عزل وعن طريق أقسام الأبقار الشريان والوريد المساريقي باعتباره الأحيائي لاختبار لVasoactivity في الأمعاء الدقيقة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وكثيرا ما تتعرض الأمعاء الدقيقة للسموم التي يمكن أن تؤثر على تدفق الدم وتؤثر سلبا على امتصاص العناصر الغذائية. باستخدام الشريان المساريقي وmultimyograph ويعزل الوريد، المركبات أو السموم من الفائدة يمكن فرزهم لvasoactivity.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يتعرض الجهاز الهضمي الثدييات باستمرار لمركبات (المرغوبة وغير المرغوبة) التي يمكن أن يكون لها تأثير على تدفق الدم من وإلى هذا النظام. التغيرات في تدفق الدم إلى الأمعاء الدقيقة يمكن أن يؤدي إلى آثار على وظائف الاستيعابية للجهاز. وقد وضعت مصلحة خاصة في السموم تتحرر من الأعلاف من خلال عمليات التخمر والهضم في المجترات كمجال حيث يمكن تحسين الكفاءة الإنتاجية. الفيديو المرتبطة بهذا المقال يصف الأحيائي في المختبر وضعت لمركبات الشاشة لvasoactivity معزولة في المقاطع العرضية من الشريان المساريقي البقري والوريد باستخدام multimyograph. مرة واحدة هي التي شنت الأوعية الدموية ومعايرتها في مخطاط العضل، والأحيائي نفسها يمكن استخدامها: كأداة فحص لتقييم الاستجابة مقلص أو vasoactivity من المركبات المصالح؛ تحديد وجود أنواع مستقبلات خلال استهداف دواء مستقبلات مع ناهض محددق. تحديد دور مستقبلات مع وجود واحد أو أكثر من الخصوم. أو تحديد التفاعلات المحتملة للمركبات في المصالح مع الخصوم. من خلال كل هذا، يتم جمع البيانات في الوقت الحقيقي، والأنسجة التي تم جمعها من حيوان واحد يمكن أن يتعرض لعدد كبير من العلاجات التجريبية المختلفة (ميزة في المختبر)، ويمثل الأوعية الدموية على جانبي السرير الشعرية لتوفير دقة صورة لما يمكن أن يحدث في وارد وصادر دعم إمدادات الدم إلى الأمعاء الدقيقة.

Introduction

التغيرات في تدفق الدم إلى الأنسجة سرير يمكن أن يكون لها تأثير كبير على وظيفة الجهاز. والوظيفة الرئيسية من الأمعاء الدقيقة لامتصاص العناصر الغذائية. مطلوب تدفق الدم الشرياني إلى السطح الاستيعابية للامعاء لامتصاص تدفق الدم وزيادة المغذيات للمساعدة في امتصاص العناصر الغذائية كما هضامة التحركات على طول السطح 1. وحدث انخفاض في تدفق الدم يمكن أن يسبب انخفاض في امتصاص العناصر الغذائية بسبب انخفاض في الانحدار بطريق الظهارة 2. بالإضافة إلى المواد الغذائية، ويمكن أيضا أن يتعرض الأمعاء الدقيقة إلى نواتج الأيض الثانوية، والمخدرات، أو السموم التي تمارس تأثير على تدفق الدم الموضعي في مساريق. في حالة الحيوانات المجترة، والمركبات يمكن ان تتحرر من الاعلاف (مثل المواد الغذائية مثل الأحماض الأمينية، أو السموم مثل قلويدات الشقران) من خلال عمليات التخمر من المعى الأمامي. إذا كانت هذه المركبات البقاء على قيد الحياة الأيض الميكروبي التخمير الكرش، فهي الآن متاحة للامتصاصأو التفاعل أثناء سفرهم من خلال القناة الهضمية للحيوان.

هناك عدد من الأساليب المختلفة المتاحة لقياس تدفق الدم في الجسم الحي (على سبيل المثال، دوبلر بالموجات فوق الصوتية، ساكن مقاييس التدفق الدم، رديولبلد المجهرية، وتقنيات مؤشر-تمييع) التي تسمح تقييم السيناريوهات المختلفة أو العلاجات التجريبية. ومع ذلك، للحصول على معلومات حول الخصائص الميكانيكية أو الدوائية من العضلات الملساء الوعائية، وظلت أساليب محدودة للسفن الكبيرة حتى Mulvany وهالبيرن 3 نشرت مقالا يصف التقنية باستخدام سلك شنت الاستعدادات حلقة الأوعية الدموية في مخطاط العضل. منذ تطوير هذه التقنية ما زالت التعديلات التي ينبغي إدخالها على النظم المرتبطة مخطاط العضل التي تسمح مجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة لتقييم الهياكل الأنبوبية. كما تم تكييف هذا النظام لاستخدام قضبان ثابتة لتركيب السفن الكبيرة 4 حيث نضحلم يتم المطلوب التقنيات.

بسبب الاختلاف في السفن من أصول التشريحية المختلفة والفروق في نفس السفن من أنواع مختلفة من الحيوانات، والبيانات من السفينة ونوع الحيوان لا يمكن بسهولة استقراء عبر السفن المختلفة أو نفس السفينة في أنواع حيوانية مختلفة 5. وبالتالي، يجب تطوير اختبارات بيولوجية منفصلة والتحقق من صحة أي وقت يتم تغيير هذه الجوانب. في الآونة الأخيرة تم تطوير عدة اختبارات بيولوجية مع هذه التقنيات لاستخدامها في الماشية الوحشي الوريد الصافن والشريان والوريد الأيمن الكرش 6،7.

وقد وضعت هذه الأحيائي للتحقيق على وجه التحديد الآثار التي قلويدات الشقران لها على دعم الأوعية الدموية في الأمعاء الدقيقة. أفيد بأن 50-60٪ من القلويدات تغذية تظهر في محتويات ابوماسال، ولكن يتم استرداد 5٪ فقط في البراز 8. وذكر ستريكلاند وآخرون. 9 في مراجعة قلويدات الشقران، التي سوج البيانات المتاحةطبقا لتقديرات أن الأمعاء الدقيقة قد تكون أهم موقع لامتصاص ergopeptine. إيكرت وآخرون 10 الجوانب الصيدلانية البيولوجية استعرض قلويدات من الشقران وذكرت أنه بمجرد عبورهم الحاجز الظهاري، ويتم نقل قلويدات الشقران إما عن طريق الجهاز اللمفاوي إلى الوريد تحت الترقوة أو عن طريق الوريد المساريقي والى الدم البابي. رودس وآخرون 11 سجلت انخفاضا في تدفق الدم إلى الاثني عشر والقولون في يرسم تستهلك عالية المصابة نابوت داخلي (عالية الشقران قلويد) النظام الغذائي. باستخدام الصحيح الكرش الشريان والوريد الأحيائي، فوت وآخرون 12 أثبتت أن قلويدات الشقران هي فعال في الأوعية في الأوعية الدموية الكرش. فوت وآخرون 13 أظهرت في وقت لاحق في الجسم الحي أن التعرض الكرش إلى نتائج قلويدات الشقران في الكرش انخفاض تدفق الدم الظهارية. هذا الانخفاض في تدفق الدم إلى السطح الاستيعابية للالكرش تسبب بالتزامن انخفاض في المغذيات (الأحماض الدهنية المتطايرة) تدفق. نظرا لتشوantity من قلويدات الشقران يمر إلى الأمعاء الدقيقة من المعى الأمامي. كان الافتراض بأن تأثير مماثل على الأوعية الدموية في الأمعاء الصغيرة وامتصاص العناصر الغذائية يمكن أن يحدث. هذا استلزم تطوير البقري القريبة الشريان المساريقي اللفائفي والوريد الأحيائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ولم الإجراءات المستخدمة في هذه الدراسة لا تتطلب موافقة من جامعة كنتاكي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة لأنه تم استخدام أي الحيوانات الحية. قبل جمع أي عينة المستخدمة هنا، وقد فاجأ جميع الحيوانات مع الترباس الأسير وexsanguinated. وقد أجريت هذه في منشأة مسلخ تفقد اتحاديا في جامعة كنتاكي. لاحظ ممثل رسمي لسلامة الأغذية والتفتيش الخدمة USDA جميع الأنشطة التي تناولت الحيوانات الحية والتعامل مع الذبيحة.

1. إعداد الأجهزة

  1. لتقليل مقدار الوقت بين مجموعات من عينات الأنسجة إلى بداية تجربة، نصب المعدات وإعداد مخازن قبل جمع الأنسجة التجريبية (أو إذا هم أفراد إضافيين المتاحة، يمكن أن تحدث هذه المهام في وقت واحد).
    ملاحظة: هذا ليس فقط يوفر أكبر قدر من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة لإجراء التجارب، ولكن بعضيمكن أن تجارب تشغيل لفترات طويلة من الزمن (أو أن هناك رغبة في إكمال تجارب متعددة في يوم واحد)، لذلك فإنه عادة ما يكون من المرغوب فيه أن تبدأ في أقرب وقت ممكن.
  2. السلطة حتى الكمبيوتر المرتبطة بها، المعدات الاستحواذ البيانات، حمام الماء (لعازلة (ق)) ومخطاط العضل وحدة (ق). وضع معايرة المعدات على الوحدة مخطاط العضل (ق) وتشغيل الحرارة مخطاط العضل (مسبقا إلى 37.5 درجة مئوية) والسماح الوحدات والمعدات المعايرة لتدفئة مسبقا لدرجات الحرارة.
    1. فتح ملف إعدادات برنامج مخطط إنشاؤها مسبقا على الكمبيوتر والبدء في تشغيل (ولكن ليس الحصول على البيانات).
  3. الاحماء المعدات لمدة 10 دقيقة.
    1. بدء الحصول على البيانات.
    2. جميع القنوات الصفر.
    3. تحقق، وإجراء معايرة (إذا لزم الأمر) على كل قناة (4 قنوات في multimyograph) لتوحيد الإشارات الكهربائية الموردة من محول قوة كل منها يرتبط مع تلك القناة إلى قوة 2-G المقدمة من وزن المعتمدة.
    4. بعد الانتهاء من المعايرة وتحويل الوحدات، وتخزين جميع البيانات اللاحقة كما غراما. تغيير وفقا لذلك بناء على رغبات كل مختبر مستقل. المعدات والبرمجيات تسمح باستخدام وحدات أخرى، مثل milliNewtons وفولت.
  4. تأكد من أن خطوط الغاز واضحة من العقبات وبدوره على امدادات الغاز (95٪ O 2/5٪ CO 2) لمخطاط العضل (ق) وحدة. بالغاز المتواصل لجميع مخازن (في غرف مخطاط العضل) خلال الإجراء بأكمله.
  5. ملء جميع غرف مخطاط العضل مع الايثانول 70٪ وينقع لمدة 10 دقيقة، وإزالة الإيثانول، وأكرر للمرة الثانية 10 دقيقة نقع.
    1. بعد إزالة الإيثانول، شطف ثلاث مرات مع الماء منزوع الأيونات، تليها ثلاث يشطف مع استعداد عازلة (انظر القسم 2 لإعداد عازلة)، وترك بالإضافة الثالثة من العازلة في غرف.
      ملاحظة: عند هذه النقطة المعدات يمكن أن يبقى خاملا في هذه الحالة حتى يتم إعداد العازلة والأنسجة والموظفين على استعداد للمضي قدما في التجربهر.

2. إعداد المخازن المؤقتة

  1. إعداد 1 L-كريبس هنسلايت حل العازلة لاستخدامها في النقل وتجهيز عينات الأنسجة لتحقيق تركيزات النهائية من 11.1 ملي مد الجلوكوز. 1.2 ملي MgSO 4. 1.2 ملي KH 2 PO 4. 4.7 ملي بوكل. 118.1 مم كلوريد الصوديوم. 3.4 مم CaCl 2. 24.9 مم 3 NaHCO.
    1. خلط 9.6 غرام من أملاح كريبس إلى حوالي 900 مل من الماء منزوع الأيونات على طبق من ضجة.
    2. خلط في 0.373 جم كلوريد الكالسيوم يذوى تليها 2.1 غرام بيكربونات الصوديوم لكل لتر من العازلة المطلوب.
    3. حل العازلة الغاز لمدة 20 دقيقة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2.
    4. بعد بالغاز، وضبط درجة الحموضة إلى 7.05 (الترشيح من العازلة يزيد درجة الحموضة، وينبغي أن يكون الهدف النهائي درجة الحموضة 7.4) وضبط مستوى الصوت إلى 1 L.
    5. فلتر تعقيم عازلة في تعقيمها وسائل الإعلام 1 L زجاجة وتخزين عازلة نظيفة في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. إعداد منفصل كريبس-Hحل العازلة enseleit للاستخدام في التجارب مخطاط العضل كما هو موضح في الخطوة 2.1 لنقل كريبس-هنسلايت العازلة مع مركبات إضافية تتعلق التجارب انقباض.
    ملاحظة: عادة 2 L لن يكون كافيا لإجراء التجارب الموضحة في هذه المقالة، ولكن قد يحتاج هذا الحجم إلى زيادة أو تخفيض على أساس طول التجربة، وعدد من الغرف مخطاط العضل، واستبدال عازلة عدد (نسبة إلى الإضافات العلاج).
    1. قبل الخطوة بالغاز (الخطوة 2.1.3)، إضافة 9.1 ملغ (لكل لتر من العازلة التي يجري إعدادها) من حمض الهيدروكلوريك ديسيبرامين لالعازلة.
    2. إعداد محلول 1.0 ميكرومتر من بروبرانولول، حمض الهيدروكلوريك وإضافة 1 مل (لكل L من العازلة التي يجري إعدادها) من هذا الحل إلى حل العازلة كريبس-هنسلايت. جعل هذا المخزن المؤقت في يوم من الاستخدام والحفاظ على مخطاط العضل تعمل درجات الحرارة (درجة الحرارة التي تعطي 37.5 درجة مئوية درجة الحرارة في مخطاط العضل).
      وأضاف ديسيبرامين لكبح آليات امتصاص أمين الاحيائية: ملاحظةوالسماح المقاصة من الإضافات التجريبية من المخزن المؤقت الاستحمام الأوعية الدموية تحدث بسرعة أكبر. إضافة بروبرانولول يمنع ملزم من المركبات العلاج لβ-مستقبلات الأدرينالية غير محددة.

3. جمع وإعداد الأوعية الدموية

  1. في أقرب وقت ممكن، وإزالة الجهاز الهضمي من الذبيحة. مرة واحدة الحيوان لم يعد يسلك أي رد فعل غير الطوعي، وإزالة الرأس وإخفاء ومن ثم رفع الجثة عموديا. وينبغي الانتهاء من إزالة الأحشاء الهضمية (المريء إلى فتحة الشرج) من الذبيحة قبل موظفي المسالخ المعتمدة (<20 دقيقة من وقت مذهلة).
    ملاحظة: كيف قريبا، وتقتصر عادة من قبل موقع / منشأة حيث يتم جمعها من الأمعاء وإجراءات التشغيل القياسية أو إجراءات تكليف اتحادي تليها موظفي المرفق.
    1. في معظم المرافق، وإجراء معالجات الجهاز الهضميفي مكان منفصل عن تجهيز الذبيحة التي كانت متجهة لدخول الإمدادات الغذائية. استخدام موقع مناسب قريب حيث يمكن أن تؤخذ في الجهاز الهضمي وتنتشر لفحصها.
  2. بمجرد نشر الجهاز الهضمي بها، التعرف على الأمعاء الدقيقة، حظيرة اللفائفية ربط الأمعاء الدقيقة إلى الأعور، وشفة اللفائفية توسيع الأقرب إلى حظيرة اللفائفية (الشكل 1A).
    1. باستخدام مشرط أو سكين، وجعل طفيفة جدا شق في الغشاء المساريقي في وسط شفة اللفائفية. باستخدام اثنين من السبابة، تشريح بصراحة بعيدا عن الأنسجة الدهنية والضامة تعرض الأوعية الدموية المساريقي (الشكل 1B).
  3. من هذا شفة أو انتفاخ في مساريق الأمعاء، تشريح خارج فروع متعددة (~ 2 سم في الطول) من الشريان والوريد المساريقي حزم تتعرض التي تدعم هذا الجزء من الدقاق (الشكل 1C).
    1. إذا شالغناء ملقط لفهم الأنسجة، والحرص على عدم فهم أو سحب مباشرة على الأوعية الدموية في كل حين إزالتها عن أي نوع من التمدد يمكن أن تلحق الضرر وتؤثر سلبا على أداء النسيج 14. من الأفضل القيام إزالة الأوعية الدموية، عن طريق خفض عبر كل نهاية القسم المراد إزالتها ومن ثم خفض إلى جانب أو موازية لقسم معزولة الآن. لسهولة، إزالة بعض الأنسجة المحيطة بها جنبا إلى جنب مع السفن لتوفير بعض الأنسجة لفهم مع زوج من ملقط.
    2. مع زوج من ملقط، غمر عينة الأنسجة في أنبوب يحتوي على الجليد الباردة العازلة كريبس-هنسلايت وتخزينها على الجليد حتى يمكن أن تحدث في تجهيز المختبر.
  4. وضع عينة الأنسجة على سطح القطع أو في طبق بتري وغمر جزئي في الجليد الباردة كريبس-هنسلايت.
    1. باستخدام # 5 ملقط المجوهرات، نويس قزحية مقص، ومصباح المكبرة أو تشريح النطاق (2.5 إلى 5.0X التكبير يكفي)، تشريح بعناية بعيدا المحيطة connecti الدهون ولقد الأنسجة وفصل الشريان والوريد. تحديد افتتاح سفينة في واحدة من نهاية القسم بعناية وفهم اللفافة المحيطة السفينة مع ملقط.
    2. جعل قطع مع مقص موازية للسفينة عن طريق تحريك غيض من مقص تحت اللفافة التي أثيرت. بعد شق الأولي، والدهون والأنسجة الضامة يمكن فصل مزيد من السفينة عن طريق خفض جانبي مع مقص. تأكد من أن السفن نظيفة قدر الإمكان مع تقليل مقدار الوقت الأوعية تنفق على مقاعد البدلاء.
    3. العودة الأوعية الدموية إلى أنابيب جديدة عازلة كريبس-هنسلايت وتخزينها في 4 ° C (عينات يمكن أن تبقى مخزنة لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد جمع البيانات والتي لا تزال تنتج انقباض صالحة).
    4. باستخدام شفرة حلاقة، سفينة شريحة لاستخدامها في مخطاط العضل إلى العدد المرغوب فيه من القسمين 2 ملم (فمن المفيد استخدام تقطيع الأنسجة للحصول متسقة المقاطع العرضية).
    5. دراسة كل قسم تحت تشريح منظمة شانغهاى للتعاونPE (12.5X التكبير) لضمان أن كل قسم ليس لديه شذوذ والفروع والصمامات، أو تلف سطحي القيام به عن غير قصد أثناء تشريح والتنظيف. استبدال الباب السفينة إذا كان هناك أي خلل، فرع، صمام، أو أضرار سطحية.
  5. مخزن مقبولة أقسام شرائح سفينة (المغمورة في المخزن كريبس-هنسلايت) على الجليد أو على 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتركيب في غرف مخطاط العضل (عادة <30 دقيقة).
  6. جبل بلطف السفينة على مخطاط العضل عن طريق إدراج الدعم من خلال التجويف وزيادة التوتر (باستخدام micropositioner على مخطاط العضل) والحرص على أن لا تمتد الأوعية فوق 2 إلى 3 غرام القراءة.
  7. مرة واحدة يتم تغطية جميع الدوائر، فراغ العازلة من جميع الغرف وإعادة ملء مع 5.0 مل من العازلة وبدء الموقت 15 دقيقة لبدء فترة موازنة والتجربة.

4. تجربة

  1. تتوازن جميع أقسام السفينة عن 1.5 ساعة لتحقيق الدقة مستقرةتينغ التوتر من 1.0 غرام.
    1. استبدال المخزن المؤقت حضانة كريبس-هنسلايت كل 15 دقيقة.
    2. خلال موازنة، وضبط باستمرار التوتر على أقسام الأوعية الدموية لتصل إلى 2 ز ومن ثم السماح للاسترخاء وصولا الى حوالي 0.80 غرام. ليس محاولة للسماح للاسترخاء الأوعية كثيرا (أنها قد تنزلق قبالة يتصاعد). محاولة لتحقيق التوتر الأساسي ثابتا، حيث تحمل السفينة 1 غرام التوتر دون الحاجة إلى تعديل.
  2. خلال موازنة، إعداد مائي 1.32 M حل بوكل لاستخدامها كمرجع.
  3. بعد الانتهاء من موازنة مرضية، إضافة 500 ميكرولتر من M بوكل 1.32 حل أن يؤدي إلى 0.12 M الحل في حل 5.5 مل الاستحمام السفينة.
    1. بعد اضافة 1.32 M بوكل، لا ضبط التوتر يدويا كما يتم استخدام الاستجابة القصوى من هذا بالإضافة إلى تقييم الجدوى الأنسجة، ويمكن استخدامها لتطبيع بيانات العلاج (على سبيل المثال الردود على تركيز لgonist).
    2. استبدال عازلة في فترات من 15 دقيقة حتى عاد التوتر إلى قيمة خط الأساس من 1.0 غرام.
  4. حالما يتم التوصل إلى خط الأساس، وتغيير العازلة وتبدأ في وقت واحد الموقت 1 دقيقة. القيام بذلك في وقت واحد لجميع الدوائر لتجنب مذهلة من أوقات البدء.
    1. دوامة القياسية التي يمكن ان تضاف وإعداد تعليق لغرفة 1 خلال العد التنازلي 1 دقيقة.
    2. إضافة المعايير في 25 مكل لكل غرفة كما يمليه التجربة (وهذا يحافظ على العلاج أقل من 0.5٪ من إجمالي حجم).
    3. عندما تمت إضافة معيار الماضي، بدء الموقت 9 دقائق.
    4. في نهاية الحضانة 9 دقائق القياسية، وإزالة المنطقة العازلة التي تحتوي على العلاج من غرف وإضافة 5.0 مل من العازلة الطازجة، وبدء الموقت 2.5 دقيقة.
    5. كرر الخطوة 4.4.4.
    6. في نهاية الثاني 2.5 دقيقة شطف، فراغ وإضافة غرف عازلة جديدة، وبدء الموقت 1 دقيقة العد التنازلي لبدء الشركة السعوديةد بالإضافة القياسية.
  5. تستمر هذه الدورة لجميع الإضافات لهذا اليوم القياسية.
  6. خلال إضافة معيار النهائية واللاحقة 9 دقائق حضانة إعداد 1.32 M بوكل مجمع إشارة إلى وضع حد للإشارة المدى إضافة جرعة من 500 ميكرولتر.
  7. بعد فاصل 1 دقيقة بعد إضافة المعالجة النهائية، إضافة بوكل وبدء توقيت 9 دقائق.
    ملاحظة: إضافة بوكل هي لتأكيد جدوى الأنسجة في ختام التجربة ومفيدة إذا إدارة العلاج الذي يؤدي إلى استجابة تذكر.
  8. في ختام المباراة النهائية 9 دقيقة مركب إشارة الحضانة، فراغ أو إزالة العازلة من كل دائرة من الدوائر. لا تضيف عازلة الطازجة. اختتام التجربة.
  9. حفظ ملف الرسم البياني، وإزالة الأجزاء الأوعية الدموية والتخلص منها بشكل سليم، واتباع بروتوكول تنظيف (المقدمة من قبل الشركة المصنعة، ويمكن أن تكون محددة LAB) لمعدات مخطاط العضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم جمع الأوعية الدموية تستخدم لتوليد النتائج المتضمنة في الفترة من 6 يرسم هولشتاين (425 ± 8 كلغ) ضمن فترة 3 أسابيع. ويرد مثال على استجابة الوريد المساريقي نموذجي مقلص لبوكل والإضافات العلاج زيادة في التركيز في الشكل 2. سيكون حجم الاستجابة تختلف بعض مع حجم السفينة (المترابطة مع حجم الحيوان المانحة)، ولكن يمكن أيضا تتأثر (سلبا) من خلال سوء التعامل (تمتد) من السفن خلال جمع والتنظيف. ولذلك، فمن المهم أن نلاحظ استجابة مقلص كبيرة في التعرض للسفن بوكل. إذا لوحظ استجابة ضئيلة في هذه المرحلة، فمن غير المستحسن المضي قدما إلى أبعد من ذلك إلى الإجراء مع تلك السفينة. كما رأينا في فترات الحضانة 9 دقائق في الشكل 2، وهناك زيادة تدريجية في الاستجابة التي تتوافق مع زيادة تركيزات. على الرغم من المرغوب فيه لهذا particالتصميم التجريبي الجزيئية، فإنه قد لا يحدث دائما أو يكون سعى بعد مع أي علاجات أخرى. إضافة بوكل في ختام التجربة، على الرغم من عدم استخدامها في معالجة البيانات التي تم جمعها، مهم جدا لأنه يؤكد بقاء الأنسجة في ختام الفترة التجريبية (يصبح أكثر أهمية إذا كانت السفينة لا يستجيب إلى أي من الإضافات العلاج).

يتم تسجيل البيانات الواردة في الشكل 2 في غرام من التوتر. من المهم أن تطبيع هذه البيانات للحد من أي والحيوان لحيوان والاختلاف سفينة إلى سفينة. وهكذا، بالإضافة إلى استخدامها كمؤشر للبقاء، ويستخدم الحد الأقصى للاستجابة لتطبيع بوكل كل الإضافات العلاج. هذا يولد البيانات استجابة مقلص كنسبة مئوية من الحد الأقصى بوكل. هذه هي الطريقة الشريان المساريقي والاستجابة منحنيات الوريد إلى تركيز متزايد من 5 هيدروكسي (السيروتونين، الشكل 3) والنورادرينالين (

بدأت استجابة الوريد المساريقي على حد سواء 5 هيدروكسي (الشكل 3) والنورادرينالين (الشكل 4) من قيم سلبية. هذا هو نتيجة تصحيح أقصى التوتر سجلت خلال كل فترة الحضانة 9 دقائق من التوتر خط الأساس سجلت قبل إضافة بوكل الأولية. هذا التصحيح الأساسي يضمن أن أي اختلافات طفيفة في التوتر ليست مدرجة في التحليلات والسماح البيانات المقدمة لتعكس سوى تغير في التوتر. نتائج قيمة سالبة من الأوعية الدموية الاسترخاء وانخفاضه إلى ما دون مستويات خط الأساس قبل بوكل قبل إضافة معالجة لاحقة. وهذا أمر شائع خاصة في عينات الوريدية حيث تركيزات الأولية للعلاج أو ناهض منخفضة للغاية لإحداث استجابة مقلص. لم يكن هذا هو الحال بالنسبة للي استجابة الشريان senteric إما أمين الاحيائية، التي عقدت التوتر فوق خط الأساس حتى بدأت السفينة للرد على الإضافات العلاج. هذا الاختلاف يجسد الاختلافات في السفن على جانبي السرير الشعرية ولماذا كانت كل من اعتبارها جزءا من هذا الأحيائي.

هذا الأحيائي يمكن استخدامها لتقييم vasoactivity من المركبات على الأوعية الدموية توريد المواد الغذائية إلى الأمعاء الدقيقة وكذلك الأوعية الدموية التي تحمل المواد الغذائية بعيدا عن امتصاص الأمعاء الدقيقة. البيانات في أرقام 3 و 4 هي أمثلة بسيطة عن كيفية هذا يمكن إنجازه. في حالة 5 هيدروكسي (الشكل 3)، لم يكن هناك فرق في الشرايين أو استجابة مقلص الوريدية. على العكس، كانت الاستجابة مقلص من الوريد المساريقي إلى زيادة تركيزات بافراز أكبر من أن الشريان المساريقي.

جوري 1 "FO: محتوى العرض =" 3in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "العرض =" 300 "/>
الشكل 1: مثال على الأمعاء البقري تستخدم كمصدر الأوعية الدموية المساريقي تشير النجمة الحمراء الجزء المرئي من حظيرة اللفائفية في جميع الأجزاء الثلاثة كنقطة مرجعية. (A) والجهاز كله مع البيضاوي الأحمر يدل على شفة اللفائفية حيث وقعت أخذ عينات من الأوعية الدموية. (B) التعرض من السرير الوعائي المساريقي. المقص (C) إيريس تشير نحو غصن المكشوفة من الوريد المساريقي (مرئية) والشريان (غير مرئي) فقط قبل المجموعة.

الشكل 2
الشكل 2: مثال على استجابة تركيز الوريد المساريقي إلى زيادة تركيزات بافراز (1 × 10 -7 إلى 1× 10 -4 M). أحداث كبيرة في بداية ونهاية التتبع الردود على 0.12 الإضافات M بوكل. المستطيل الأحمر يدل على جمع البيانات المنطقة المقابلة مع فترة الحضانة 9 دقائق عن كل إضافة العلاج. المسامير 3 نحيلة التي تتبع هذا هي التحف التي تولدها بدائل العازلة والتي لم تدرج في التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3: يعني الردود مقلص الشريان المساريقي (MA) والوريد (MV، ن = 6 يرسم) إلى زيادة تركيزات 5 هيدروكسي (السيروتونين) خطوط أفلاما تم إنشاؤها باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية لاحتواء البيانات إلى السيني. تركيز صمنحنى esponse التي تستخدم المعادلة التالية: ص = أسفل + [(أعلى - أسفل) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - خ))]، حيث أعلى وأسفل هي نسبة 120 ملي بوكل استجابة أقصى مقلص في الهضاب، وEC 50 هي التركيز المولي من قلويد إنتاج 50٪ من الحد الأقصى للاستجابة بوكل.

الرقم 4
الشكل 4: يعني الردود مقلص الشريان المساريقي (MA) والوريد (MV، ن = 6 يرسم) إلى زيادة تركيزات بافراز خطوط أفلاما تم إنشاؤها باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية لاحتواء البيانات إلى منحنى استجابة تركيز السيني الذي يستخدم. المعادلة التالية: ص = أسفل + [(أعلى - أسفل) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - خ))]، حيث أعلى وأسفل هي نسبة الحد الأقصى 120 ملي بوكل جontractile ردا على الهضاب، والمفوضية الأوروبية 50 هو التركيز المولي من قلويد إنتاج 50٪ من الحد الأقصى للاستجابة بوكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كان التحدي الأولي في تطوير هذا الأحيائي وإنشاء موقع لجمع تكرار الأوعية الدموية المساريقي. عينة الموقع الاتساق أمر بالغ الأهمية، حيث أن بعض مهام التغيير الأمعاء الدقيقة خلال التقدم من الصائم من خلال الدقاق وبالتالي مساريق تختلف في نمط مماثل. كانت فروع الشريان المساريقي اللفائفية من والوريد الأكثر التعرف عليها بسهولة من خلال المعالم التشريحية. من خلال تحديد موقع الأعور وبعد اللفائفية أضعاف إلى محطة على الجانب الأيسر من مساريق، وهذا هو قرب انتهاء الجمجمة الشريان المساريقي 15. (وهو ما يسمى شفة) مجال مساريق أطول وتمديد اللفائفية أضعاف (فريد للحيوان البقري) 16 العينات التي عبر العديد من الحيوانات متكررة جدا. واحدة من أكبر المزالق التي يمكن تقديمها هو في هذه المرحلة من الأحيائي. تمتد الميكانيكية له تأثير سلبي كبير على اللاحق السفينة صسوف erformance 14 والباحث تلاحظ أن السفن التي يتم التلاعب بها بشكل مفرط أو تمدد أثناء إزالة والتنظيف لاحقا لن تستجيب لمجمع المرجعية المستخدمة. للأسف هذا هو السبيل الوحيد لتقييم حقا نوعية إعداد الأوعية الدموية على مستوى وظيفي والسفن التي لا تستجيب لبوكل لا ينبغي مواصلة النظر لتوليد البيانات الموثوقة.

كانت خطوتين التحقق من صحة طريقة أخرى (لا يظهر) التي أدت إلى الطريقة النهائية المقدمة هنا استخدام مواد كيميائية أخرى مثل مركبات المرجعية واختبار قابلية الأوعية الدموية التالية تخزين 24 ساعة. تم تقييم بافراز والسيروتونين والمركبات المرجعية، ولكن كانت ردود الشريان والوريد المساريقي متغير جدا عبر نوع السفينة وعبر الحيوانات بالنسبة لهم لاستخدامها بنجاح. على العكس، أدت إضافة 120 ملي بوكل في رد استنساخه جدا عبر كل من الشريان والوريد الاستعدادات. ويسوتو، وجرى تقييم الاستجابات الشريان والوريد يوم جمع وإعادة تقييم جمع آخر 24 ساعة ولم تكن هناك اختلافات في الاستجابة ناهض إما عن طريق الشريان أو الوريد. كان هذا جانب هام من جوانب الأحيائي، كما أن هناك في كثير من الأحيان عددا كبيرا من العلاجات (أو مجموعات العلاج المختلفة) التي يمكن تطبيقها، لكن الباحثين محدودة بسبب المساحة على مخطاط العضل والوقت. من خلال تمديد فترة بقاء من 24 ساعة من جمع والوقت للتجريب إضافي يتم زيادة بشكل كبير.

من المهم للباحث أن يفهم المرونة في هيكل المعالجة المطبقة في هذا الأحيائي. باحث يمكن إضافة أي مركب إلى المخزن المؤقت الحضانة انه او انها غير مهتمة في فضح مزمن في الأوعية الدموية لمن أجل السيطرة على شيئا من أهمية بيولوجية أو كعلاج (في حالة كلوتز وآخرون 17، وقد تم ذلك مع الأوردة الصافن الجانبية تتعرض باستمرار لكهtanserin الذي أغضب مستقبلات السيروتونين من الفائدة). يمكن سابقة التجهيز الأوعية الدموية المساريقي مع مجمع الفائدة قبل إجراء التجربة استجابة مقلص. الأحيائي، كما وردت، وقد صمم لإجراء التجربة التراكمية استجابة تركيز النظر في قلويدات الشقران ومنبهات وعما إذا كان التعرض الغذائي قبل قلويدات الشقران أثرت على استجابة الأوعية الدموية 18. وتظهر نتائج تمثيلية أن هذا الأسلوب يمكن أن تنتج استجابة الأوعية الدموية قابلة للقياس واستخدمت تركيزات أربعة فقط لتحقيق ذلك. في حالة إيغرت وآخرون 18، كان هناك ما يصل إلى 10 تركيزات مختلفة تستخدم لبناء منحنى الاستجابة. هذا الأسلوب هو وسيلة لتقييم عدد كبير من المركبات أو المستقبلات على الأوعية الدموية المختلفة من حيوان واحد في نافذة صغيرة من الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا تشكل ذكر الاسم التجاري، والمنتج الملكية، أو المعدات المحددة كفالة أو ضمان من قبل وزارة الزراعة ولا يعني الموافقة على استبعاد غيرها من المنتجات التي قد تكون متاحة.

Acknowledgments

المؤلفون تقر ريان شابلن والدكتور جريج Rentfrow من جامعة كنتاكي اللحوم مختبر وقسم علوم الأغذية الحيوانية وتوفير فرص لجمع الأنسجة التجريبية المستخدمة في هذه الوثيقة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. Regulation of intestinal blood flow. The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).
  2. Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  4. Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
  5. Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
  6. Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
  7. Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
  8. Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
  9. Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
  10. Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child Springer-Verlag. (1978).
  11. Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
  12. Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
  13. Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
  14. Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
  15. Smith, D. F. Bovine intestinal surgery. Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).
  16. Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
  17. Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
  18. Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics