Bir Biyoassay olarak Sığır Mezenterik Arter ve Ven Bölüm yalıtma ve kullanma İnce Barsak vazoaktiviteye için Test

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ince bağırsak sık sık kan akışını etkileyen ve olumsuz besin emilimini etkileyebilir toksinler maruz kalmaktadır. , Bileşikleri veya ilgi duyulan bir toksin multimyograph ve mezenterik arter ve damar izole kullanarak vazoaktiviteye için taranabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Memeli mide-bağırsak sistemlerinin sürekli ve bu sistemi için kan akışı üzerinde bir etkiye sahip olabilir bileşikler (istenen ve istenmeyen) maruz kalır. Ince bağırsağa kan akışında değişimler organın emme işlevlerine etkilere neden olabilir. Fermantatif ve sindirim süreçleri ile yemlerin kurtuldu toksinler özellikle faiz üretken verimliliği gelişmiş olabilir bir alanda gibi geviş getiren hayvanlarda gelişmiştir. Bu makale ile ilişkili video sığır mezenterik arter izole enine kesitlerde vazoaktiviteye ve bir multimyograph kullanarak damar bileşikleri taramak için geliştirilmiş bir in vitro biyo-tahlili tarif eder. Kan damarlarının monte edilir ve myograph içinde dengelenmiş sonra, biyolojik tayin kendisi kullanılabilir: gerilme tepkisini ya da ilgi çekici bir bileşik vazoaktiviteye değerlendirmek için bir tarama aracı olarak; farmakolojik olarak spesifik bir agoniste sahip reseptörleri hedefleyerek reseptör tiplerinin varlığını belirlemeks; Bir veya daha fazla antagonistlerinin varlığında bir reseptörünün rolünü belirlemek; veya antagonistleri ile ilgi çekici bir bileşik olası etkileşimleri belirler. Tüm bu sayesinde, verileri gerçek zamanda toplanır, tek bir hayvandan alınan doku farklı deneysel tedavilerin büyük sayıda (bir in vitro avantaj) maruz bırakılmış, ve doğru bir temin etmek üzere, kılcal damar yataklarının her iki tarafında damar sistemini temsil edilebilir ince bağırsağa destekleyen afferent ve efferent kanlanma oluyor ne olabilir resim.

Introduction

Bir doku yatağına kan akışında değişimler organ fonksiyonu üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. İnce bağırsağın birincil fonksiyonu, besin emilmesidir. Besin emilimini ve kan akışı artar yüzeyi boyunca digesta 1 hareket ederken, besin emilimini yardımcı olmak için barsağın emme yüzeyine arter kan akışı gerekmektedir. Kan akışında bir azalma, transepitelyal gradyanı 2 bir azalmaya besin emilimini bir azalmaya neden olabilir. Besin ek olarak, ince bağırsak, aynı zamanda mezenter lokalize kan akışı üzerinde bir etki gösterebilir sekonder metabolitler, ilaçlar veya toksinlere maruz kalabilir. Geviş getiren hayvanın durumunda, bileşikler, bir yem serbest bırakılabilir (örneğin, amino asitler, veya ergot alkaloitler gibi toksinler gibi besinler) ön bağırsağının fermantasyon süreçleri yoluyla. Bu bileşikler, rumen fermentasyon mikrobik metabolizmanın hayatta, şimdi emilim için kullanılabilirya da etkileşim ve hayvanın mide-bağırsak sistemi boyunca hareket ederken.

In vivo kan akışını ölçmek için kullanılabilir farklı yöntemler vardır (örneğin, Doppler ultrason, kan akış ölçerler, radyoaktif işaretli mikroküreler ve gösterge-seyreltme teknikleri kalıcı) çeşitli deneysel senaryolar veya tedavilerin değerlendirilmesine imkan. Mulvany ve Halpern 3 tel tekniğini açıklayan bir makale bir myograph vasküler halka hazırlıklarını monte zamana kadar yayınlanmış Ancak, damar düz kas mekanik veya farmakolojik özellikleri hakkında bilgi edinmek için, yöntem büyük damarların sınırlı kalmıştır. Bu tekniğin geliştirilmesi için, modifikasyonlar tüp şekilli yapıların değerlendirilmesi için çeşitli uygulamaların çeşitli izin ilişkili myograph sistemlere yapılacak devam etmektedir. Sistem ayrıca nerede perfüzyon daha büyük gemilerin 4 montaj için sabit çubuklar kullanmak için adapte edilmiştirteknikler arzu edilmez.

Damar ve hayvan türünden farklı hayvan türleri, verilerden aynı damarlarda anatomik kökeni ve ayrımlar gelen damar farklılıklardan dolayı kolay bir şekilde farklı damarlar ya da farklı hayvan türlerine 5, aynı kap üzerinde tahmin edilemez. Sonuç olarak, ayrı biyotahliller geliştirilmiş ve bu yönleri değişti zaman valide edilmelidir. Son zamanlarda birçok biyoassayler safen ven ve sağ rumen arter ve ven 6,7 sığırlarda kullanılan bu teknolojiler ile yanal geliştirilmiştir.

Bu biyoanaliz ergo alkaloidleri ince bağırsağa destekleyen damar üzerinde sahip olduğu özel etkilerini araştırmak için geliştirilmiştir. Bu beslenen alkaloit% 50-60 abomasal içeriği görünür olduğu bildirildi, ancak sadece% 5 dışkı 8 kurtarıldı. Strickland ve diğ. 9, ergo alkaloidleri bir yorumda bu mevcut veriler Sugg belirttiest ince bağırsak ergopeptine emilmesi için en önemli site olabilir. Eckert ve ark. Ergo alkaloidleri 10 biofarmasötik yönleri ve epitel bariyeri geçmeye kez, ergo alkaloidleri subklavian ven veya mezenterik ven yoluyla ve portal kana lenfatik sistem tarafından ya taşınan belirtti. Rhodes vd. 11 yüksek endofit-enfekte (yüksek ergot) diyet tüketen yükleyiciler bir duodenum kan akımında azalma ve kolon bildirdi. Doğru rumen arter ve ven biyolojik tayini kullanılarak, Foote ve ark. Ergot alkaloitleri, 12 rumen damar vazoaktif olduğunu göstermiştir. Foote ve ark. 13, daha sonra in vivo koşullarında ortaya bir azalma işkembe epitel kan akışında ergot alkaloitleri, sonuçlar rumen maruz kalma. Rumen emilim yüzeyi kan akışındaki bu azalma beraberinde besin (uçucu yağ asidi) akı bir azalmaya neden olmuştur. Qu göz önüne alındığındaforegut gelen ince bağırsağa aktarılması ergo alkaloidleri Antite; küçük bağırsak damar ve besin emilimi üzerinde benzer bir etki meydana olacağı varsayılmıştır. Bu sığır proksimal ileal mezenterik arter ve ven biyoassay geliştirilmesini gerekli kılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hiçbir canlı hayvan kullanılmıştır, çünkü bu çalışmada kullanılan Prosedürler Kentucky Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi'nden onay gerektiren vermedi. Burada kullanılan herhangi bir numune toplamadan önce, tüm hayvanlar bir esir cıvata ile hayrete ve kan kaybetmiştir. Bu Kentucky Üniversitesi'nde federal teftiş mezbaha tesisinde gerçekleştirildi. USDA Gıda Güvenliği ve Kontrol Servisi resmi bir temsilci karkas canlı hayvan ve kullanımı ile ele tüm faaliyetleri gözlendi.

Enstrümantasyon hazırlanması 1.

  1. Bir deneyin başlamasından doku örneklerinin koleksiyonları arasında geçen zaman miktarını ayarlamak ekipman en aza indirmek ve (ek personel mevcut olup olmadığını veya bu görevler, eş zamanlı olarak) deney doku toplanmasından önce, tamponlar hazırlamak.
    NOT: Bu doku deneyler için canlı kalır zaman büyük miktarda sağlar, ancak bazı sadecebu nedenle genellikle mümkün olduğunca erken başlamak için arzu edilir, deneyler uzun süre için çalıştırabilirsiniz (veya bir gün içinde birden çok deneyler tamamlamak için bir arzusu var).
  2. Güç kadar ilişkili bilgisayar, veri satın almalar ekipmanları, (tampon (s)) su banyosu ve myograph birim (ler). Myograph birim (ler) hakkında kalibrasyon ekipmanları yerleştirin ve sıcaklıkları önceden ısınmaya birimleri ve kalibrasyon ekipmanları (37.5 ° C ayar) myograph ısı açmak ve izin verir.
    1. Bilgisayarda önceden oluşturulmuş Grafik yazılım ayarları dosyasını açın ve bir çalışma başlatmak (ancak veri elde değil).
  3. 10 dakika boyunca ekipmanı ısıtın.
    1. Veri edinme başlatın.
    2. Tüm kanalları sıfır.
    3. Kontrol ve sertifikalı bir ağırlık tarafından sağlanan bir 2-g kuvveti bu kanala ait olan ilgili bir kuvvet transdüktörüne sağlanan elektrik sinyali standardize etmek için her kanalı (multimyograph 4 kanal) (gerekirse) kalibrasyonu yürütmektedirler.
    4. Kalibrasyon ve bir tane dönüşüm tamamlandıktan sonra, gram olarak sonraki tüm veri depolamak. Her ayrı laboratuvar arzuları dayalı buna göre değişir; donanım ve yazılım gibi milinewton ve volt gibi diğer birimlerin kullanımına izin verir.
  4. Gaz hatları tıkanmalar açık olduğundan emin olun ve (ler) birimleri myograph gaz sağlama (% 95 O 2 /% 5 CO 2) açın. Sürekli bütün prosedür sırasında (myograph odalarına) tüm tamponları gaz.
  5. % 70 etanol ile tüm myograph haznelerine ve 10 dakika için ıslanmaya, etanol çıkarmak, ve bir ikinci 10 dakika emmek için tekrar edin.
    1. Etanol uzaklaştırıldıktan sonra, odacıklar içinde tampon üçüncü ilave bırakarak hazırlanan tampon maddesi (tampon hazırlanması için bakınız bölüm 2) ile üç kez durulanır iyonu giderilmiş su ile üç kez yıkayın.
      NOT: tampon ve doku hazırlanıncaya kadar bu noktada ekipmanların bu durumda boşta kalabilir ve personel experimen ile devam etmeye hazır olduğunut.

Tamponlarının 2. Hazırlık

  1. 11.1 mM D-glikoz son konsantrasyonları elde etmek için ulaşım ve doku örneklerinin işlemede kullanmak için bir 1 L'lik, Krebs-Henseleit-tampon çözeltisi hazırlayın; 1.2 mm 4 MgSO; 1.2 mM KH 2 PO 4; 4.7 mM KCI; 118.1 mM NaCI; 3,4 mM CaCl2; 24.9 mM NaHCO3.
    1. Bir karıştırma plakası üzerinde de-iyonize su, yaklaşık 900 ml Krebs tuzları, 9.6 g karıştırın.
    2. Istenilen tamponun her bir L başına 2.1 gram sodyum bikarbonat, ardından 0.373 gr kalsiyum klorür dihidrat ilave edin.
    3. % 95 O 2/5% CO2 ile 20 dakika boyunca gaz tampon çözeltisi.
    4. L ve 1 hacim ayarlamak; gazı sonra 7,05 pH'ı ayarlamak (nihai hedeflenen pH 7,4 olmalıdır tamponu pH oranını yükselterek, filtrasyon)
    5. Filtre kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de temiz otoklavlandı 1 L medya şişe ve mağaza tampon içine tampon sterilize.
  2. Ayrı bir Krebs-H 'nin HazırlanmasıKrebs-Henseleit kontraktilite deneyler ile ilişkili olan ek bileşikler tamponu taşıma Aşama 2.1 'de tarif edildiği gibi myograph deneylerinde kullanılmak üzere enseleit tampon çözeltisi.
    NOT: Genellikle 2 L Bu makalede açıklanan deneyler için yeterli olacaktır, ama bu hacim artışı veya deney uzunluğuna göre azalır gerekebilir, myograph odaları ve (tedavi eklemeler göre) sayı tampon değiştirmeleri sayısı.
    1. Gazlaştırma aşama (aşama 2.1.3) önce, 9.1 mg eklemek tampona desipramin-HCl tampon (L başına hazırlanmaktadır).
    2. Propranolol-HCl, 1.0 uM çözeltisi hazırlayın ve Krebs-Henseleit-tampon çözeltisi için bu çözeltinin (tampon hazırlanan her bir L başına) 1 ml. Kullanım gününde bu tampon yapmak ve myograph çalışma sıcaklıklarında (myograph 37,5 ° C sıcaklık veren bir sıcaklıkta) tutun.
      Not: desipramin biyojenik amin, yeniden alım mekanizmaları önlemek için ilave edilirve daha hızlı gerçekleşmesi için kan damarlarını banyo tampon deneysel eklemeler temizlenmesini sağlar. Propranolol ilavesi adrenerjik reseptörlerinin β muamele bileşiklerin bağlanması belirli olmayan engeller.

3. Toplama ve vaskülatürüne hazırlanması

  1. En kısa sürede, karkas gastrointestinal sistem kaldırın. Hayvan artık istemsiz refleks sergileyen sonra, baş kaldırmak ve gizlemek ve sonra dikey karkas yükseltmek. Karkas gastrointestinal iç organları (anüs özofagus) kaldırılması onaylı mezbaha personeli (<20 dk zaman ve çarpıcı) tarafından doldurulmalıdır.
    NOT: Genellikle bağırsak, standart işletim prosedürleri veya tesis personelinin ardından federal zorunlu prosedürler ve toplanan ediliyor konum / tesis ile sınırlıdır nasıl yakında.
    1. En tesislerde, mide-bağırsak sisteminin işler gerçekleştirmedengıda kaynağı girmeye yönlendirilmiş olan karkasın işleme ayrı bir yerde. Gastrointestinal sistem almış ve inceleme için dışarı yayılır yakındaki bir konuma kullanın.
  2. Gastrointestinal sistem yayılmış sonra, ince bağırsak, çekuma ince bağırsağa bağlantı ileoçekal kapağı ve ileoçekal kat (Şekil 1A) proksimal olarak uzanan bir flanş ileum tanımlar.
    1. Bir neşter veya bıçak kullanarak, çok hafifçe İleal flanş merkezinde mezenterik zarında bir kesi yapmak. Iki işaret parmaklarını kullanarak, açık açık mezenterik damarsal (Şekil 1B) açığa yağ ve bağ dokusu uzak teşrih.
  3. Bağırsak mezenterinde bu flanş veya şişkinlik, birden fazla şubesi teşrih (~ 2 cm uzunluğunda) ileum (Şekil 1C) bu kısmını destekleyen maruz mezenterik arter ve ven demetleri.
    1. If u, doku kavramak doğrudan kavramak veya zarar ve olumsuz doku performansı 14 etkileyebilir germe herhangi bir tür olarak çıkarılırken, tüm kan damarları üzerinde çekmeyin dikkat çekmek için forseps şarkı. Kan damarı çıkarılması iyi kaldırılacak bölümün her iki ucunda arasında kesilmesi ve daha sonra, izole bölümüne yanında ya da paralel olarak kesilmesi ile, yapılır. Kolaylığı için, gemiler forseps bir çift ile kavramak için bazı doku sağlamak için birlikte çevreleyen doku bazı kaldırmak.
    2. Forseps bir çift, buzla soğutulmuş Krebs-Henseleit tamponu içeren bir tüpe doku numunesi daldırın ve işleme laboratuarda oluşabilir kadar buz üzerinde muhafaza edin.
  4. Bir kesme yüzeyi veya bir petri ince dokulu numuneyi, kısmen buz soğukluğunda Krebs-Henseleit daldırın.
    1. Kapsamını # 5 kuyumcular forseps, Noyes iris makası kullanarak ve lamba büyüteç veya kesme, dikkatle çevreleyen yağ ve bağlant uzak teşrih (5,0X büyütme 2,5 yeterlidir)dokuları ettik ve arter ve ven ayrı. Bölümün bir ucunda kap açıklığı belirlenmesi ve dikkatli bir forseps ile kabı çevreleyen fasya tutun.
    2. Makasla kesme yükseltilmiş Kaplamanın altına makas ucu kaydırarak kabına paralel olun. İlk kesildikten sonra, yağ, bağ dokusu ve bundan başka, bir makas ile iki tarafı da keserek tekneden ayrılabilir. Gemiler bankta harcamak süreyi en aza indirerek gemiler mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun.
    3. (Örnekler alındıktan sonra en fazla 24 saat için depolanmış ve halen geçerli veri üretmek kontraktilite kalabilir), 4 ° C 'de taze Krebs-Henseleit tamponu ve mağaza tüplere kan damarlarının dönün.
    4. Bir jilet kullanarak, dilim damar 2-mm kesit istenilen sayıda içine myograph kullanılacak (tutarlı kesitler elde etmek için bir doku dilimleme makinesi kullanmak yararlı olur).
    5. Diseksiyon sco altında her bölümü inceleyinpe (12,5X büyütme) her bölüm yanlışlıkla diseksiyon ve temizlenmesi sırasında yapılan herhangi bir anormallik, şube, vanalar, ya da yüzeysel hasar sahip olmasını sağlamak. Herhangi bir anormallik, şube, kapak, ya da yüzeysel hasar varsa damar bölümü değiştirin.
  5. Myograph odaları (genellikle <30 dk) montaj için hazır olana kadar C buz üzerinde veya 4 ° (Krebs-Henseleit tamponunda batık) Mağaza kabul dilimlenmiş gemi bölümleri.
  6. Yavaşça bir lümen aracılığı ile destek takarak myograph üzerindeki toplama kabı yuvası ve bir 2-3 g okumasının oldukça üzerindedir damarları germek için dikkatli olmak (myograph üzerindeki micropositioner kullanarak) gerilimi arttırır.
  7. Tüm odaları kaplıdır sonra, tüm odalarından tampon vakum ve tampon 5.0 ml dolum ve dengeleme dönemi ve deney başlamak için 15 dakika zamanlayıcı başlar.

4. Deney

  1. Istikrarlı res elde etmek için 1.5 saat boyunca, tüm gemi bölümleri dengeye1.0 g ting gerilim.
    1. Krebs-Henseleit inkübasyon tamponu her 15 dakikada bir değiştirin.
    2. Dengeleme sırasında, sürekli olarak 2 g, kan damarı bölümleri üzerindeki gerilimi ayarlamak kadar ve daha sonra yaklaşık 0.80 g aşağı rahatlamak için izin verir. Gemiler (onlar bağlar kayabilir) çok dinlenmek için izin çalışın. Damar ayarı gerekmeksizin 1 gr gerginliği tutan bir sabit başlangıç ​​gerilimi elde etmek için deneyin.
  2. Dengeleme sırasında, KCI sulu 1.32 M çözelti, bir referans olarak kullanılmak üzere hazırlanması.
  3. Tatmin edici bir dengeleme tamamlanmasından sonra, banyo kabına 5.5 ml çözelti içinde 0.12 M çözelti ile sonuçlandığı 1.32 M KCI çözeltisi 500 ul ilave edin.
    1. Bu ilave gelen azami tepki doku canlılığını ölçmek için kullanılmaktadır ve bir A (tedavi verileri normalize etmek için, örneğin konsantrasyon yanıtlar kullanılabilir üzere manüel olarak gerginliğini ayarlamak için değil, 1.32 M KCl eklenmesini takibengonist).
    2. Gerilim 1.0 g başlangıç ​​değerine geri dönene kadar 15 dakikalık aralıklarla tampon değiştirin.
  4. Temel ulaşıldığında, tampon değiştirme ve aynı zamanda, 1 dakika süre zamanlayıcı başlar. Başlangıç ​​kez şaşırtıcı önlemek için aynı anda tüm odaları için bunu yapın.
    1. Eklenecek standart vorteks ve 1 dakika geri sayım esnasında gözün 1 yorum hazırlar.
    2. (Bu toplam hacminin% 0.5 altında tutan tedavi) verildi gerektirdiği her bölmeye 25 ul alikolar içinde standart ekleyin.
    3. Son standart eklendiğinde, 9 dakika zamanlayıcı başlar.
    4. 9 dk standart İnkübasyonun sonunda, bölmeden gelen tedavi içeren tampon kaldırmak ve taze tampon maddesi içinde 5.0 ml ekleyin ve 2.5 dakika zaman ölçeri başlat.
    5. Adımı tekrarlayın 4.4.4.
    6. İkinci 2.5 dakika çalkalama sonunda odacıkları, vakum ve taze tampon eklemek ve Secon başlamasından geri sayım, 1 dakika süre zaman ölçeri başlatd standart ekleme.
  5. Günün standart eklemeler için tüm bu döngüyü devam edin.
  6. Nihai standart ek ve sonraki 9 dakika inkübasyon sırasında 500 ul çalışma referans dozunun yanı sıra bir sonu için 1.32 M KCI referans bileşik hazırlamak.
  7. Son bir muamele ilave edilmesinden sonra 1 dakika aranın ardından KCI ekleyin ve 9 dk zaman ölçeri başlat.
    NOT: KCI ilaveli deney sonuca doku canlılığını onaylamak ve önemsiz tepki ile sonuçlanan bir tedaviyi tatbik durumunda yararlıdır.
  8. Nihai 9 dk referans bileşiği İnkübasyonun sonunda, vakum odası ya da tümünden tampon çıkarın. Taze tampon katmayın. Denemeyi sonlandırın.
  9. , Grafik dosyayı kaydedin kan damarı bölümleri çıkarmak ve imha ediniz ve yukarı temiz protokolü takip (üretici tarafından sağlanan ve laboratuvar spesifik olabilir) myograph ekipman için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dahil sonuçları üretmek için kullanılan kan damarları, 3 hafta aralığında olan 6 Holstein yükleyiciler (425 ± 8 kg) toplanmıştır. KCl ve konsantrasyon içerisinde arttırılarak tedavi eklemeler için tipik damar mezenterik kasılma tepkisinin bir örneği cevabının büyüklüğü (verici hayvanın boyutu ile ilişkili) kabın boyutu ile bir değişir. Şekil 2'de sunulmuştur, ama aynı zamanda bir can yanlış kullanım sonucu (olumsuz) etkilenir toplanması ve temizlenmesi sırasında gemilerin (germe). Bu nedenle, KCI ye karşı en gemi maruz önemli bir gerilme tepkisini gözlemlemek önemlidir. Ihmal edilebilir bir tepki bu noktada görülürse, o gemi ile prosedür içine herhangi bir daha devam etmek tavsiye edilmez. Şekil 2'de 9 dakika kuluçka süresi de görüldüğü gibi, artan konsantrasyonları ile karşılık gelen tepki olarak artan artış vardır. Bu parçacık halinde için istenmesine rağmenular deneysel tasarım, her zaman oluşabilir veya diğer tedaviler ile aranılır olması. Toplanan verilerin işlenmesinde kullanılan her ne kadar bu geminin herhangi bir yanıt değilse o (deney süresi bitiminde doku canlılığını teyit daha önemli hale gelir deney sonuca KCI ilaveli, çok önemlidir Tedavi eklemeler).

Şekil 2'de sunulan veriler, gerilim gram cinsinden kaydedilir. Bu, herhangi bir hayvan arası hayvan ve damar-için-damar değişikliğini en aza indirmek için bu verileri normalleştirmek için önemlidir. Böylece, canlılığının bir göstergesi olarak kullanılan ek olarak, maksimum KCI yanıt tedavi eklenen tüm normalize etmek için kullanılır. Bu, maksimum KCI bir yüzdesi olarak kontraktil yanıt verilerini üretir. Bu 5-hidroksitriptamin konsantrasyonunu artıran yükleme mezenterik arter ve ven tepki eğrileri, bir (serotonin Şekil 3) ve norepinefrin (

5-hidroksitriptamin (Şekil 3) ve norepinefrin (Şekil 4) hem mezenterik ven tepkisi negatif değerler başladı. Bu, ilk KCI eklenmesinden önce kaydedilen baz gerilimi ile, her biri 9 dakikalık kuluçka süresi boyunca kaydedilen maksimum gerilimi düzeltme bir sonucudur. Bu temel düzeltme gerginlik herhangi hafif farklılıklar analizlere dahil ve sunulan veriler gerginlik sadece bir değişikliği yansıtmak için izin olmasını sağlar. Rahatlatıcı ve sonraki tedavi ek önce ön-KCI taban seviyesinin altında bırakarak kan damarından negatif değer sonuçlar. Bu tedavisi veya agonistin ilk konsantrasyonları bir gerilme tepkisini neden olmak için çok düşük olan venöz kan örneklerinde yaygındır. Bu benim için böyle değildi damar tedavi eklemeler yanıt başlayana kadar çizgisinin üstünde gerginlik düzenlenen biyojenik amin birine mezenterik arter yanıt. Bu fark, iki, kılcal damar yataklarının tarafında ve hem de neden Bu deneyde bir parçası olarak kabul edilmiştir üzerinde damarlarda farklılıkları örneklendirmektedir.

Bu biyo-tahlil ince bağırsağa gıda maddelerinin yanı sıra ince bağırsağın uzak emilir ve besin maddelerini kan damarları besleyen kan damarları üzerinde bileşiklerin vazoaktiviteye değerlendirmek için de kullanılabilir. Şekiller 3 ve 4'te, bu veriler elde edilebilir ne kadar basit örnekleridir. 5-hidroksitriptamin (Şekil 3) durumunda, arteryel ya da venöz kontraktil yanıt olarak bir farklılık yoktu. Tersine, norepinefrin, artan yoğunluklarda mesenterik damarından kontraktil yanıt mezenterik arter daha fazla idi.

Güre 1 "fo: İçerik-width =" 3in "src =" / files / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Şekil 1:. Mesenterik kan damarlarının kaynağı olarak kullanılan sığır bağırsak sisteminin bir örneği, Kırmızı Yıldız işareti bir referans noktası olarak üç bölmelerinde ileoçekal kıvrımın görünür kısmını gösterir. (A) damar örnekleme meydana İleal flanş gösteren kırmızı oval bütün yolu. Mezenterik damar yatağında (B) Pozlama. (C) İris makası mezenterik ven (görünür) ve arter (görünmez) koleksiyonuna hemen önce bir maruz dalına işaret ediyor.

Şekil 2
Şekil 2: norepinefrin artan konsantrasyonları için mezenterik damarın bir konsantrasyon yanıt Örneği (1 x 10 -7 1× 10 -4 M). Iz başında ve sonunda büyük olaylar 0.12 M KCI eklemeler tepkilerdir. Kırmızı dikdörtgen, her tedavi ilave edilmesi için 9 dakikalık kuluçka süresi ile ilgili veri toplama bölgesini belirtir. Bu takip 3 ince sivri tampon değiştirmeleri tarafından yaratılan eserler ve analize dahil edilmemiştir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: mezenterik arter (MS) ve ven kasılmalarını ortalama (PD n = 6 sığırı), 5-hidroksitriptamin (serotonin) artan konsantrasyonları için bir sigmoidal verileri uyması için doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak elde edilmiştir gösterilmiştir Hatları. R konsantrasyonuesponse aşağıdaki denklemi eğri kullanılır: y = alt + [(üst - alt) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - X))] üst ve alt platolar 120 mM KCI, maksimum kasılma tepkisinin yüzdesi olduğu, ve AT 50 KCI maksimum tepkinin% 50'sini üreten alkaloid molar konsantrasyonudur.

Şekil 4
Şekil 4: mezenterik arter (MS) ve ven kasılmalarını ortalama (PD n = 6 sığırı) norepinefrin artan konsantrasyonları için kullanılan bir sigmoidal konsantrasyon-tepki eğrisi için verilerin uyması için doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak elde edilmiştir gösterilmiştir Hatları. Aşağıdaki denklem: y = alt + [(üst - alt) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], alt ve üst 120 mM KCI maksimum c yüzdesi neredeplatoların buna tepki ontractile ve EC50 KCI maksimum tepkinin% 50'sini üreten alkaloid molar konsantrasyonudur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu biyoanalizde gelişiminde ilk zorluk mezenterik damarların bir tekrarlanabilir toplama sitenin kurulması oldu. Ileum ve sonuç olarak mezenter yoluyla jejunumda ilerlemesi sırasında, ince bağırsak değişim bazı fonksiyonlarını benzer bir modeli farklılaşabilecektir olarak Örnek Alanı tutarlılığı büyük önem taşımaktadır. Mezenterik arter ve ven İleal dalları en kolay tespit anatomik noktalara aracılığıyla vardı. Çekum bulma ve mezenter sol tarafında kendi terminaline ileosekal kat izleyerek, bu kranial mezenterik arter 15 sonlandırılması yakındır. Uzun mezenterin alanı ve ileoçekal kat uzantısı (bir sığır cinsi hayvan için benzersiz) çok tekrarlanabilir sayıda hayvan genelinde 16 yapılan örnekleme (flanş adlandırılır). Yapılabilir büyük tuzaklar bir biyolojik deneyi bu aşamasında. Mekanik germe sonraki gemi p üzerinde büyük bir olumsuz etkiye sahiptirperformansı alabilirsiniz 14 ve araştırmacı aşırı çıkarılması ve daha sonraki temizleme sırasında manipüle veya gerilir gemiler referans bileşik kullanılan yanıt vermez göreceksiniz. Bu ne yazık ki gerçekten işlevsel bir seviyede ve güvenilir verilerin oluşturulması için daha fazla düşünülmemelidir KCl yanıt vermeyen gemiler damar hazırlık kalitesini değerlendirmek için tek yoldur.

Burada sunulan son yöntemine neden diğer iki yöntem doğrulama adımlarından (gösterilmemiştir), referans bileşikleri ve 24 saat depolamadan sonra, kan damarlarının canlılığını test etmek gibi başka kimyasal maddelerin kullanılması olmuştur. Norepinefrin ve serotoninin referans bileşikleri olarak değerlendirilir, ancak bunları başarıyla kullanılabilir için mezenterik arter ve ven ile kap tipi yanıtları boyunca ve hayvanlar arasında çok değişken edildi. Bunun aksine, 120 mM KCl eklenmesi arter ve ven preparasyonlar arasında çok tekrarlanabilir tepkisiyle sonuçlanmıştır. BirLSO, arter ve ven yanıtları toplama gününü değerlendirmiş ve 24 saat sonrası koleksiyonu yeniden değerlendirilmesi ve arter veya ven ya agonist yanıtta hiçbir fark edildi. Orada uygulanabilir tedavi (ya da çeşitli tedavi kombinasyonları), çok sayıda, genellikle, ancak araştırmacılar myograph ve zaman alanı ile sınırlıdır gibi bu biyolojik deneyi önemli bir yönü oldu. Koleksiyonundan 24 saat dışarı canlılığı süresini uzatarak, ek deneme için zaman büyük ölçüde artar.

Araştırmacı bu bioassay uygulanan tedavi yapısının esnekliği anlamak için önemlidir. Bir araştırmacı Klotz ve ark durumunda o kronik biyolojik alaka şey kontrol etmek amacıyla veya tedavi olarak kan damarlarını açığa ilgilenen kuluçka tamponu herhangi bir bileşiği (ekleyebilirsiniz. 17, bu ile yapıldı yanal safen damarları sürekli maruz keilgi, bir serotonin reseptörü antagonize tanserin). Mesentrik kan damarlarının bir kontraktil yanıt deney gerçekleştirilmeden önce, ilgi konusu bir bileşik ile önceden muamele edilebilir. Biyodeney, sunulduğu gibi, agonistler gibi ergot alkaloidleri de ve vasküler yanıtı 18 etkilenen ergo alkaloidleri öncesinde diyet maruz olmadığını seyir kümülatif yoğunluk yanıtı deney yapmak için tasarlanmıştır. Temsilci sonuçlar, bu yöntem, bir ölçülebilir damar yanıt üretebilir ve yalnızca dört konsantrasyonlar elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Egert ve diğ. 18 durumunda, bir tepki eğrisi oluşturmak için kullanılabilir en fazla 10, farklı konsantrasyonlarda vardı. Bu yöntem, zaman içinde küçük bir pencerede tek bir hayvana ilişkin farklı bileşiklerin veya kan damarlarında alıcılannın büyük bir sayısını değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ticari adı, tescilli ürün veya belirtilen ekipmanların Mansiyon USDA tarafından bir garanti anlamına gelmez ve mevcut olabilecek diğer ürünlerin dışlayarak onay anlamına gelmez.

Acknowledgments

Yazarlar Burada kullanılan deneysel dokuları toplamak için fırsatlar sağlamak için Ryan Chaplin ve Kentucky etler Lab ve Hayvan ve Gıda Bilimleri Bölümü Üniversitesi'nden Dr Gregg Rentfrow kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. Regulation of intestinal blood flow. The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).
  2. Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  4. Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
  5. Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
  6. Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
  7. Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
  8. Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
  9. Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
  10. Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child Springer-Verlag. (1978).
  11. Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
  12. Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
  13. Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
  14. Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
  15. Smith, D. F. Bovine intestinal surgery. Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).
  16. Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
  17. Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
  18. Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics