実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

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Zweckberger, K., Liu, Y., Wang, J., Forgione, N., Fehlings, M. G. Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (96), e52105, doi:10.3791/52105 (2015).

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Abstract

脊髄損傷(SCI)は、患者とその家族のために深刻な神経学的障害や、心理的、経済的、社会的影響を引き起こす。臨床的には、SCIの50%以上が頸椎1に影響与える。主な傷害の結果として、炎症、アポトーシス、および脱髄を含む二次メカニズムのカスケードは、最終的に髄内空洞2,3の組織瘢痕化と発展につながる発生する。どちらも、細胞移植、統合、および再生の物理的および化学的障壁を表す。そのため、抑制性の環境を成形し、細胞移植と再生のための支援環境を作成するための空洞を埋めることは有望な治療ターゲット4である。ここで、動脈瘤クリップを用いて、子宮頸部SCIの挫傷/圧縮モデルが記載されている。完全な離断または脊髄の破裂は稀であるため、このモデルは、より臨床的に関連する他の実験モデルよりも長い。またcomparisoで重量ドロップモデルにN、特にダメージで背の列、脊髄の周圧縮が有利表示されます。クリップ閉鎖力および持続時間は、異なる損傷の重症度を達成するように調整することができる。リングばねは、クリップ力の正確なキャリブレーションと恒常性を容易にします。生理的条件下で、合成自己集合性ペプチド(SAP)ナノファイバーに自己集合し、したがって、SCI 5における適用のために魅力的。それらは脊髄に対する損傷を最小限に病変に直接注射することができる。 SAPは、髄内の空洞を埋めるため、再生治療のために、損傷した脊髄を装備する足場を建てる生体適合性構造体である。急性期後6 0.14日SCI後中性pHでK2(QL)6K2(QL6) Lドンによって導入された新規のSAPである。6他のペプチドと比較して、QL6自己集合βシートに、SAPの病変および神経前駆細胞(NPC)の中心に注入される麟蹄である隣接する背側の列にCTED。細胞の生存をサポートするために、移植は、7日間の浸透マイクロポンプによって成長因子の連続的な硬膜下投与と組み合わされる。

Introduction

脊髄損傷の50%以上が頸椎に関連している。脊髄の初期挫傷を、その後、継続的な圧縮は、骨折、出血または組織の腫脹によって引き起こされる臨床設定つの主要な病態生理学的メカニズムに記載されている。

動脈瘤クリップ挫傷/圧縮モデルを模倣両方の病態生理学的メカニズム:クリップをスナップする挫傷を生成し、クリッピングの持続時間は、骨折、出血または組織によって引き起こされる臨床現場での圧縮は、最後の有意な長い腫脹こと失点、圧縮成分を表す。使用される動脈瘤クリップを正確かつ再現性のクリップ力を保証するリングばねによって変更される。特に、ヘミ離断または挫傷モデル、この動脈瘤クリップモデルを模倣最良の臨床設定と比較して。頸椎INJと胸部外傷の患者は麻痺に苦しむ一方で、ほとんどの患者uriesは四肢麻痺と完全に依存しています。頸髄の解剖学的構造は、しかしながら、胸椎または腰椎と比較して有意差を示し、従って、このプロトコルに特に対処される。

髄内空洞および組織瘢痕化の開発は回復と再生のための障害となっている。これらの障害の足場材料の使用を克服するための有望なアプローチである。自己組織化ペプチドは、病変の震源地に直接注入することができます。そこで彼らは、空洞を埋めるナノファイバー足場に集合し、炎症および組織瘢痕を減らすことによって抑制環境を改善する。剛性材料は、注入時の脊髄のかなりの損傷を引き起こす一方で、流体ペプチドが安全かつ深刻なダメージを与えることなく、追加注入することができる。

したがって、幹細胞移植前に自己集合性ペプチドとの阻害性環境の改善、細胞のiをサポートntegration頸部脊髄損傷後の分化し、最終的に、機能回復、。

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Protocol

注:以下の実験プロトコルは、大学健康ネットワーク(トロント、カナダ)の動物管理委員会によって承認され、動物のケアのカナダ人評議会により調製し、実験動物の世話と使用するためのガイドに設立されたポリシーに従っているた。

1.子宮頸動脈瘤クリップ挫傷/圧縮モデル

  1. 手術オートクレーブ器の前および70%アルコール浴に器具を置くことによって全体surgcial手順中に無菌状態を維持する。
  2. (1:1)酸素との組合せ(O 2)、亜酸化窒素(N 2 O)とのWistarラット(250〜270グラム)を麻酔し、そして1.8から2.2パーセントイソフルランおよびガス麻酔マスクを介して自発呼吸をサポートする。麻酔の誘導のために1分間、5%イソフルランで開始し、その後減少させる。手術を開始する前に、痛みを伴う刺激を与えることにより、麻酔の深さを制御する( 例えば 。足で)。脂肪軟膏を適用します目に乾燥を避けるために、後続の感染を防止することができる。
  3. 発熱クッション(37℃)にラットを入れて、定位フレームに頭部を固定する。
  4. 頸椎周りの手術部位を剃るとポビドンヨードおよび70%アルコールで消毒する。
  5. 胸椎椎体2(T2)の著名な突起に到達頸椎(C2)から脊柱上記正中切開を行います。
  6. 頭尾方向(出血を避けるために)直接正中線上の椎骨の筋肉の外側の層を通って切断し、さらにあなたが棘突起とラミナに到達するまで、ぶっきらぼうに深い筋肉層を分析。リトラクターを挿入します。
  7. 椎弓切除術の対象となるレベルを観察する椎骨本体T2の著名な棘突起を方向付ける。識別と選択したラミナの微小外科調製後、ラミナと棘突起を緩めligamenti flavaeを切断。最後に、C脊髄に対する骨クリッパー横にラミナを通じてUTと脊髄自体のいずれかの圧縮を避け、静かにそれらを削除します。
    注:ほとんどの一般的なレベルは、C5 / 6、C6 / 7、またはC7 / T1である。周術期死亡率は損傷レベル吻側より増加します。脊椎傍静脈洞から出血することは一般的であり、スポンジで慎重な圧縮によって対処することができます。
  8. コー​​ドを傷つけるためにクリップを挿入する前に、(C5 / 6特にレベルで)クリッピングからそれらを惜しまする新興の神経根を識別する。
  9. スムーズなクリップ誘導を確実にするために、フックで椎体の背側から腹側硬膜を緩め、クリップの廊下を準備します。
  10. 最後に、オープンなクリップを挿入し、それが挫傷を達成するためにシャット(迅速な閉鎖を)スナップましょう。クリップ閉鎖力およびクリップ閉鎖の期間は外傷強度および圧縮の程度を決定する。一般的に使用されるgおよびclippi 15-35間のクリップ力である例えば 1分のNG時間。 ( 図1)。
  11. クリップを除去した後、2層の筋肉を適応させ、創傷を閉じる。
  12. 麻酔を停止し、それが胸骨横臥のために十分な意識を取り戻すまで、動物はあなたの継​​続的な監視下に目を覚ますてみましょう。最後に、一つのケージにラットを入れて、術後の治療ガイドラインに従ってください。
  13. 動物が傷害のこのタイプの重症度に苦労するので、あなたは、術後の治療に特別な注意を払う必要があります。
    1. (それぞれ、3日間と5日間ブプレノルフィン及びメロキシカムおよび臨床症状に応じて)鎮痛剤を投与する。
    2. 3日間の追加の生理食塩水を皮下に与え(1日2回5〜10ミリリットル(ml)で)。
    3. 2日前に飲料水で抗生物質を提供し、7日後に手術するまで、( 例えばモキシフロキサシン)
    4. 膀胱機能の回復が一定になるまで、膀胱を1日2〜3回絞るLY明らか。
    5. 少なくとも1日に1回神経学的欠損と手術動物の生理学的状態を観察します。

2.注入のSAPとのNPC(損傷後14日間)

  1. 1.1で説明したように麻酔を誘導する。 1.3に、定位フレームにラットの頭部を固定し、ステッチまたは創傷クリップを削除し、傷やポビドンヨードおよび70%アルコールで手術領域を消毒する。
  2. 慎重に、脊椎傍の筋肉を解剖リトラクターを挿入し、硬膜から微視的に瘢痕組織を除去し、病変部位を再公開します。
  3. 細胞外マトリックスゲルを実行する(w / v)の1%の濃度でSAPを準備する。 QL6のSAPは、生理学的に適合性のpHを持っており、注射の前にバッファリングする必要はありません。脊髄におけるSAPの可視化のため、QL6(QL6-FITC)の蛍光誘導体を使用しています。
  4. SAPは(2回に分けて分布する病変の中心に5マイクロリットル(μL)、それぞれを注入正中線の2.5μlの二国間。マイクロガラスキャピラリー(100マイクロメートル(μm)の外径(OD))との定位フレームに接続ハミルトンシリンジを使用してください。鋭い針の先端で慎重に硬膜を開き、心に傷を負った脊髄に定位的に2ミリメートル(mm)をガラスキャピラリーを挿入します。
  5. ボリュームの1/3を注入した後、1.5mmの深さに針を削除し、さらに3分の1〜1ミリ後に。全体積の注入後、シリンジを除去する前に、ゲル形成を安定化させるために5分間待つ。
  6. のNPCを生成するには、大人のDsRedマウス(または、緑YFP陽性マウス)を使用し、隔離し、paraventricalゾーン4,18,21からそれらを養う。
  7. 細胞懸濁液中〜90%の生細胞の存在を示す、トリパンブルー染色によるのNPCの生存率を評価。成長培地中で細胞(50×103生細胞/μl)を希釈した後、細胞移植のためにそれらを使用。
  8. 4 2μLを作る(8μlの合計VOLUME、吻側と損傷部位の尾2ミリメートルで、両側)髄腔内注射を4×10 5のNPCを含む。硬膜の開口した後、1.5ミリメートル脊髄の背側表面の下にハミルトンマイクロガラス管を挿入し、細胞懸濁液に2μlを注入する。約0.5μL/分(分)で注入速度を選択してください。
  9. コー​​ドのうち、各注入の最後には、キャピラリーの除去の前に、組織は新しい細胞容積に対応するために、ストレッチ可能にする少なくとも1分間待ちます。 ( 図2)

硬膜下の3。移植は、成長因子の応用のためのポンプ

  1. 細胞の生存を支持する成長因子と、脳脊髄液(CSF)を豊かにするために、0.5μlの/ hrの希釈率、0.04のカテーテルの直径は、7~14日を通してサブdurally成長因子を希釈微小浸透圧ポンプを使用してセンチOD、そして100μlのリザーバボリューム。
  2. 好適な成長因子を選択する(例えば、脳由来成長因子(BDGF)、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF))、ポンプ6~10時間、移植前に充填し、37℃の水浴中でポンプを平衡化する。
  3. すぐにNPCの注射の後、ポンプを配置するために皮下凹部を準備する。好ましい位置は、ポンプ自体に起因する主要な地元の不快感を回避thoraco-腹部の横方向の両サイドからである。
  4. 成長因子の最高濃度を得るために、カテーテルの開放先端が病変部位の近くに終了することを確認してください。そのため、隣接する上側または下のレベルのスキップ椎弓切除を行う。 SCIはC7 / T1である場合、C5の小さな椎弓切除を行う。
  5. 、皮下凹部にポンプを入れて必要な長さにカテーテルを短縮し、あらゆる動きに関連した転位を避け脊椎傍筋肉上のいくつかの縫合糸(6.0)で固定します。
  6. 鋭い先端で(C5で、 例えば )硬膜を開いた後針の、硬膜下腔にカテーテルを導入し、それが抵抗なくしてコードを傷つけることなく尾側方向に滑空してみましょう。 例えば C6のスキップされたラミナは、カテーテルの固定及び安定化の追加のポイントとして機能します。
  7. カテーテルがスムーズに実行され、フォールドしないことを確認してください。
  8. 縫合糸またはクリップで閉じる層によって、筋肉、および皮膚、。 ( 図3)
  9. 麻酔を停止し、それが胸骨横臥のために十分な意識を取り戻すまで、動物はあなたの継​​続的な監視下に目を覚ますてみましょう。最後に、一つのケージにそれらを戻すと術後治療ガイドラインに従ってください。
  10. にもかかわらず、動物は、この時点で部分的に回復したかもしれない特別な術後治療を提供する。
    1. (それぞれ、3日間と5日間Buprenorthineとメロキシカムおよび臨床症状に応じて)鎮痛剤を投与する。
    2. 2日前まで、水のボトルに抗生物質を提供する7日後に手術( 例えばモキシフロキサシン)。
    3. それでも、必要に応じて、膀胱を圧迫続行。
    4. ラットは、脱水表示された場合、追加の皮下流体を与えます。
    5. 少なくとも1日に1回手術動物の神経学的機能と生理的状態を観察してください。
    6. 2日前にNPCの注入を免疫抑制治療を管理し、7日後にtransplanation(ミノサイクリン)と犠牲になるまで(サンディミュン)まで、それぞれ。

4.組織の評価

  1. 観測時間の終わり( 例えば SCI後4週間)深麻酔(5%イソフルラン2-3分間)での動物を生け贄に捧げると4冷たい150ミリリットルに続く50ミリリットルの冷(4℃)生理食塩水で経それらを灌流0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の%パラ。
  2. 脊髄を取り外し、24時間0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4%パラホルムアルデヒド中に入れた。
  3. <厚さ30μmの縦凍結切片を提供します。
  4. 背景使用DAPI(:1,000 1)を提供するすべての細胞核の免疫組織化学染色のために。 DsRedは正のNPCが赤く表示され、QL-6 FITCは緑表示され、両方のは、このように特別に染色されていない必要がある。 ( 図4)。
  5. 走査電子顕微鏡(SEM)用のサンプルは、2時間、4℃にてグルタルアルデヒドに浸し、5分間のエタノール10%の増分ステップでゆっくりとそれらを脱水し、1時間加圧された液体CO 2サイフォンに配置しましょう。スパッターコーターを使用して金で被覆足場。日立S-3400N走査型電子顕微鏡で画像を撮影する。 ( 図5)

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Representative Results

上記の手順を実行するときは、。SAP足場空洞を架橋および阻害環境の改善、より少ない組織瘢痕及びNPCの生存の増加を提供し得る。図4になることで得られたラットの脊髄の縦断面を示している損傷部位SCI後6週間とQL6 SAPの注入とNPC移植後4週間。 QL6ペプチドは成功裏に震源地で集約され、コード内に注入し、周辺部で吻側 - 尾側に拡散された。電子顕微鏡図5に、さらにショーをイメージング、1%のアセンブリ(w / v)のPBS溶液で希釈し、2時間以内に、ナノファイバー足場にQL6ペプチド。

このマトリックスは、増加した細胞生存および細胞分化に寄与抑制環境の改善を提供するより少ない組織瘢痕化、最終的に機能回復のためのより良い機会をもたらす。

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図1:クリップ挫傷/圧縮動脈瘤モデルラットの脊髄のC7 / T1およびクリップ挫傷/圧縮の椎弓切除後の手術用顕微鏡を通して(A)写真クリップの(B)ピクチャリングばねが正確な保証付き。。力を閉じる。

図2
図2:SAPの注入点および幹細胞注入点のグラフ病変の震源地で2定位的に行わSAP注射、2ミリメートルの尾側と吻側の距離で隣接する背側の列にNPCのの4回の注射が続く震源から。

図3
:(A)の成長因子を投与するために、硬膜下にカテーテルを移植:カテーテルは傍脊柱筋で数6.0縫合糸で固定されている。 C5での硬膜の小さな開口部。 C7 / T1での病変部位の近くに開いたカテーテル端部とカテーテルの硬膜下の位置。横脇腹に硬膜下の凹部に配置されたマイクロポンプに接続(B)カテーテル。

図4
図4:頸髄へのSAPとのNPCの正常な配信蛍光染色(DAPIの背景、青)は、ラットの心に傷を負った脊髄の縦断面の。。ラベル付きのSAP(緑QL6-FITCは、)病変の震源地に集約されています。注入されたNPCは(DsRedのポジティブ、赤)に拡散してきた吻側および尾側方向。スケールバーは、5mmを指す。

図5
図5:ナノファイバー足場の形成の走査電子顕微鏡(SEM)組み立てSAPのナノファイバー足場の形成を示す画像。スケールバーは、1)以下を指す。

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Discussion

このプロトコルは、ラットにおいて、子宮頸部傷害モデルを実行するために読者を可能にし、子宮頸SCI後のより良い回復を促進するのSAPとのNPCとの併用治療アプローチを使用するために開発された。

挫傷と圧縮 - 、したがって、模倣最高の臨床症状 - 特にそのような(半)-transectionモデルまたは重量の低下と脳震盪モデルなどの他の頸椎外傷モデル、と比較して、クリップ挫傷/圧縮モデルは、主要な病態生理学的外傷メカニズムの両方を表す。それは十分にラットおよびマウス胸椎7-11で使用するために確立されているが、それは最近、頸椎における使用に適合されている。子宮頸部脊髄損傷は、最も頻繁に診療所で見ており、子宮頸部の解剖学的構造は、胸椎から大きく変化するので、これは重要なステップであった。さらに、四肢に苦しんで子宮頸SCI患者は、少なくとも部分的なモーターFを取り戻すことに熱心である彼らの上肢の慰め。

実験的な子宮頸SCIの困難な側面は、しかし、C5にC7から吻側方向に増加し、中間および上部の頸椎20〜30%まで達することができる高い死亡率である。さらに、(特にC5 / 6で)、新興神経根は、操作に敏感であり、それらは保持されません場合には、損傷や刺激が動物の初期の犠牲の必要性をもたらし前頭足の咀嚼を引き起こす可能性があります。一般的には、頸髄損傷の動物は、術後の注意とケアの多くを必要と回復の長い経過を示す。一方、注意深い外科的準備に加えて、これらの問題の一部は、適切なクリップ閉鎖力( 例えば 15〜35グラム)と、適切なクリッピング時間(例えば1分)を選択することによって、損傷の重症度を適応させることによって対処することができる。これらのパラメータを変更すると、けがの異なる重大度(軽度、モデラにつながるTE、または重度のSCI)。さらに、外科医の依存のリスクや損害の不平等な分配があるかもしれません。これらの問題に対処するためにクリップアプリケータを使用すると、クリップが常に解放され、したがって、同じ速度、したがって速度で閉鎖されているオプションです。クリップをスナップする前に、クリップが正しい位置を有しており、同じように全体の脊髄を囲むことを保証するために必須である。特殊な外科手術の課題は、硬膜から瘢痕組織を除去し、病変部位の再暴露である。それは、この手順は鋭い製剤を用いて、任意の圧力を回避または固定コードの引き上げ、マイクロ外科的に実行されることをお勧めします。

自己集合性ペプチドは、損傷部位であっても最終的に軸索再生をもたらし、5、12,13,14発芽に抑制環境を改善するために、さらに、空洞を埋めるとする電位を有する同定されている。 QL-6ナノファイバーは、ブリッジング足場に組み立てる髄内空洞と、このように、軸索発芽および再生のためのマトリックスを提供し、細胞移植の前に抑制環境を改善することができる。これらのペプチドの利点は、その低粘度(流体)と中性pHで横たわっていた。特にハイドロゲルまたは組織足場高粘性と比較して、SAPは容易に損傷した脊髄自体が限られている注射から誘導追加の傷害中に注入することができる。

QL6自身が細胞の生存4,15が向上することありますナノファイバーが、それにもかかわらず、成長因子の使用が有利16,17,18,19,20,21のようです。 (上述のように)、彼らは成長を放出ヒドロゲルのいずれかによって投与することができる22、または浸透圧ポンプを介してアプリケーションによって因子。硬膜下カテーテルに接続されている浸透圧ポンプは、このように連続して放出制御の利点と、子宮頸脊髄液(CSF)の濃縮を提供します。硬膜下カテーテルを配置する、しかし、茶ですいくつかの数週間は、損傷後の後に発生した可能性があり、広大な瘢痕化に関して特にllenging。

NPCの生存と統合のための良好な組織条件を提供するために、いくつかの研究では、病変4,15,18の震源地で直接病変部位に2ミリメートル吻側または尾、隣接する白質に注入点を選択したとしていない。そこでは、NPCは生存、統合、およびアストロサイト、オリゴデンドロサイトまたはニューロンへの分化のためのより良いチャンスがある、と軸索発芽および改善軸索接続性をもたらし病変に向かってまたは中に移動することができます。

この提案されたプロトコルの威力これらの技術を習得した後、個々のユーザが自分の必需品や損傷の程度および重症度の改変を包含する利益に応じて採用されるため、異なる細胞タイプまたは成長因子、または他の神経保護物質の添加の使用。

で空洞および組織瘢痕化:概要、SAPにとのNPCと組み合わせる治療は、SCIの治療で最も挑戦的な障害を克服新規かつ有望なアプローチを提供するかもしれない。

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Acknowledgments

私たちは、ヘルスリサーチ(CIHR)のカナダの研究所からのこの仕事のための資金援助に感謝し、貢献のためKrembilファミリー財団、神経修復におけるハルバート議長と再生、フィリップとペギーDeZwirek、とゴードンヤオは図2を。クラウスZweckbergerは「ドイツForschungsgesellschaft」(DFG)からの助成金によって賄われていた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aneurysmal clip SharpTech
Surgical microscope Leica
Micro injection system World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments
Hamilton syringe Hamilton company
Subdural pumps Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument Fine Science tools
Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP Baxter
7.5% Povidone iodine Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP Covidien
0.4% Trypan blue Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF) Sigma

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References

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