בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המעי הדק הוא לעתים קרובות נחשף לרעלים שיכולים להשפיע על זרימת דם ולהשפיע לרעה על מזין קליטה. שימוש בעורק multimyograph וmesenteric ווריד מבודד, תרכובות או רעלים של עניין יכול להיות מוקרן לvasoactivity.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מערכות עיכול של יונקים כל הזמן נחשפות לתרכובות (רצויות ולא רצויים), כי יכולה להיות השפעה על זרימת דם ומהמערכת ש. שינויים בזרימת דם למעי דק עלולים לגרום להשפעות על פונקציות הקליטה של ​​האיבר. עניין מיוחד ברעלים שוחררו ממספוא באמצעות תהליכי תסיסה ועיכול פיתח במעלי גירה כאזור שבו אפשר לשפר את היעילות יצרנית. הווידאו הקשורים במאמר זה מתאר המבדק במבחנה פותח לתרכובות מסך לvasoactivity בחתכים מבודדים של עורק mesenteric שור והווריד באמצעות multimyograph. ברגע שכלי הדם הם רכובים וequilibrated בmyograph, המבדק עצמו יכול להיות בשימוש: ככלי מיון כדי להעריך את תגובת ההתכווצות או vasoactivity של תרכובות של עניין; לקבוע את הנוכחות של סוגי קולט ידי פרמקולוגית מיקוד קולטנים עם אגוניסט הספציפיים; לקבוע את תפקידו של קולטן עם הנוכחות של יריבים אחד או יותר; או לקבוע אינטראקציות פוטנציאליות של תרכובות של עניין עם יריבים. דרך כל זה, הנתונים נאספים בזמן אמת, רקמה שנאספו מבעלי חיים יחידים יכולה להיות חשופה למספר רב של טיפולים ניסיוניים שונים (יתרון במבחנה), ומייצגת את כלי דם בכל צד של מיטת הנימים לספק מדויק תמונה של מה שיכול להיות שזה קורה באספקת הדם מביא וefferent תמיכה המעי הדק.

Introduction

שינויים בזרימת דם למיטת רקמה יכולים להיות השפעה גדולה על תפקוד איבר. תפקידו עיקרי של המעי הדק הוא מזין קליטה. זרימת דם העורקי למשטח הקליטה של המעי נדרש לעליית קליטה וזרימת דם מזינה כדי לסייע בקליטת חומרים מזינים כמו digesta נע לאורך המשטח 1. ירידה בזרימת דם יכולה לגרום לירידה בספיגת חומרי מזון בשל ירידה בשיפוע transepithelial 2. בנוסף לחומרים מזינים, המעי הדק יכול גם להיות חשוף למטבוליטים משניים, תרופות, או רעלים שיפעילו השפעה על זרימת דם מקומי בלפדר. במקרה של החיים מעלה הגירה, יכולות להיות משוחררות תרכובות מfeedstuff (למשל, חומרים מזינים כגון חומצות אמינו, או רעלים כגון אלקלואידים ergot) באמצעות תהליכי תסיסה של המעי הקדמי. אם תרכובות אלו לשרוד את חילוף החומרים של חיידקים תסיסה בכרס, הם זמינים כעת לקליטהאו אינטראקציה כשהם נוסעים דרך מערכת העיכול של בעלי החיים.

ישנן מספר השיטות שונות זמין כדי למדוד את זרימת דם בגוף חי (למשל, אולטראסאונד דופלר, שכינת מדידת תצרוכת דם, microspheres radiolabeled, וטכניקות מחוון דילול) שתאפשר הערכה של תרחישים ניסיוניים שונים או טיפולים. עם זאת, כדי להשיג מידע לגבי התכונות מכאניות או תרופתית של שריר חלק בכלי הדם, שיטות נותרת מוגבלות לכלי גדול עד Mulvany והלפרן 3 פרסמו מאמר המתאר את הטכניקה באמצעות חוט רכוב הכנות טבעת כלי דם בmyograph. מאז הפיתוח של טכניקה זו, שינויים ימשיכו להתבצע למערכות myograph הקשורות המאפשרות מגוון רחב של יישומים שונים להערכת מבנים צינוריים. המערכת גם הותאמה לנצל מוטות קבועות להרכבת כלי גדול יותר 4 שבו זלוףטכניקות לא רצויים.

בגלל השוני בכלי ממקורות שונים אנטומיים והבחנות באותו כלי ממינים שונים של בעלי חיים, נתונים מכלי שיט והסוג של בעלי חיים לא יכול בקלות להיות אקסטרפולציה על פני כלי שונים או אותו כלי השיט בסוגים שונים של בעלי חיים 5. כתוצאה מכך, bioassays הנפרד חייב להיות מפותח ומאומתים בכל עת היבטים אלה השתנו. לאחרונה כמה bioassays פותחו עם טכנולוגיות אלה לשימוש בבקר לרוחב וריד saphenous ועורק כרס תקין ווריד 6,7.

המבדק זה פותח כדי לחקור באופן ספציפי את ההשפעות שיש לי אלקלואידים ergot על כלי דם התומכים במעי הדק. נמסר כי 50-60% מאלקלואידים האכילו מופיעים בתוכן abomasal, אבל רק 5% הם התאוששו בצואת 8. סטריקלנד et al. 9 האמור בסקירה של אלקלואידים ergot, שsugg נתונים זמיןבהערכה שהמעי דקה עשויה להיות האתר החשוב ביותר לקליטת ergopeptine. אקרט et al. 10 היבטים ביולוגיים בביקורת של אלקלואידים ergot וקבע כי ברגע שהם חוצים את מחסום האפיתל, אלקלואידים ergot מועברים גם על ידי מערכת הלימפה לוריד subclavian או באמצעות וריד mesenteric ולדם פורטל. רודוס et al. 11 דיווח על ירידה בזרימת דם לתריסריון ומעי גס בפרים רב דיאטה עתירת נגוע endophyte (אלקלואיד ergot הגבוה). באמצעות המבדק עורק ווריד הכרס תקין, פוט et al. 12 הוכיחו כי אלקלואידים ergot הם vasoactive בכלי דם בכרס. פוט et al. 13 הפגינו לאחר מכן in vivo כי חשיפת כרס לתוצאות אלקלואידים ergot בזרימה דם אפיתל כרס פנימית ירד. ירידה בזרימת דם אל פני השטח הקליטה של ​​הכרס הפנימי זו בו זמנית, גרמה לירידה במזין שטף (חומצת שומן נדיפות). בהתחשב quantity של אלקלואידים ergot מעבירים למעי הדק מהמעי הקדמי; זה היה שיערו כי השפעה דומה על מערכת כלי דם של מעי דק ומזין קליטה תתרחש. הדבר זה הצריך את הפיתוח של המבדק ileal הפרוקסימלי שור עורק mesenteric ווריד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נהלים המשמשים במחקר זה לא דורשים אישור מאוניברסיטת קנטאקי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש משום שאין בעלי חיים היו בשימוש. לפני האוסף של כל מדגם המשמש במסמך זה, כל בעלי החיים היו המומים עם בורג בשבי וexsanguinated. זה נערך במתקן בית מטבחיים בדק פדרלי באוניברסיטת קנטאקי. נציג רשמי של משרד החקלאות האמריקאי בטיחות מזון ופיקוח השירות נצפה כל הפעילויות שעסקו בבעלי החיים וטיפול בשידור חי של הפגר.

.1 הכנת מכשור

  1. כדי למזער את כמות הזמן בין האוספים של דגימות רקמה לתחילת ניסוי, להגדיר את הציוד ולהכין מאגרים לפני איסוף רקמות ניסיוניות (או אם אנשים נוספים זמינים, משימות אלה יכולים להתרחש בו זמנית).
    הערה: זה לא רק מספק את הכמות הגדולה ביותר של זמן שהרקמה נשארת קיימא לבצע ניסויים, אבל חלקניסויים יכולים לרוץ במשך תקופות זמן ארוכות (או יש רצון להשלים ניסויים מרובים ביום), ולכן זה בדרך כלל רצוי להתחיל מוקדם ככל האפשר.
  2. יחידת כוח את המחשב קשור, ציוד רכישות נתונים, אמבט מים (לחיץ (ים)) וmyograph (ים). הנח את ציוד הכיול ביחידת myograph (ים) ולהדליק חום myograph (מוגדר מראש כדי 37.5 ° C) ולאפשר יחידות וציוד כיול לחמם למראש טמפרטורות.
    1. פתח קובץ הגדרות תוכנת תרשים שנוצר בעבר על המחשב ולהתחיל לרוץ (אך לא רכישת נתונים).
  3. לחמם את הציוד עבור 10 דקות.
    1. להתחיל לרכוש נתונים.
    2. אפס כל הערוצים.
    3. בדקו, ולנהל כיול (במידת צורך) על כל ערוץ (4 ערוצים לכל multimyograph) לתקנן את האות החשמלית המסופקת ממתמר הכוח המתאים הקשורים לערוץ זה על כוח 2-g מסופק על ידי משקל מוסמך.
    4. לאחר הכיול והמרת יחידות הושלמו, לאחסן את כל הנתונים שלאחר מכן כגרם. תשתנה בהתאם מבוסס על רצונות של כל מעבדה נפרדת; הציוד והתוכנה מתירים את השימוש ביחידות אחרות, כגון milliNewtons ווולט.
  4. ודא שקווי הגז ברורים של חסימות ולהדליק אספקת גז (95% O 2/5% CO 2) לmyograph יחידות (ים). ברציפות בגז את כל המאגרים (בתאי myograph) במהלך ההליך כולו.
  5. למלא את כל תאי myograph עם 70% אתנול ולספוג עבור 10 דקות, להסיר את אתנול, ולחזור לרגע 10 דקות לספוג.
    1. לאחר הסרת אתנול, לשטוף שלוש פעמים עם מים ללא יונים, ואחריו שלוש שטיפות עם חיץ מוכן (ראה סעיף 2 להכנת חיץ), שעזב את התוספת השלישית של חיץ בתאי.
      הערה: בשלב זה את הציוד יכולה להישאר ללא פעילות במדינה זו עד חיץ ורקמה מוכנה וצוות מוכן להמשיך בexperiment.

2 הכנת חוצצים

  1. הכן פתרון חיץ L קרבס-Henseleit 1 לשימוש בתחבורה ועיבוד של דגימות רקמה מנת להגיע לריכוזים סופיים של 11.1 מ"מ D-גלוקוז; 1.2 מ"מ MgSO 4; 1.2 מ"מ KH 2 PO 4; 4.7 מ"מ KCl; 118.1 mM NaCl; 3.4 מ"מ CaCl 2; 24.9 מ"מ NaHCO 3.
    1. מערבבים 9.6 גרם של מלחי קרבס לתוך כ 900 מ"ל של מים ללא יונים על צלחת ומערבבים.
    2. מערבבים במייבש סידן כלוריד 0.373 גרם ואחריו סודיום ביקרבונט 2.1 גרם לכל ליטר של החיץ הרצוי.
    3. פתרון חיץ גז ל20 דקות עם 95% O CO 2/5% 2.
    4. לאחר המתה בגז, כדי להתאים את pH 7.05 (סינון של חיץ מגביר pH; pH היעד סופי צריך להיות 7.4) ולהתאים את עוצמת קול עד 1 ל
    5. סנן לעקר חיץ לחיץ נקי autoclaved 1 ליטר תקשורת בקבוק ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
  2. הכן קרבס-H הנפרדפתרון enseleit חיץ לשימוש בניסויי myograph כמתואר בשלב 2.1 לתחבורה קרבס-Henseleit חיץ עם תרכובות נוספות הנוגעות לניסויי ההתכווצות.
    הערה: בדרך כלל 2 L יספיק לניסויים מתוארים במאמר זה, אבל זה נפח ייתכן שיהיה צורך מוגבר או מופחת המבוסס על האורך של הניסוי, מספר תאי myograph, והחלפות חיץ מספר (יחסית לתוספות טיפול).
    1. לפני צעד ההמתה בגז (שלב 2.1.3), להוסיף 9.1 מ"ג (מחיר לליטר של חיץ שמכין) של desipramine-HCl למאגר.
    2. הכן פתרון 1.0 מיקרומטר של propranolol-HCl ולהוסיף 1 מ"ל (מחיר לליטר של חיץ שמכין) של פתרון זה לפתרון חיץ קרבס-Henseleit. הפוך חיץ זה ביום של שימוש ולשמור בטמפרטורות myograph הפעלה (טמפרטורה שמניבה טמפרטורת C ° 37.5 בmyograph).
      הערה: desipramine מתווספת למעכבת את הספיגה החוזרת של המנגנונים האמינים יוגנייםותאפשר סליקה של תוספות ניסיוניות ממאגר הרחצה כלי הדם להתרחש במהירות רבה יותר. התוספת של propranolol מונעת הלא ספציפי מחייב של תרכובות טיפול לβ-adrenergic receptors.

.3 איסוף והכנה של כלי דם

  1. בהקדם האפשרי, להסיר את מערכת העיכול מהפגר. ברגע שבעלי החיים כבר לא מציג שום רפלקס לא רצוני, להסיר את הראש ולהסתיר ולאחר מכן להעלות את הפגר בצורה אנכית. הסרת הקרביים של מערכת העיכול (ושט אל פי הטבעת) מהפגר צריכה להתבצע על ידי אנשי בית מטבחיים מאושרים (<20 דקות מהזמן של מדהים).
    הערה: תוך כמה זמן, מוגבל בדרך כלל על ידי המיקום / המתקן שבו מערכת העיכול שנאספה ומנהלי הפעלה סטנדרטיים או נהלי מנדט פדרלי ואחריו את הסגל.
    1. ברוב המתקנים, לנהל מניפולציות של מערכת העיכולבמיקום נפרד מעיבוד של הפגר שנועד להזין את אספקת מזון. השתמש במיקום סמוך נוח שבו מערכת העיכול ניתן לקחת ופרושה לבדיקה.
  2. ברגע שמערכת העיכול פרושה, לזהות את המעי הדק, פי ileocecal חיבור המעי הדק לcecum, ומקורבות ileal הארכה הפרוקסימלי לחיק ileocecal (איור 1 א).
    1. באמצעות אזמל או סכין, מאוד קל לעשות חתך בקרום mesenteric במרכז אוגן ileal. באמצעות שתי אצבעות מורות, בבוטות לנתח את רקמת השומן וחיבור החושפת את כלי דם mesenteric (איור 1).
  3. מאוגן או בליטה זו בלפדר המעיים, לנתח את ענפים מרובים (~ 2 סנטימטר אורך) של חבילות עורק ווריד mesenteric החשופות התומכות בחלק זה של המעי (איור 1 ג).
    1. אם uלשיר במלקחיים כדי לתפוס רקמות, לדאוג שלא לתפוס באופן ישיר או למשוך את כלי דם בכל עת הסרתם ככל סוג של מתיחה יכול לגרום נזק ובאופן שלילי משפיע ביצועי רקמה 14. הסרת כלי דם נעשית הטובה ביותר, על ידי חיתוך על פני כל קצה של הקטע שיש להסיר ולאחר מכן חיתוך לצד או במקביל לסעיף עכשיו מבודד. על מנת להקל, להסיר חלק מהרקמה הסובבת יחד עם כלי לספק כמה רקמה לתפוס עם זוג המלקחיים.
    2. עם זוג המלקחיים, לצלול דגימת רקמה בצינור המכיל חיץ קרבס-Henseleit קרח קר ולאחסן על קרח עד עיבוד יכול להתרחש במעבדה.
  4. הנח דגימת רקמה על משטח חיתוך או בצלחת פטרי ובחלקו לצלול בקרח קר קרבס-Henseleit.
    1. בעזרת 5 מלקחיים תכשיטנים #, איריס מספריים נויס, ומגדלת מנורה או לנתח היקף (2.5 להגדלת 5.0x היא מספיק), לנתח בזהירות את connecti השומן והסביבהve רקמות ולהפריד בין העורק לוריד. זיהוי פתיחת הכלי בקצה אחד של הקטע ולתפוס את fascia המקיף את הכלי עם המלקחיים בזהירות.
    2. לעשות חתך עם המספריים במקביל לספינה על ידי הזזה קצה המספריים מתחת fascia העלה. לאחר החתך הראשוני, השומן ורקמות חיבור יכולים להיות מנותקות עוד יותר מהספינה על ידי גדיעה כל צד עם המספריים. ודא שהכולים הם נקיים ככל האפשר, תוך מזעור כמות זמן כלי מבלים על הספסל.
    3. חזור כלי דם לצינורות של חיץ קרבס-Henseleit הטרי ולאחסן ב 4 ° C (דגימות יכולות להישאר לאחסן עד 24 שעות לאחר איסוף ועדיין לייצר נתונים התכווצות בתוקף).
    4. באמצעות סכין גילוח, כלי פרוס לשימוש בmyograph למספר רצוי של סעיפי 2 מ"מ (כדאי להשתמש מבצעה רקמה להשיג חתכים עולים בקנה אחד).
    5. לבחון כל סעיף תחת SCO לנתחPE (הגדלה 12.5X) כדי להבטיח כי לכל סעיף לא חריג, סניפים, שסתומים, או נזק שטחי בטעות שנעשה במהלך נתיחה וניקוי. החלף את סעיף הכלי אם יש חריגות, סניף, שסתום, או נזק שטחי.
  5. סעיפי חנות מקובלים פרוסים כלי (שקועים בחיץ קרבס-Henseleit) על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן להרכבה בתאי myograph (בדרך כלל <30 דקות).
  6. בעדינות לעלות על כלי השיט בmyograph ידי ההכנסה תומכת בלום ולהגדיל את המתח (באמצעות micropositioner על myograph) להיות זהיר, כדי לא למתוח את כלי מעל קריאת 2 עד 3 גרם.
  7. ברגע שכל התאים מכוסים, לשאוב חיץ מכל התאים ולמלא עם 5.0 מ"ל של חיץ ולהתחיל טיימר 15 דקות כדי להתחיל את תקופת האיזון והניסוי.

ניסוי .4

  1. לאזן את כל חלקי הספינה ל1.5 שעות כדי להשיג מיל יציבמתח טינג של 1.0 גרם.
    1. החלף את חיץ הדגירה קרבס-Henseleit כל 15 דקות.
    2. במהלך האיזון, כל הזמן להתאים את המתח בחלקי כלי דם עד 2 גרם ולאחר מכן לאפשר להירגע עד כ 0.80 גרם. נסה שלא לאפשר כלי להירגע יותר מדי (הם עשויים לשמוט את mounts). נסה להשיג מתח בסיס יציב, שבו הכלי מחזיק מתח 1 גרם ללא צורך בהתאמה.
  2. במהלך האיזון, להכין 1.32 M תמיסה מימית של KCl כדי לשמש כנקודת התייחסות.
  3. בעקבות השלמת איזון משביע רצון, להוסיף 500 μl של פתרון M KCl 1.32 להביא לפתרון 0.12 M בפתרון 5.5 מ"ל רחצה הכלי.
    1. בעקבות התוספת של 1.32 M KCl, לא להתאים את המתח באופן ידני כתגובה המקסימלי מתוספת זו משמשת להערכת כדאיות רקמות והוא יכול לשמש כדי לנרמל נתונים טיפול (לדוגמא תגובות ריכוז לgonist).
    2. החלף את החיץ במרווחי 15 דקות, עד המתח חזר לערך הבסיסי של 1.0 גרם.
  4. ברגע שמגיעה נקודת ההתחלה, לשנות את החיץ ובו זמנית להתחיל טיימר 1 דקות. האם זה עבור כל התאים בו זמנית, כדי למנוע מדהים של זמני הפעלה.
    1. מערבולת הסטנדרטי שיש להוסיף ולהכין תגובה לקאמרית 1 במהלך הספירה לאחור 1 דקות.
    2. הוסף את הסטנדרטים ב25 aliquots μl לכל תא כתכתיבי ניסוי (זה שומר על הטיפול בהמשך 0.5% מהנפח הכולל).
    3. כאשר התקן האחרון נוסף, להתחיל טיימר 9 דקות.
    4. בסופו של הדגירה סטנדרטית 9 דקות, להסיר את החיץ המכיל טיפול מהתאים ולהוסיף 5.0 מ"ל של חיץ טרי, ולהתחיל את הטיימר 2.5 דקות.
    5. חזור על שלב 4.4.4.
    6. בסופו של שטיפת 2.5 דקות השניה, לשאוב התאים ולהוסיף למאגר טרי, ולהתחיל טיימר 1 דקות לספירה לאחור לתחילת seconבנוסף סטנדרטי ד.
  5. להמשיך את המעגל הזה לכל תוספות סטנדרטי של היום.
  6. במהלך התוספת סטנדרטית הסופית ודגירת 9 דקות לאחר מכן להכין את תרכובת התייחסות M KCl 1.32 לסוף בנוסף מינון התייחסות ריצה של 500 μl.
  7. בעקבות מרווח 1 דקות לאחר תוספת הטיפול הסופית, להוסיף KCl ולהתחיל טיימר 9 דקות.
    הערה: בנוסף KCl הוא לאשר כדאיות רקמות בסיומו של הניסוי ושימושי אם מתן טיפול שגורם לתגובה זניחה.
  8. בסיומו של הדגירה מתחם התייחסות 9 דקות הסופיות, ואקום או להסיר חיץ מכל התאים. אל תוסיף חיץ טרי. מסקנת הניסוי.
  9. שמור את קובץ תרשים, להסיר חלקים של כלי דם ולהיפטר כראוי, ולעקוב אחר הפרוטוקול הנקי עד (המסופק על ידי יצרן ויכול להיות ספציפי במעבדה) לציוד myograph.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כלי הדם המשמשים לייצור התוצאות כללו נאספו מ6 שוורי הולשטיין (425 קילוגרם ± 8) בתוך מרווח 3 שבוע. דוגמא לתגובה התכווצות וריד mesenteric האופייני לKCl ותוספות טיפול ההולך וגוברות בריכוז מוצגת באיור 2. סדר הגודל של תגובה ישתנה חלקם עם הגודל של כלי השיט (מתואם עם הגודל של החיה התורם), אבל גם יכולה להיות מושפע (לרעה) מטיפול לא נכון (מתיחה) של כלי במהלך איסוף וניקוי. לכן, חשוב לבחון את תגובת התכווצות משמעותית בחשיפת כלי לKCl. אם תגובה זניחה הוא ציין בשלב זה, זה לא מומלץ להמשיך הלאה להליך עם כלי ש. כפי שניתן לראות בתקופות הדגירה 9 דקות באיור 2, יש עליות מצטברות בתגובה, כי להתכתב עם ריכוזים הולכים וגדל. למרות שרצוי לpartic זהעיצוב ניסיוני ular, זה לא תמיד מתרחש או להיות מבוקש עם טיפולים אחרים. בנוסף KCl בסיומו של הניסוי, אם כי לא נעשה שימוש בעיבוד של הנתונים שנאסף, הוא מאוד חשוב כמו זה מאשר את הכדאיות של הרקמות בסיומה של תקופת הניסוי (הופך להיות חשוב יותר אם הכלי אינו מגיב לכל תוספות הטיפול).

הנתונים מוצגים באיור 2 נרשמים בגרם של מתח. חשוב לנרמל את הנתונים הללו כדי למזער כל בעל חיים לבעלי חיים ווריאצית כלי לכלי. כך, בנוסף להיות משמש כמדד ליכולת קיום, תגובת KCl המרבית משמשת לנרמל את כל תוספות הטיפול. זה מייצר נתונים תגובת התכווצות כאחוז ממקסימום KCl. כך עקומות עורק ווריד mesenteric תגובה לריכוז גובר של 5-hydroxytryptamine (סרוטונין; איור 3) ונוראפינפרין (

תגובת וריד mesenteric לשניהם 5-hydroxytryptamine (איור 3) ונוראפינפרין (איור 4) החלה את דרכו ערכים שליליים. זו היא תוצאה של תיקון המתח המרבי שנרשם במהלך כל תקופת דגירה 9 דקות על ידי המתח הבסיסי שנרשם לפני בנוסף KCl הראשוני. תיקון בסיס זה מבטיח שכל הבדלים קלים במתח אינם כלולים בניתוחים ולאפשר הנתונים שהוצגו על מנת לשקף רק שינוי במתח. תוצאות הערך השליליות מכלי הדם מרגיעים ושחרור מתחת לרמות בסיס טרום KCl לפני תוספת טיפול שלאחר מכן. זה נפוץ במיוחד בדגימות ורידים שבו הריכוזים הראשוניים של הטיפול או אגוניסט נמוכים מדי כדי לגרום תגובת התכווצות. זה לא היה במקרה שלי תגובת עורק senteric לאו אמין יוגניים, אשר החזיק מתח מעל הבסיס עד הספינה החלה להגיב לטיפול שנוספו. הבדל זה מדגים את ההבדלים בכלי משני צדי מיטת נימים ולמה שניהם נחשבים כחלק ממבדק זה.

המבדק זה יכול לשמש כדי להעריך vasoactivity של תרכובות על כלי דם המספקים חומרים מזינים למעי הדק, כמו גם כלי דם שנשאו חומרים מזינים נספגים מהמעי הדק. הנתונים באיורים 3 ו 4 הם דוגמאות פשוטות של איך זה יכול להיות מושלם. במקרה של 5-hydroxytryptamine (איור 3), שלא היה הבדל בעורקים או תגובת התכווצות ורידים. לעומת זאת, תגובת ההתכווצות ידי וריד mesenteric לגידול בריכוזי של נוראפינפרין הייתה גדולה יותר מזה של עורק mesenteric.

תרשים 1 "FO: תוכן width =" "src =" 3in / קבצים / ftp_upload / 52020 / "width =" 52020fig1highres.jpg 300 "/>
איור 1:. דוגמא של מערכת עיכול שור משמשת כמקור של כלי דם mesenteric הכוכבית האדומה מציינת את החלק הגלוי של קפל ileocecal בכל שלוש השמשות כנקודת התייחסות. מערכת כולה עם סגלגל האדום המציינים את מקורבות ileal בי דגימה של כלי דם התרחשה (). חשיפה (B) של מיטת כלי דם mesenteric. מספריים (C) איריס והצביעו לעבר סניף חשוף של וריד mesenteric (גלוי) ועורק (לא נראה לעין) רק לפני האוסף.

איור 2
איור 2: דוגמא לתגובת ריכוז של וריד mesenteric לריכוזים הולכים וגדל של נוראפינפרין (1 × 10 -7 עד 1× 10 -4 M). אירועים הגדולים בהתחלה ואת הסוף של העקבות הם תגובות ל0.12 נוספה M KCl. המלבן האדום מסמן את אזור איסוף הנתונים המתאימים עם תקופת הדגירה 9 דקות לכל תוספת טיפול. הקוצים 3 הדקים שמעקב זה הם חפצים שנוצרו על ידי החלפת החיץ ואינם נכללים בניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ממוצע תגובות התכווצות של עורק mesenteric (MA) ווריד (MV, n = 6 שוורים) לריכוזים הולכים וגדל של 5-hydroxytryptamine (סרוטונין) קווים הראו היו שנוצרו באמצעות ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי להתאים את הנתונים לsigmoidal. r ריכוזעקומת esponse אשר ניצלה את המשוואה הבאה: y = תחתון + [(למעלה - למטה) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], שבו חלק העליון ותחתון הם אחוז 120 תגובת התכווצות המרבית מ"מ KCl במישורים, ו50 EC הוא הריכוז טוחנת של אלקלואיד הפקת 50% מהתגובה המרבית KCl.

איור 4
איור 4: ממוצע תגובות התכווצות של עורק mesenteric (MA) ווריד (MV, n = 6 שוורים) לגידול בריכוזי של נוראפינפרין קווים הראו היו שנוצרו באמצעות ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי להתאים את הנתונים לעקומת תגובת ריכוז sigmoidal שנוצלה. המשוואה הבאה: + y = התחתון [(למעלה - למטה) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], שבו חלק העליון ותחתון הם אחוז 120 מ"מ KCl המרבי גontractile תגובה במישורים, ו50 EC הוא הריכוז טוחנת של אלקלואיד הפקת 50% מהתגובה המרבית KCl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האתגר הראשוני בפיתוח של המבדק זה היה הקמתו של אתר אוסף הדיר לכלי דם mesenteric. עקביות אתר מדגם היא קריטית, כחלק מהפונקציות של שינוי המעי הדק במהלך ההתקדמות מהמעי הריק דרך המעי וכתוצאה מכך לפדר להשתנות בדפוס דומה. סניפי ileal של עורק ווריד mesenteric היו הכי מזוהה באמצעות ציוני דרך אנטומיים בקלות. על ידי איתור cecum והבא של פי ileocecal לתחנה הסופי שלה בצד השמאל של לפדר, זה ליד הסיום של עורק mesenteric גולגולת 15. האזור של לפדר ארוך יותר (המכונה מקורבות) ואת הסיומת של קפל ileocecal (ייחודית לבעלי חי שור) 16 דגימה שנעשתה על פני מספר רב של בעלי חיים מאוד הדיר. אחד החסרונות הגדולים יותר שניתן לעשות הוא בשלב זה של המבדק. יש מתיחה מכאנית השפעה שלילית גדולה על p כלי שלאחר מכןerformance 14 והחוקר להבחין כי כלי שיט שהם מוגזמים מניפולציות או מתוח במהלך ההסרה וניקוי שלאחר מכן לא יגיבו לשימוש במתחם ההתייחסות. זה למרבה הצער הוא הדרך היחידה באמת להעריך את האיכות של הכנת כלי הדם ברמה וכלי שיט שאינו מגיבים לKCl לא צריך להיחשב עוד לדור של נתונים אמינות פונקציונליות.

שני שלבי אימות שיטה אחרים (לא מוצג) שהובילו לשיטה הסופית המוצגת כאן היו שימוש בכימיקלים אחרים כתרכובות התייחסות ובדיקת הכדאיות של כלי הדם הבא 24 אחסון שעה. נוראפינפרין וסרוטונין הוערכו כתרכובות התייחסות, אבל תגובות של העורק ווריד mesenteric היו משתנים מדי על פני סוג כלי ועל פני בעלי חיים להם לשמש בהצלחה. לעומת זאת, התוספת של 120 מ"מ KCl הביאה תגובה מאוד לשחזור פני שני הכנות העורק ווריד.סימפוני, תגובות עורק והווריד הוערכו היום של איסוף וההערכה מחודשת 24 הודעה שעה איסוף ולא היו הבדלים בתגובה אגוניסט או על ידי העורק או הווריד. זה היה היבט חשוב של המבדק, כפי שיש לעתים קרובות מספר גדול של טיפולים (או שילובי טיפול שונים) שניתן ליישם, אך חוקרים מוגבלים על ידי המרחב בmyograph והזמן. על ידי הארכת תקופת הכדאיות החוצה 24 שעות מאוסף, הזמן לניסויים נוספים הוא גדל מאוד.

זה חשוב לחוקר להבין את הגמישות של מבנה הטיפול מיושם על המבדק זה. חוקר יכול להוסיף כל מתחם למאגר הדגירה שהוא או היא מעוניין בחשיפה כרונית של כלי הדם לכדי לשלוט משהו רלוונטי ביולוגי או כטיפול (במקרה של et al קלוץ. 17, זה נעשה עם ורידי saphenous רוחב נחשפו ברציפות לKEtanserin, שקומם קולט סרוטונין של ריבית). כלי דם mesenteric יכולים להיות pretreated עם תרכובת של עניין לפני ביצוע ניסוי תגובת התכווצות. המבדק, כפי שהוצג, נועד לנהל ניסוי תגובת ריכוז מצטבר מסתכל על אלקלואידים ergot כאגוניסטים והאם חשיפה תזונתית לפני אלקלואידים ergot השפיעו על התגובה של כלי דם 18. תוצאות הנציג מראות כי שיטה זו יכולה לייצר תגובה של כלי דם למדידה ורק ארבעה ריכוזים שמשו כדי להשיג זאת. במקרה של אגרט et al. 18, היו עד 10 ריכוזים שונים המשמשים לבניית עקומת תגובה. שיטה זו היא דרך להעריך מספר גדול של תרכובות או קולטנים על כלי דם שונים מבעלי חיים יחידים בחלון קטן של זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אזכור של שם המסחרי, מוצר קנייני, או ציוד שצוין אינו מהווה ערובה או אחריות על ידי משרד החקלאות ואינו מעיד על אישור להרחקה של מוצרים אחרים שעשויה להיות זמין.

Acknowledgments

המחברים מודים ריאן צ'פלין וד"ר גרג Rentfrow של אוניברסיטת קנטאקי המעבדה בשרים והמחלקה לבעלי החיים ומדעי מזון למתן הזדמנויות לאיסוף רקמות ניסיוניות מנוצלות במסמך זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. Regulation of intestinal blood flow. The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).
  2. Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  4. Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
  5. Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
  6. Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
  7. Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
  8. Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
  9. Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
  10. Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child Springer-Verlag. (1978).
  11. Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
  12. Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
  13. Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
  14. Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
  15. Smith, D. F. Bovine intestinal surgery. Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).
  16. Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
  17. Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
  18. Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics