생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

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Summary

소장은 자주 혈액 흐름에 부정적인 영향을주고 영양분 흡수에 영향을 미칠 수있는 독소에 노출된다. , 화합물 또는 관심의 독소를 multimyograph 및 장간막 동맥을 사용하고 정맥 분리하는 vasoactivity에 대한 검사를 할 수 있습니다.

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Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

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Abstract

포유류의 위장 시스템은 지속적으로 해당 시스템으로부터 혈류에 영향을 미칠 수있는 화합물 (바람직한 및 바람직하지 않은)에 노출된다. 소장에 혈액 흐름의 변화는 기관의 흡수 기능에 대한 효과가 발생할 수 있습니다. 발효와 소화 과정을 통해 사료에서 해방 독소에 특히 관심이 생산 효율성을 개선 할 수있는 영역으로 반추 동물에서 개발했습니다. 이 문서와 관련된 비디오는 소 장간막 동맥의 고립 된 단면에서 vasoactivity과 multimyograph를 사용하여 정맥 화면 화합물을 개발 한 체외 생물 검정을 설명합니다. 혈관이 마운트 myograph으로 평형화되면, 생물 분석 자체가 사용될 수있다 : 수축성 응답 또는 관심있는 화합물을 평가하기 vasoactivity 스크리닝 도구로; 약리학 적으로 특정 수용체​​ 작용제에 의해 수용체를 표적 종류의 존재를 결정의; 하나 이상의 길항제의 존재와 수용체의 역할을 결정하고; 또는 길항제를 사용하여 원하는 화합물의 잠재적 인 상호 작용을 결정합니다. 이 모든 것을 통해, 데이터는 실시간으로 수집되고, 하나의 동물로부터 수집 된 조직은 다른 실험 치료의 다수 (체외 이점)에 노출하고, 정확을 제공하는 모세관 침대의 양쪽에 혈관 구조를 의미 할 수있다 소장을 지원하는 구 심성 및 원심성 혈액 공급에 일이 될 수 있는지의 그림.

Introduction

티슈 침대 혈류량의 변화는 장기의 기능에 큰 영향을 미칠 수있다. 소장의 주요 기능은 영양소 흡수이다. 영양소 흡수 및 혈류 증가 표면 소화물 이동함에 따라 영양소 흡수에 도움을 위해 장내의 흡수성 표면 동맥 혈류가 필요하다. 혈류의 감소로 인해 transepithelial 그라데이션이 감소로 영양소 흡수의 감소를 일으킬 수있다. 영양소 이외에, 또한 소장의 장간막 국소 혈류에 효과를 발휘하는 2 차 대사, 약물, 독소에 노출 될 수있다. 반추 동물의 경우, 화합물은 사료에서 해방 될 수있다 (예를 들면, 아미노산, 또는 맥각 알칼로이드와 같은 독소와 같은 영양소) foregut의 발효 과정을 통해. 이 화합물은 반추위 발효 미생물의 신진 대사를 살아남을 경우, 지금은 흡수 가능또는 상호 작용 그들은 동물의 위장관을 통과있다.

생체 내 혈류를 측정하는 다른 방법을 사용할 수가있다 (예를 들어, 도플러 초음파, 혈액 유량계, 방사성 표지 된 미소 구, 및 표시 희석 기법 내주) 다양한 실험 시나리오 또는 치료의 평가를 허용한다. Mulvany 및 Halpern 3 전선을 사용하는 기술을 설명하는 문서 myograph 혈관 링 제제를 장착 발행까지 그러나, 혈관 평활근의 기계적 또는 약리학 적 특성에 관한 정보를 얻기 위해, 방법은 대형 선박을 제한된 남았다. 이 기술의 개발 이후 변형 관형 구조체의 평가 다른 다양한 애플리케이션을 허용 연관된 myograph 시스템으로 이루어질 것을 계속한다. 시스템은 또한 여기서 큰 혈관 관류 4를 장착하기위한 고정 봉을 이용하도록 한 내용기술이 요구되지 않습니다.

용기 및 동물 종류와 다른 동물 종의 데이터로부터 동일한 용기에 다른 해부학 적 기원과 구별에서 혈관의 dissimilarities 때문에 쉽게 다른 선박 또는 다른 동물 5 종류에서 동일한 용기에 걸쳐 추정 될 수 없다. 따라서, 별도의 생물 검정을 개발하고 이러한 측면이 변경 언제든지 확인해야합니다. 최근 여러 생물 검정은 복재 정맥과 오른쪽 반추위 동맥과 정맥 6,7는 가축에 사용하기 위해 이러한 기술과 수사관 개발되었다.

이러한 생물학적 검정은 맥각 알칼로이드는 소장지지 혈관에 미치는 효과를 구체적으로 조사하기 위하여 개발되었다. 그것은 공급 알칼로이드 50 ~ 60 %로 4 위 내용에 나타나는 것으로보고되었다, 그러나 5 %는 대변 팔에 복구됩니다. 스트릭 랜드 등. 9, 맥각 알칼로이드의 리뷰가 가능한 데이터 sugg를 언급EST는 소장 흡수가 ergopeptine 가장 중요한 사이트가 될 수 있음. 커트 등. 맥각 알칼로이드의 열을 검토 바이오 측면 그들이 상피 장벽을 통과하면, 맥각 알칼로이드가 쇄골 하 정맥 또는 장간막 정맥 및 포털 혈액으로 림프 시스템에 의해 하나를 운송 말했다. 로즈 등. 11은 높은 내생 감염 (높음 맥각 알칼로이드) 다이어트 소모 처리구에서 십이지장 혈류의 감소 및 결장을보고 하였다. 오른쪽 반추위 동맥과 정맥 생물 검정을 사용하여, 푸트 등. (12) 맥각 알칼로이드가 반추위 혈관에서 혈관 작용 것을 보여 주었다. 푸트 외. 13이어서 생체 내에서 증명이 감소 반추위 상피 혈류 맥각 알칼로이드 결과로 반추위 노출. 반추위의 흡수성 표면에 혈류 감소는 부수적 영양소 (휘발성 지방산) 플럭스의 감소를 일으켰다. 한때 감안할 때foregut에서 소장에게 전달 맥각 알칼로이드의 antity; 이 소장 혈관 및 영양 흡수에 비슷한 효과가 발생할 것이라고 가정했다. 이는 소 근위 회장 장간막 동맥 및 정맥 생물 검정의 개발을 필요로.

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Protocol

살아있는 동물을 사용하지 않았기 때문에 본 연구에 사용 된 절차는 켄터키 동물 관리 및 사용위원회의 대학의 승인을 필요로하지 않았다. 여기에 사용 된 시료의 수집에 앞서, 모든 동물은 고정 볼트 기절 exsanguinated되었다. 이 켄터키 대학의 연방 정부 검사 도축장 시설에서 실시했다. 미국 농무부 식품 안전 검사국의 공식 대표는 시체의 살아있는 동물과 처리 처리 모든 활동을 관찰했다.

계측의 1 준비

  1. 실험의 시작 조직 샘플의 모음 사이의 시간, 장비 설정을 최소화하고 (추가 인원이 가능한 경우 나, 이러한 작업이 동시에 발생할 수있다) 실험 조직을 수집하기 전에 버퍼를 제조 하였다.
    NOTE : 이것은 조직 실험을 실시 가능한 남아있는 시간의 가장 큰 양을 제공하지만, 일부뿐만따라서 그것은 일반적으로 가능한 한 일찍 시작하는 것이 바람직하다, 실험은 오랜 기간 동안 실행할 수 있습니다 (또는 하루에 여러 실험을 완료하는 욕망이있다).
  2. 전원을 연결 컴퓨터, 데이터 수집 장비, (버퍼 (들)) 수조와 myograph 장치 (들). myograph 장치 (들)에 교정 장치를 놓고 온도를 미리 설정 따뜻하게 단위 및 교정 장비 (37.5 ° C로 사전 설정) myograph 열을 켜고 수 있습니다.
    1. 컴퓨터에서 이전에 만든 차트 소프트웨어 설정 파일을 열고 실행을 시작합니다 (그러나 데이터를 수집하지 않음).
  3. 10 분 동안 장비를 따뜻하게.
    1. 데이터를 수집 시작합니다.
    2. 모든 채널을 제로.
    3. 확인하고, 인증 된 중량에 의해 공급이 g-포스로 그 채널과 연관된 각 힘 센서로부터 공급 된 전기 신호를 표준화하기 위해, 각 채널 (multimyograph 당 4 채널)에 (필요한 경우) 캘리브레이션을 수행.
    4. 교정 및 단위 변환을 완료 한 후에, g 등의 모든 후속 데이터를 저장한다. 각 개별 기관의 욕망에 따라 적절하게 변경; 장비 및 소프트웨어는 milliNewtons 볼트와 같은 다른 장치의 사용을 허용한다.
  4. 가스 라인이 막혀 않은 지 확인하고 (들) 단위를 myograph하는 가스 공급 (95 %, O2 / 5 % CO 2)를 켭니다. 지속적으로 전체 절차를 수행하는 동안 (myograph 챔버에서) 모든 버퍼를 기체.
  5. 70 % 에탄올 모든 myograph 챔버를 작성하고 10 분 동안 담근 에탄올을 제거하고 두번째 10 분 담가에 대해 반복합니다.
    1. 에탄올을 제거한 후, 챔버에서 버퍼의 세번째 추가를 떠나 준비된 버퍼 (버퍼 준비를위한 제 2 절 참조) 세 린스 다음에 탈 이온수로 3 회 씻어.
      참고 : 버퍼와 조직이 준비 될 때까지이 시점에서 장비는이 상태에서 유휴 상태를 유지할 수 있으며, 직원은 experimen 진행 준비가되어 있습니다t.

버퍼의 2 준비

  1. 11.1 mM의 D-글루코오스의 최종 농도를 달성하기위한 교통 및 조직 샘플의 처리에 사용하기위한 1 L-Henseleit 크렙스 완충액을 준비한다; 1.2 mm의 4 황산; 1.2 mM의 KH 2 PO 4; 4.7 밀리미터의 KCl; 118.1 mM의 NaCl을; 3.4 mM의 염화칼슘이; 24.9 mM의 탄산 수소 나트륨.
    1. 저어 접시에 탈 물을 약 900 ㎖ 중에 크렙스 염 9.6 g을 섞는다.
    2. 원하는 버퍼의 L 당 2.1 g의 중탄산 나트륨 다음에 0.373 g 염화칼슘 탈수 섞는다.
    3. 95 %, O2 / 5 % CO 2와 함께 20 분 동안 가스 완충액.
    4. L. 1로 볼륨을 조절, 가스 처리 후 7.05로 산도를 조정 (최종 목표 pH가 7.4이되어야합니다 버퍼의 여과 산도를 증가)
    5. 필터를 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 깨끗한 멸균 한 L 매체 병 및 저장 버퍼로 버퍼를 소독.
  2. 별도의 크렙스-H를 준비크렙스 - Henseleit이 수축 실험과 관련된 추가 화합물과 버퍼 수송을위한 2.1 단계에 설명 된대로 myograph 실험에 사용 enseleit 완충 용액.
    참고 : 일반적으로이 L이 문서에서 설명하는 실험에 충분하지만,이 볼륨이 증가하거나 실험의 길이에 따라 감소 될 필요가있다, myograph 챔버, 및 (치료 추가에 대해) 수의 버퍼 교체의 수입니다.
    1. 가스 처리 단계 (단계 2.1.3) 이전에, 9.1 mg의 추가 버퍼 데시 프라 민 염산의 (버퍼의 L 당 준비되고있다).
    2. 프로프라놀롤 염산의 1.0 μM 솔루션을 준비하고 크렙스 - Henseleit 완충 용액이 용액 (준비되고 버퍼의 L 당) 1 ㎖에 추가합니다. 사용의 일에이 버퍼를 확인하고 myograph 작동 온도 (myograph에서 37.5 ° C 온도를 산출 온도)에 보관하십시오.
      참고 : 데시 프라 민은 생체 아민 재 흡수 메커니즘을 억제하기 위해 추가더 빠르게 발생하도록 혈관 입욕 버퍼로부터 추가 실험 정화를 허용. 프로프라놀롤의 추가는 수용체 아드레날린을 β하는 치료 화합물의 결합을 비특이적을 방지 할 수 있습니다.

3 수집 및 혈관의 제조

  1. 가능한 한 빨리, 시체에서 위장관를 제거합니다. 동물이 더 이상 무의식적 인 반사를 전시하면, 머리를 제거하지 숨길 다음 수직으로 시체를 올립니다. 시체에서 위장 육부 (항문 식도)의 제거가 승인 도축장 직원 (<20 분의 시간에서 멋진의)에 의해 완성되어야한다.
    참고 : 일반적으로 장관이 표준 운영 절차 또는 시설의 직원이 다음에 연방 정부가 위임 절차와에서 수집되는 위치 / 시설로 제한됩니다 얼마나 빨리.
    1. 대부분의 시설에서, 위장관의 조작을 실시식량 공급을 입력 운명 사체의 처리에서 별도의 위치에서. 위장관은 촬영과 조사를 위해 밖으로 확산 될 수있는 근처의 편리한 위치를 사용합니다.
  2. 위장관이 확산되면, 소장, 맹장에 소장을 연결하는 회맹 배 및 회맹 배 (그림 1A)에 인접 연장 회장 플랜지를 식별합니다.
    1. 메스 나 칼을 사용하여 매우 가볍게 회장 플랜지의 중심 장간막 막에 절개. 두 집게 손가락을 사용하여, 퉁명스럽게 장간막 혈관 (그림 1B)를 노출 지방과 결합 조직을 멀리 해부.
  3. 장 장간막에서이 플랜지 또는 팽창에서 여러 가지를 해부 (~ 길이 2cm) 회장 (그림 1C)의이 부분을 지원하는 노출 장간막 동맥과 정맥 번들.
    1. U 경우조직을 파악 직접 파악 또는 손상에 부정적인 조직의 성능 (14)에 영향을 줄 수 스트레칭의 일종으로 그들을 제거하는 동안의 모든 혈관을 잡아 당기지하는데주의를 기울여야하는 집게를 노래. 혈관 제거는 가장 제거 될 섹션의 각 단부에 걸쳐 절단 한 다음 이제 격리 구역에 함께 또는 병렬로 절단함으로써, 수행된다. 편의를 위해 선박 집게 한 쌍의 파악하기 위해 일부 조직을 제공하기에 따라 주변 조직의 일부를 제거합니다.
    2. 포셉 쌍, 차가운 얼음-Henseleit 크렙스 완충액을 함유하는 튜브에 조직 샘플을 담그고 처리 실험실에서 발생할 수있을 때까지 얼음 상에 저장한다.
  4. 절삭면이나 배양 접시에서 조직 샘플을 놓고 부분적으로 차가운 얼음 크렙스 - Henseleit에 잠수함.
    1. 범위 # 5 보석상 집게, 노이스 홍채 가위를 사용하여 램프를 확대 또는 해부,주의 깊게 주변의 지방과 니플을 멀리 해부 (5.0 배의 배율 2.5은 충분하다)조직을했습니다 및 동맥과 정맥을 분리합니다. 섹션의 일단에 개구 용기를 식별하고 신중 집게로 용기를 둘러싸는 밴드를 파악.
    2. 가위로 잘라 올려 근막 아래에 가위의 끝을 밀어 용기에 평행합니다. 초기 절개 한 후, 지방 및 결합 조직은 가위로 상기 양측을 절단하여 용기로부터 분리 될 수있다. 선박 벤치에 소요되는 시간을 최소화하면서 혈관이 가능한 깨끗한 지 확인합니다.
    3. (샘플 수집 후 최대 24 시간 동안 저장하고 여전히 유효 수축력 데이터를 생성 상태를 유지 할 수 있습니다) 4 ° C에서 신선한 크렙스 - Henseleit 버퍼와 저장소의 튜브에 혈관을 돌려줍니다.
    4. 면도날을 사용하여, 슬라이스 용기가 2 mm 부의 원하는 수로 myograph에 사용되는 (그것은 일관된 단면을 얻기 위해 조직 슬라이서를 사용하는 것이 도움이된다).
    5. 해부 SCO 아래의 각 부분을 검사PE (12.5X 배율)은 각 섹션 실수 해부 청소하는 동안 수행 더 이상, 지점, 밸브, 또는 표면 손상이 없음을 확인합니다. 이상 징후, 분기, 밸브, 또는 표면 손상이있는 경우 혈관 부분을 교체합니다.
  5. myograph 챔버 (일반적으로 <30 분)에 장착하기위한 준비가 될 때까지 C 얼음 또는 4 °에서 (크렙스 - Henseleit 버퍼에 빠져들) 점포 허용 썰어 용기 섹션.
  6. 부드럽게 루멘을 통해 지원을 삽입하여 myograph에 선박을 탑재하고 2-3그램 읽기 위의 혈관을 스트레칭하지 않도록주의하면서 (myograph에 micropositioner 사용) 장력을 증가시킨다.
  7. 모든 챔버가 적용되면, 모든 방에서 버퍼를 진공 청소기로 청소 및 버퍼의 5.0 ㎖로 채우고 평형 기간과 실험을 시작하기 15 분 타이머를 시작합니다.

(4) 실험

  1. 안정한 고해상도를 달성하기 위해 1.5 시간 동안 모든 용기 섹션을 평형화1.0 g의 팅 장력.
    1. 크렙스 - Henseleit 배양 버퍼마다 15 분 교체합니다.
    2. 평형 동안 지속적으로 2g에 혈관 부분에 긴장을 조절하고 약 0.80 g까지 휴식을 취할 수 있습니다. 선박 (그들은 마운트를 미끄러 져 있음)을 너무 많이 긴장을 허용하지 않도록하십시오. 선박이 조정을 필요로하지 않고 1g 장력을 보유하고 안정된 기준 긴장을 달성하기 위해보십시오.
  2. 평형화 동안의 KCl 수용액 1.32 M 용액이 참조로서 사용되도록 준비한다.
  3. 만족스러운 평형의 완료 후, 용기를 목욕 5.5 ml의 용액에 0.12 M 용액에 결과에 1.32 M의 KCl 용액 500 μl를 추가합니다.
    1. 이 외에도에서 최대 반응은 조직 생존력을 평가하기 위해 사용되며, 행 (처리 된 데이터를 정규화하는 등의 농도 응답을 사용할 수있는 수동 장력을 조정할 수 없어, 1.32 M KCl을 첨가 이어gonist).
    2. 장력이 1.0 g의 기준 값으로 돌아올 때까지 15 분 간격으로 버퍼를 교체합니다.
  4. 기준선에 도달하면, 버퍼를 변경 함과 동시에 1 분 타이머를 시작한다. 시작 시간의 경이적인을 방지하기 위해 동시에 모든 챔버에 대해이 작업을 수행합니다.
    1. 추가 할 수있는 기준을 흔든다은 1 분 카운트 다운 동안 챔버 (1)에 대한 설명을 준비합니다.
    2. (이 총 부피의 0.5 % 미만을 유지 치료) 실험 지시로서 각 챔버에 25 ㎕의 분취 액에 기준을 추가한다.
    3. 최종 표준이 추가되면, 9 분 타이머를 시작한다.
    4. 구 분 표준 인큐베이션의 끝에, 처리 챔버에서 함유 완충액을 제거하고 신선한 완충액 5.0 mL를 넣고 2.5 분 타이머를 시작.
    5. 단계를 반복 4.4.4.
    6. 제 2.5 분 세정의 끝에서, 진공 챔버와 신선한 완충액을 추가 SECON의 개시 카운트 다운하는 1 분 타이머를 시작D 표준 추가.
  5. 일의 표준 추가 모든이 사이클을 계속합니다.
  6. 최종 표준뿐만 아니라 이후 9 분 배양 동안 500 μL의 실행 기준 용량 추가의 끝의 1.32 M KCl을 참조 화합물을 제조.
  7. 최종 처리 첨가 후 1 분 간격에 따라,의 KCl을 추가하고 9 분 타이머를 시작합니다.
    주 : KCl을 첨가 실험의 결론에 조직의 생존 능력을 확인하기위한 것입니다 무시할 응답 결과 처리를 관리하는 경우에 유용합니다.
  8. 최종 9 분 기준 화합물 보육의 결론에, 진공 청소기를 사용하거나 모든 챔버에서 버퍼를 제거합니다. 신선한 버퍼를 추가하지 마십시오. 실험을 마친다.
  9. , 차트 파일을 저장 혈관 부분을 제거하고 적절하게 처리하고 정리 프로토콜에 따라 (제조업체가 제공 및 실험실 특정 될 수 있습니다) myograph의 장비.

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Representative Results

포함 된 결과를 생성하는 데 사용되는 혈관 3주 간격 내 6 홀스타인 수송아지 (425 ± 8 ㎏)에서 수집 하였다. 의 KCl 농도 증가 처리를 추가로 전형적인 장간막 혈관 수축 반응의 예는 반응의 크기는 (공여체 동물의 크기와 상관) 용기의 크기와 약간 다를 것이다.도 2에 표시 할뿐만 아니라 수있다 부적절한 취급으로 (부정적) 영향을받을 수집 및 청소하는 동안 선박의 (스트레칭). 따라서, 선박의 KCl에 노출 상당한 수축 반응을 관찰하는 것이 중요하다. 무시할 응답이이 시점에서 관찰되는 경우 해당 선박의 절차로 더 이상 진행하지 않는 것이 좋습니다. 그림 2의 9 분의 배양 기간에서 알 수있는 바와 같이, 농도 증가에 대응 님의 증분 증가가 있습니다. 이 partic 것이 바람직하지만신경근 실험 설계, 그것은 항상 발생하지 않을 수 있습니다 또는 다른 치료법으로 자행 될 수있다. 수집 된 데이터의 처리에 사용되지 않지만 용기는 어느 하나에 응답하지 않는 경우는 (실험 기간이 끝날 때 조직의 생존을 확인 더 중요대로 실험의 결론에서 KCl을 첨가는 매우 중요 치료 추가의).

그림 2에 제시된 데이터는 긴장의 g에 기록됩니다. 이것은 모든 동물 대 동물 및 선박 - 용기 편차를 최소화하기 위해 이러한 데이터를 정규화하는 것이 중요하다. 따라서, 생존 능력의 지표로서 사용되는 외에, 최대의 KCl 반응은 추가 치료 모두를 정규화하기 위해 사용된다. 이것은 KCl을 최대의 백분율로 수축 응답 데이터를 생성한다. 이 5 - 하이드 록시의 농도 증가에 어떻게 장간막 동맥과 정맥 응답 곡선이다 (세로토닌, 그림 3) 및 노르 에피네프린 (

5 - 하이드 록시 (그림 3)과 노르 에피네프린 (그림 4) 모두에 장간막 정맥 응답은 음의 값을 시작했다. 이것은 초기 KCl을 첨가하기 전에 기록 기준선 장력에 의해 각각 구 분 인큐베이션 기간 동안 기록 된 최대 장력을 보정 한 결과이다. 이 기준 보정 긴장에있는 약간의 차이가 분석에 포함되어 제공되는 데이터가 긴장 만 변화를 반영 할 수 없습니다 것을 보장합니다. 휴식 및 후속 치료 또한 전에 사전의 KCl베이스 라인 수준 이하로 떨어지면 혈관에서 음의 값을 결과. 이는 치료 또는 작용제의 초기 농도가 수축 반응을 일으킬 너무 낮은 정맥혈 샘플에서 특히 일반적이다. 이것은 나를 위해이 아니었다 선박이 치료 추가에 반응하기 시작했다 때까지베이스 라인 위의 긴장을 개최 생체 아민, 하나에 senteric 동맥 응답. 이러한 차이는 하나의 모세관 침대 측 왜 양쪽이 생물 검정의 일부로서 간주되었다에 혈관의 차이를 예시한다.

이러한 생물학적 검정은 소장에 영양소뿐 아니라 소장에서 흡수 된 영양분을 멀리 운반 혈관을 공급하는 혈관의 화합물 vasoactivity을 평가할 수있다. 도 3 및 4의 데이터는 이것이 달성 될 수있는 방법의 간단한 예이다. 5 - 하이드 록시 (도 3)의 경우에는, 동맥 또는 정맥 수축 반응에 차이가 없었다. 반대로, 노르 에피네프린의 농도를 증가시키는 장간막 정맥 수축 반응은 장간막 동맥의 것보다 컸다.

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그림 1. 장간막 혈관의 공급원으로 사용 소 장관의 예는 적색 별표는 참조 포인트로서 세 개의 창에서 회맹 배의 보이는 부분을 나타낸다. (A) 혈관의 샘플링이 발생 회장 플랜지를 나타내는 빨간색 타원형 전체 기관. 장간막 혈관 침대 (B) 노출. (C) 아이리스 가위 장간막 정맥 (표시) 및 동맥 (보이지 않는) 컬렉션 직전의 노출 지점쪽으로 향하고 있습니다.

그림이
그림 2 : 노르 에피네프린의 농도가 증가에 장간막 정맥의 농도 응답의 예 (1 × 10 -7 일× 10 -4 M). 추적의 시작과 끝의 큰 이벤트는 0.12 M의 KCl 추가에 대한 응답이다. 붉은 사각형 각 처리 첨가 9 분 잠복기에 대응하는 데이터 수집 영역을 의미한다. 이 다음에 나오는 세 슬림 스파이크가 버퍼 교체에 의해 생성 된 아티팩트하고 분석에 포함되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3 : 장간막 동맥 (MA) 및 혈관의 수축 반응 평균 (MV를, N = 6 수송아지) 5 - 하이드 록시 (세로토닌)의 농도가 증가하여 S 자형으로 데이터를 맞추기 위해 비선형 회귀 분석을 사용하여 생성 하였다 도시 라인. 농도 R저 응답의 다음 식을 이용 곡선 : Y = 바닥 + [(위 - 아래) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - X))], 상부 및 하부는 고원에서 120 mM의 KCl을 최대 수축 반응의 비율이되는 경우, 및 EC (50)은 KCl을 최대 반응의 50 %를 생산하는 알칼로이드의 몰 농도이다.

그림 4
도 4 : 장간막 동맥 (MA) 및 혈관의 수축 반응 평균 (MV를, N = 6 수송아지) 노르 에피네프린의 농도를 증가하기 위해 이용 S 자형 농도 반응 곡선을 데이터에 맞추기 위해 비선형 회귀 분석을 사용하여 생성 된 도시 선. 다음의 수학 식 : Y = 바닥 + [(상부 - 하부) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - X))], 상하 120 mM의 KCl을 최대 C의 백분율 어디고원에 응답 ontractile와 EC (50)은 KCl을 최대 반응의 50 %를 생산하는 알칼로이드의 몰 농도이다.

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Discussion

이러한 생물학적 검정의 개발 초기 도전 장간막 혈관 용 반복 수집 사이트 구축했다. 회장 결과적 장간막 통해 소장에서 진행 중에 소장 변화의 기능의 일부와 유사한 패턴으로 변화 샘플 사이트 일관성은 중요하다. 장간막 동맥과 정맥의 회장 지점은 가장 쉽게 식별 해부학 적 랜드 마크를 통해이었다. 맹장의 위치 및 장간막의 왼쪽에 그 말단에 회맹 배 다음으로이 두개골 장간막 동맥 (15)의 종료 근처에 있습니다. 이상 장간막의 영역과 회맹 배의 확장 (소 동물에 고유 한) 매우 반복 수많은 동물에서 16 만들어진 샘플링 (플랜지라고). 제조 될 수있는 큰 함정 중 하나는 생물 검정이 단계에있다. 기계적 스트레칭 후속 용기 (P)에 큰 부정적인 영향을 미친다erformance (14)와 연구원은 과도하게 제거 및 후속 청소시 조작 또는 뻗어 아르 선박이 기준 화합물 사용에 응답하지 않습니다 알 수 있습니다. 이는 불행하게도 진정한 기능 수준 및 신뢰성있는 데이터의 생성을 위해 추가적으로 간주해서는 안의 KCl에 응답하지 않은 혈관에서 혈관 제제의 품질을 평가하기위한 유일한 방법이다.

본 명세서에있어서 최종 이끄는 다른 두 방법의 유효성 확인 단계 (도시하지 않음) 기준 화합물 및 24 시간 보관 다음 혈관의 생존 능력을 시험과 같은 다른 화학 물질의 사용이었다. 노르 에피네프린 및 세로토닌은 참조 화합물로서 평가 있지만 성공적으로 사용될 수 있도록 장간막 동맥 및 정맥에 의한 응답은 선종과 동물간에 걸쳐 너무 변수 있었다 하였다. 반대로, 120 밀리미터의 KCl의 추가는 모두 동맥과 정맥 제제에 걸쳐 매우 재현 응답 결과.LSO는 동맥 및 정맥 응답은 수집의 일을 평가하고 24 시간 후 수집을 재평가하고 동맥 또는 정맥 중 하나에 의해 작용제 반응에는 차이가 없었다되었다. 거기에 적용될 수 치료법 (또는 다양한 치료 조합)의 다수가 종종 있지만, 연구자 myograph 공간 및 시간에 의해 제한되어 이것은, 생물 검정의 중요한 측면이었다. 컬렉션에서 24 시간에서의 생존 기간을 연장함으로써, 추가적인 실험을위한 시간이 크게 증가된다.

연구원이 생물 검정법에 적용된 처리 구조의 유연성을 이해하는 것이 중요하다. 연구원 KLOTZ 등의 경우에 그 또는 그녀가 만성적 생물학적 관련성의 것을 제어하기 위해 또는 치료로 혈관을 노출 관심 배양 버퍼에 임의의 화합물을 (추가 할 수있다. 17, 이것은 함께 이루어졌다 측면 복재 정맥은 계속 애 노출관심의 세로토닌 수용체를 길항 tanserin). 장간막 혈관 수축 반응 실험을 수행하기 전에 관심 화합물로 전처리 될 수있다. 생물 검정법은 제시로, 작용제 등의 맥각 알칼로이드에와 혈관 반응 (18)에 영향을 맥각 알칼로이드 이전에식이 노출 여부를 찾고 누적 농도 반응 실험을 수행하도록 설계되었습니다. 대표적인 결과는이 방법은 측정 혈관 반응을 생성 할 수 있고 네 개의 농도가 이것을 달성하기 위해 사용되었다는 것을 보여준다. Egert 외. (18)의 경우, 응답 곡선을 구성하는 데 사용되는 최대 10 개의 상이한 농도가 있었다. 이 방법은 시간의 작은 창에 단일 한 동물에서 다른 화합물 또는 혈관에 대한 수용체의 다수를 평가하는 방법이다.

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Disclosures

상호, 독점 제품, 또는 특정 장비에 대한 언급은 USDA의 보증이나 보증을 구성하지 않고 사용할 수 있습니다 다른 제품의 배제 승인을 의미하지는 않습니다.

Acknowledgments

저자는이 문서에 사용 실험 조직을 수집 할 수있는 기회를 제공하기 위해 라이언 채플린 켄터키 고기 연구소와 동물 식품 과학과의 대학의 박사 그레그 Rentfrow을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

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References

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