunnen av kulturbrønner og anvendes kollagen og agarose polymerer. For disse fremgangsmåter, ble cellene som ble sådd på overflaten som holdes tilbake i porene og på toppflaten. Imidlertid kan dette aspektet ikke kan sikres i en in vivo-system, i hvilket de kroppsvæsker som omgir biomateriale kunne dra cellene fra det ønskede sted på porøse stillasene er bruken av ultralyd stimulering, noe som krever sofistikert utstyr, men fremmer ekspresjonen av osteoblastiske markører i in vitro analyser 5. Bruken av kontinuerlige kulturer krever bioreaktorer, som garanterer en homogen fordeling av næringsstoffer i kulturen medium; imidlertid en betydelig andel av de dyrkede celler tapt ved utskifting av kulturmediet på grunn av den strømningshastighet som er brukt i denne teknikk og mediet kleber til veggene av utstyret. Disse problemene øker den cellulære masse som er nødvendig for denne type av kultur og tiden for å oppnå et tilstrekkelig antall celler 7. Således kan metoden presentert i dette arbeidet er en teknikk som skal ekstrapoleres til in vivo systemer fordi cellene sådd ut i mikro masse på en øvre overflatemateriale, og etter hensiktsmesspiste inkubasjonstider, er 60% av den opprinnelige cellemasse følges. Videre betyr denne teknikken krever tillegg av osteoblastiske inductors (f.eks deksametason, askorbinsyre, eller beta-glycerophosphate) eller ultralyd stimuli for å indusere osteoblastiske differensiering og vedlikehold av osteoblast fenotype fordi NKB er et osteoconductive og osteoinduktive stillaser 8, metoden for kulturen i MSC fra menneskets foster membran (AM-hMSCs) på macroporous bein biomateriale presentert i dette arbeidet representsapossibility å sette inn celler i skadet benvev og indusere differensiering til osteoblastisk avstamning.

Protocol

Denne forskningen ble utført i henhold til World Medical Association er Helsinkideklarasjonen om etisk framferd i forskning som involverer mennesker, og ble godkjent av Forsknings Ethic Board of Facultad de Medicina, UNAM (prosjektnummer 101-2012).

1. Isolering av human Mesenchymale Stem Cell

  1. Forberedelse av reagens
    1. Forbered fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS) og supplement med 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning.
    2. Forbered Dulbeccos modifiserte Eagles medium, høy glukose (HG-DMEM), og tilsett 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk solution.Sterilize dette kulturmediet ved filtrering gjennom et 0,2 um filter.
    3. Forberede en collagenase II løsning på 100 E / ml i HG-DMEM uten FBS eller antibiotika-antimykotisk løsning.
    4. Sterilisere følgende kirurgiske instrumenter, som er nødvendig for isolering, etter autoklave: standard sakses, enkle dissecting tang, fin-punkt og tann tang og en skalpell håndtak (# 4).
  2. Isolering av stamceller fra menneskelige foster membran
    1. Hold navlestreng med en hånd og med den andre hånden, løsner fostermembran (AM), som ser ut som et gjennomskinnelig ark, for å oppnå et fragment med ca. 5 cm 2. Hvis chorion delen er til stede i prøven, skiller det underliggende chorion ved manuell disseksjon som chorion delen er tykkere enn amnion.
    2. Fjerne gjenværende blod med tre vaskinger med 5 ml PBS og fjerne klumper med de enkle tang. Lag et lite kutt i AM med skalpell for å generere fragmenter av ca 0,5 cm 2.
  3. Enzymatisk fordøyelse av fostervann membran
    1. Inkuber AM med 5 ml av 0,125% trypsin / 0,5 mM EDTA-løsning ved 37 ° C i 30 min i et 50 ml konisk rør ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Sentrifuger ved 250xg og 25 ° C i 5 min og deretter fjerne trypsinoppløsning ved å forkaste supernatanten.
    2. Tilsett 15 ml kollagenase type II-løsning og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære med leilighetsvis rysting i henhold til Leyva et al. 9
    3. Umiddelbart etter spaltning med kollagenase II, tilsett 15 ml PBS og sentrifugering ved 250 xg og 25 ° C i 10 min.
    4. Kast supernatanten og vask den cellulære pelleten med 15 ml PBS-oppløsning og sentrifuger ved 250 xg og 25 ° C i 15 min. Kast supernatanten.
    5. Resuspender mobil pellet i 10 ml HG-DMEM ved å riste forsiktig.
  4. Utvidelse av stamceller
    1. Seed 2 ml av cellesuspensjonen (1 x 10 4 celler / cm2) i kulturkolbe og tilsett 2 ml HG-DMEM og cellene inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Eliminere den ikke-heftende celle ved å endre dyrkningsmediet etter 5-7dager.
    2. Etter denne tid, endre dyrkningsmediet etter 3 dager i ytterligere 7-10 dager for å oppnå en cellulær konfluens på 90%.
    3. Gjenvinne cellene og inkuber dem i 5 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære med 0,125% trypsin / EDTA-løsning (trypsinering).
    4. Umiddelbart etter trypsinering, samle celler med en pipette og overføres til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 250 xg i 5 min.
    5. Kast supernatanten og resuspender den cellulære pelleten i 10 ml HG-DMEM.
    6. Kulturcellesuspensjon i to 75 cm 2 kulturflasker (5 ml i hver kolbe), og opprettholde kultur inntil 90% konfluens.
    7. Gjenta trinn 1.4.3. til 1.4.6, inntil den niende passasje eller subkultur.
    8. Gjenopprette celler ved trypsinization som i trinn 1.4.3 til 1.4.5 for flowcytometri eller andre studier.

2. Utarbeidelse av den porøse Bone Matrix Disk (NKB)

  1. Å fukte NKB disker(Diameter 12 mm, tykkelse 2 mm)., Inkubere hver skive over natten med 3 ml HG-DMEM uten FBS i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C, i henhold til Fassina et al 5
  2. Etter fukting prosess, plasserer disken i en 50 ml konisk rør og spinn ved 250 xg i 5 min for å fjerne overflødig dyrkingsmedium. Plasser disken i en 24 godt cellekultur plate.
    1. Legg 500 mL av HG-DMEM og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C. Sørg for at ingen bobler finnes på NKB disk til å favorisere riktig fordeling av næringsstoffer og celler.
    2. Hvis bobler er observert på platen, rist og tilsett 300 ul kulturmedium og inkuber i 15 min i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C. Etter denne tid fjernes 300 ul kulturmedium suger gjennom veggen av brønncellekultur og bekrefte at det ikke dannes bobler.
  3. Plasser disken i en ny 24-brønns plate ved hjelp av enkle tang.

  1. Seed en cellulær suspensjon (5 x 10 5 AM-hMSCs i 100 ul av HG-DMEM) fra tre underkulturer, på overflaten av den pre-fuktede biomateriale disk og inkuberes i 30 minutter i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C. Dette utføres langsomt og kontinuerlig på den øvre flate av biomateriale for å tillate cellene å samvirke med topografien av hele stillaset. Merk: Denne prosedyre oppnår 60% av cellene er festet på biomateriale vist i tabell 1.
  2. Tilsett 1,5 ml av HG-DMEM ved 37 ° C, og opprettholde kultur i 3 dager i en fuktig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Ikke genererer turbulens i tillegg til kulturmediet for å unngå at avsetningen av celler på bunnen av kulturplaten fatet. Dette er første gangen.

4. Cell Overflate Markers Karakterisering av Flow CytomEtry

  1. Løsne cellene fra 9. subkultur før seeding dem på matrisen disk. Bruk 0,25% trypsin / 1 mM EDTA og løse dem i 30 minutter i is-kald 2% formaldehyd. Etter fiksering, vaske cellene gang med 0,05% PBS.
  2. Blokkere ikke-spesifikk binding ved inkubering av cellene med 20% humant immunglobulin i 3 minutter på is og inkuberes 0,1 x 10 6 celle aliquoter med fykoerytrin (PerCP) -konjugert MAb mot CD73, FITC-konjugert MAb CD90, PE-konjugert monoklonalt antistoff mot CD34 , FITC-konjugert CD45 MAb og PE-konjugerte MAb CD105 i 1 time ved 25 ° C i mørket. Isotype-matchet FITC-konjugerte MAb, vil PE-konjugerte MAb andPerCP-konjugerte MAb tjener som negative kontroller.
  3. Beregne uttrykket nivåer av overflatemarkører ved hjelp av programvare for datainnsamling og analyse.

5. celleadhesjonen Detection ved scanning elektronmikroskopi

  1. Skyll celle-disk prøver på 3 dager med kultur to ganger med PBSog fixthe prøver med 4% (v / v) glutaraldehyd solutionin en 0,1 M Na-cacodylat buffer (pH 7,2).
  2. Fremstille prøver for mikroskopisk observasjon, som tidligere rapportert av Rivera-N et al. 10 og observere ved hjelp av et scanning elektronmikroskop ved et elektrisk potensial på 15 kV og ved en forstørrelse på 500X og 2000X.

6. celleproliferasjonsanalyse

  1. Til celle-disk prøver som inneholder 1,5 ml av kultur medium, legge 150 mL av vital fargestoff (AB) i henhold til produsentens retningslinjer og inkuberes cellene i en fuktig atmosfære av 5% CO 2 ved 37 ° C.
  2. Umiddelbart etter tilsetning av AB (0 timer) og hver 24 timer til n 7 dager etter cellekultur, å måle absorbansen ved 570 nm med en referansebølgelengde på 600 nm.

7. Colony Forming Unit (CFU) 11

  1. Kultur 100 celler per 100 mm vev kultur Diskin HG-DMEM og inkuber i 14dager i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C.
  2. Vask kultur med PBS og flekken med 0,5% krystallfiolett i metanol i 5 til 10 minutter ved romtemperatur.
  3. Vask platene med PBS to ganger og telle synlige kolonier ved hjelp av en hemocytometer.

Representative Results

Menneskelig mesenchymale stamceller isolasjon

Etter mekanisk separasjon av AM fra chorion ved hjelp stump disseksjon (figur 1), ble en tilhenger cellepopulasjon oppnådd ved trypsin og kollagenase-fordøyelse. Disse cellepopulasjoner festet i dyrkningsskålen presenta fibroblast-lignende cellemorfologi i 3 dager etter isolering, som vist på det optiske mikrografi (figur 2A) og scanning elektronmikrograf (figur 2B) .De placentas som brukes i dette arbeidet ble oppnådd fra friske givere mødre withprevious informert samtykke.

Celle karakterisering av flowcytometri

Den cellepopulasjon som ble oppnådd fra AM var sterkt reaktive til overflaten mesenchymale markører CD90 + (93.5% ± 6,85) og CD73 + og CD105 + (79% ± 3,46) og viste en negativ reaksjon på hematopoetiske markører slik som CD34- og CD45. SåledesAM-hMSCs som brukes i dette arbeidet var mesenchymale, i accordancewith informasjon som tidligere er rapportert av Leyva et al. (figur 3). I tillegg sammenfaller dette resultatet med immunfenotype karakteristikker som ble etablert av International Society for Cellular Therapy (ISCT) for stamceller.

Celleadhesjonen på benmatrise

Skannemikrografer viser oppførselen til AM-hMSCs sju dager etter lagdeling på NKB. Overflaten av biomateriale var dekket med kuleformede celler (en dag), og noen spre celler tilsynelatende festet til bovin matriseoverflaten på den syvende dag. Ved høyere forstørrelse, spre cellene så ut til å være i nær kontakt via filipodial prosesser (FL) (figur 4).

Celleproliferasjon på benmatrise

Resultatene av AB-analysen viste en liten reduksjon i relativ absorbans u nits (RAU) av bovint matrise tilstand (+ benmatriks) etter 1 dags inkubering og på den femte dag, i nærvær av stillaset induserer en økning i celleproliferasjon statistisk signifikant sammenlignet med kulturen utføres i fravær av bovint matrise (-bone matrise) (Figur 5).

Colony Forming Unit

CFU er et tradisjonelt analyse av stamceller. AM-hMSCs isolert i dette arbeidet bevart sin evne til å danne diskrete kolonier på 14 dager i kultur.

Figur 1
Figur 1: Isolering av fostermembran. (A) Navlestrengen (UC) holdes med en hånd for å identifisere den regionen der foster membranen er oppnådd. (B) Den foster membran (AM) ligner en gjennomsiktig film uten blod innervations.

ve_content "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 2
Fig. 2: Morfologiske karakteristika av stamceller fra den humane fostermembran AM-HMSC kulturer ved 3 dager post-isolasjon ble observert ved hjelp av et optisk mikroskop, og er vist på fibroblast-lignende morfologi.

Figur 3
Fig. 3: Strømningscytometri karakterisering Cellene fra humant fostervann membran var for det meste mesenchymale celler fordi de var positive for mesenchymale markører (CD73, CD90, CD105), som vist ved forskyvning av histogrammet til høyre, og negativt for hematopoetiske markører (CD34 og CD45), som bekreftet ved forskyvning av histogrammet til venstre. Antigenene blir vist i røde histogrammer, mens kontrollgruppen isotypesfor PE og FITC fluorokromer er observert isvart.

Figur 4
Figur 4:.. Celleadhesjon på bovin benmatriks En serie SEM bilder som viser festing av cellene til porene i biomateriale (A) Panorama syn av en NKB pore med flere celler festet til biomaterialet i den sfæriske tilstand (CS) og utflatet (CF) på overflaten av biomateriale, er det også mulig å sette pris på benet lacuna som indikerer (Lac) ved tre dagers kultur på bovin matriks. (B) amplifisering av cellen i prosessen med å tilpasse på overflaten av materialet gjennom filipodial anslag (C) Samspill mellom to celler levd og flatet på storfe matrise (C1, celle 1, og C2, celle 2).. Klikk her for å view en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Fig. 5: proliferasjon av celler i bovin benmatriks Celleproliferasjon ble evaluert ved AB reduksjon og uttrykt i relative absorbansenheter sammen 7 dager dyrking. Resultatene er vist innflytelsen av benmatrise (+ benmatriks) i AM-hMSCs proliferasjon som var statisk forskjellig sammenlignet med den negative tilstand (-bone matrise). (* P <0.05)

Figur 6
Figur 6: CFU-analyse av MSC innledningsvis belagt med varierende tettheter og inkubert i 14 dager (middel * / - SD, n = 10).

Celler levd Celle adhesjon (%)
Celler på bunnen 187 667 ± 1208 62.47
Celler på stillaset 312 333 ± 1208 37.53

Tabell 1:. Effektivitet av adhesjon på bovin matrise cellene som festet seg til bunnen av platen skål og cellene som fester seg på stillaset ble talt ved hemocytometer etter å ha blitt gjenvunnet ved trypsinization.The data som er presentert i tabellen svarer til to uavhengige forsøk for triplikat ± standardavvik

Discussion

Stamcellene som ble oppnådd fra humant fostervann membranen (figur 1) viste en fibroblast-lignende morfologi, i likhet med mesenchymale celler (figur 2) og var hovedsakelig MSC. I tillegg er flowcytometri-analyser viste at disse cellene var positive for mesenchymale cellemarkører (CD73, CD90, og CD105) og negativ for hematopoetiske avstamning markører (CD34, CD45) (figur 3). Også, AM-hMSCs isolert i dette arbeidet presentere evnen til å danne CFU (figur 6). Tilsvarende mesenchymale stamceller isolert i denne formen beholdt evnen til å feste til osteoinductor biomateriale (figur 4), og sprer på stillaset (Figur 5).

Av disse grunner, dyrkning av AM-hMSCs på makroporøs ben biomateriale som ble brukt i dette arbeidet representerer en mulighet for å sette cellene i skadet benvev og indusere sin differentiation til osteoblastisk avstamning. Denne kultursystem krever ikke tilsetning av osteoblastiske induktorer for å opprettholde osteoblast fenotype og osteoblastiske differensieringsprosessen fordi NKB er en osteoconductive andosteoinductive materiale 8. Bruken av avfalls vev, slik som human placenta, representerer en enkel og etisk alternativ til å få tilgang til en populasjon av stamceller med potensiale til å differensiere til MSC, i sammenligning med andre kilder som ofte involverer invasive metoder eller lave celleutbyttet.

Den foreslåtte dyrkningsmetode kan bli ekstrapolert til in vivo systemer fordi cellene blir sådd ut i mikro massen på den øvre overflaten materiale, og cellene kolonisere og følge den hele biomateriale overflaten etter at de riktige inkubasjonstider. Videre er sofistikert reagenser, utstyr og prosedyrer ikke nødvendig, i motsetning til eksisterende metoder ved implementering av denne teknikken er mikro-masse cultureas vel somlangsom og jevn avsetning av den cellulære delmengde av materialet for å sikre at cellene fortrinnsvis samvirke med biomateriale, og ikke med bunnen av platen. Et annet kritisk punkt er bruken av pre-fuktede materialet før dyrking av cellene, da dette sikrer at cellene vil ha de nødvendige næringsstoffer fra kulturmediet når de blir integrert inn i materialet, uansett om de er på overflaten eller i porene. Endelig er anvendelse av et osteoinduktivt biomateriale kritisk for denne fremgangsmåte fordi den unngår tilsetning av eksterne faktorer for å indusere og opprettholde osteoblastiske differensiering. Begrensningen av teknikken er at den er basert på osteoinduktivt potensialet av det bovine matrise; imidlertid kan den foreslåtte kultursystem bli ekstrapolert til en hvilken som helst porøst materiale med en porestørrelse fordeling av 20 til 200 um. Derfor er fremgangsmåten presentert i dette arbeidet er en alternativ fremgangsmåte for dyrking av stamceller i ulike materialer thatten er ansatt for tissue engineering, spesielt for bein regenerasjon.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner stipend og økonomisk støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 og DGAPA IN216213; Salvador Correa fra Instituto Nacional de Perinatología for å få hjelp med det biologiske materialet; og Biocriss, SA de C. V for å donere Nukbone. Også takke til Ing. Héctor Martínez av IIM, UNAM og M en C Fabiola Gonzalez av CINVESTAV for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
  2. Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22, (4), 1338-1345 (2004).
  3. Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
  4. Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
  5. Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
  6. Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
  7. Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
  8. Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
  9. Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
  10. Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
  11. Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. Humana Press. New York, NY. (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics