Adattamento umani videofluoroscopia Rondine metodi di studio per individuare e caratterizzare disfagia in modelli di malattia Murine

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Summary

Questo studio adattato con successo videofluoroscopia deglutizione studio (VFSS) metodi umani per l'utilizzo con modelli di malattia murini al fine di facilitare la ricerca traslazionale disfagia.

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Lever, T. E., Braun, S. M., Brooks, R. T., Harris, R. A., Littrell, L. L., Neff, R. M., Hinkel, C. J., Allen, M. J., Ulsas, M. A. Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models. J. Vis. Exp. (97), e52319, doi:10.3791/52319 (2015).

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Abstract

Questo studio adattato videofluoroscopia umana deglutizione studio (VFSS) metodi per l'utilizzo con modelli di malattia murini al fine di facilitare la ricerca traslazionale disfagia. I risultati di successo dipendono tre componenti critici: camere di prova che permettono di auto-alimentazione, mentre in piedi sfrenato in uno spazio ristretto, le ricette che mascherano la avversiva gusto / odore di mezzi di contrasto per via orale disponibili in commercio, e un protocollo di step-by-step test che consente la quantificazione di rondine fisiologia. Eliminazione di uno o più di questi componenti avranno un impatto negativo sui risultati dello studio. Inoltre, la capacità di livello di energia del sistema di fluoroscopia determinerà che ingoiare parametri può essere esaminato. La maggior parte dei centri di ricerca hanno fluoroscopes alta energia progettati per essere utilizzati con le persone e gli animali più grandi, che si traduce in eccezionalmente scarsa qualità delle immagini durante il test di topi e altri piccoli roditori. Nonostante questa limitazione, abbiamo identificato sette VFSParametri S che sono costantemente quantificabili in topi quando si utilizza un fluoroscopio alta energia in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino. Recentemente abbiamo ottenuto un sistema a bassa fluoroscopia energetico con capacità eccezionalmente alta di imaging e di ingrandimento che è stato progettato per l'uso con topi e altri piccoli roditori. Operazioni preliminari con questo nuovo sistema, in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino, ha identificato 13 parametri di rondine che sono costantemente quantificabile nei topi, che è quasi il doppio del numero ottenuto con convenzionali (cioè ad alta energia) fluoroscopes. Individuazione di parametri aggiuntivi rondine è atteso come ottimizziamo le capacità di questo nuovo sistema. Risultati finora dimostrano l'utilità di utilizzare un sistema di fluoroscopia a bassa energia per rilevare e quantificare i cambiamenti sottili rondine fisiologia che potrebbero altrimenti essere trascurati quando si utilizza fluoroscopes alta energia per studiare modelli di malattia murini.

Introduction

La disfagia (deglutizione impairment) è un sintomo comune di numerose condizioni di salute che interessano le persone di tutte le età. Gli esempi includono ictus, morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la paralisi cerebrale, distrofia muscolare, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), malattia di Batten, della testa e del collo, nascita prematura, e l'invecchiamento avanzato. Disfagia è fortemente correlata con la mortalità, tipicamente come conseguenza di malnutrizione grave o polmonite batterica che si sviluppa quando carichi alimentare / liquido / saliva viene aspirato nei polmoni 1-4. Questa condizione medica debilitante e pericolosa per la vita colpisce oltre 15 milioni di persone ogni anno negli Stati Uniti da soli 3. Nonostante l'alta prevalenza e gli esiti negativi associati, attuali opzioni di trattamento per la disfagia sono limitati a palliative (piuttosto che curativo) approcci, come la modificazione della dieta (per esempio, evitando specifiche consistenze cibo / liquidi), cambiamenti posturali (ad esempio, Tucking mento durante la deglutizione), approcci motore (ad esempio, esercita il targeting muscoli nella cavità orale, faringe e laringe), approcci sensoriali (ad esempio, il sapore di attuazione, la temperatura, stimolazione e / o meccanico), e il tubo di alimentazione (ad esempio, la nutrizione e idratazione somministrato per via nasogastrica (NG) tubo o gastrostomia endoscopica percutanea (PEG) tube). Questi trattamenti servono soltanto come terapia sintomatica, piuttosto che prendere di mira le cause di fondo del problema. Infatti, uno dei principali ostacoli alla scoperta di nuovi, trattamenti efficaci per la disfagia è la conoscenza scientifica limitata dei meccanismi patologici responsabili, che sono probabilmente diverso per ogni malattia.

Diagnosi disfagia è prevalentemente realizzato utilizzando una procedura radiografica chiamata videofluoroscopia deglutizione studio (VFSS), noto anche come studio bario modificato. Nel corso degli ultimi 30 e più anni, questo test diagnostico è stato considerato il gold-standard per evaluating funzione rondine 5-7. Questo test comporta avere il paziente seduto o in piedi all'interno del percorso del fascio di raggi X di una macchina fluoroscopia mentre l'ingestione volontaria di cibo e consistenze liquidi mescolati con un mezzo di contrasto per via orale, di solito solfato di bario 8,9 o ioexolo 10. Come il paziente inghiotte, cibo e liquidi contenenti mezzo di contrasto può essere visto in tempo reale tramite un monitor di un computer durante il viaggio dalla bocca allo stomaco. Strutture dei tessuti molli sono visibili e possono essere valutati rispetto alla struttura e funzione. Ai pazienti viene chiesto di eseguire diverse rondini di ogni alimento e consistenza liquida, che sono tutti video registrato per la successiva visualizzazione e l'analisi fotogramma per fotogramma per quantificare la presenza e il grado di disfagia. Numerosi componenti fisiologiche di deglutizione sono tipicamente analizzati, come il punto anatomica grilletto della rondine faringea, tempo di transito del bolo attraverso la faringe e dell'esofago, la portata e la durata della LarynGEAL elevazione, la posizione e la quantità di residui post-rondine, e la presenza e la ragione fisiologica per aspirazione 7,11.

Aspetti del protocollo VFSS umana sono stati recentemente adattati per lo studio ratti liberamente comportano; Tuttavia, i risultati sono stati limitati perché i topi non sono rimasti nel campo videofluoroscopia di vista durante i test 12. VFSS non è stata tentata con i topi. Adattamento di successo del protocollo VFSS umana per l'uso con i topi e ratti potrebbe fornire un metodo di ricerca romanzo di indagare le centinaia di murino attualmente esistenti (topi e ratti) modelli di malattie che sono noti per causare disfagia negli esseri umani. Questo nuovo metodo (di seguito anche VFSS murine) sarebbe quindi accelerare l'identificazione e la validazione di modelli murini di disfagia che sono adatti per lo studio dei meccanismi neurofisiologici alla base all'interno dei tessuti muscolari, i nervi, e il cervello che sono patologici e contribuire alla disfagia in uomo. Inoltre, murino VFSS consentirebbe l'identificazione delle misure oggettive (biomarkers) di funzione di rondine / disfunzioni che potrebbero essere confrontato direttamente con gli esseri umani. Questi incrociati specie biomarcatori videofluoroscopia potrebbero poi servire misure di esito in quanto nuovi per quantificare l'efficacia del trattamento in studi preclinici con i topi e ratti, che meglio tradurre a sperimentazioni cliniche con le persone.

A tal fine, il protocollo VFSS murino è stata stabilita utilizzando ~ 100 topi di entrambi i sessi. Tutti i topi erano o C57 o ibridi C57 / SJL ceppi. I topi C57 non sono stati geneticamente modificati, mentre C57 / SJL era il ceppo sfondo per una colonia di transgenico SOD1-G93A (o SOD1) topo, il modello animale più diffuso della SLA. La colonia SOD1 è un approssimativo 50-50 mix di transgenici (cioè ALS colpiti) topi e nontransgenic (cioè, non affetti) fratellini.

Il protocollo VFSS murino costituito da tre componenti:

  1. Ricette che mascherano la avversiva gusto / odore di mezzi di contrasto per via orale e producono radiodensity sufficiente per consentire un'adeguata visualizzazione di deglutizione,
  2. Un protocollo step-by-step test che massimizza il rispetto degli animali, riduce al minimo il tempo totale di prova e di esposizione alle radiazioni, e permette la quantificazione dei diversi parametri di rondine per ogni fase di deglutizione (cioè, per via orale, della faringe, dell'esofago e).

L'effetto combinato produce un comodo basso stress, ambiente esame, auto-alimentazione che consente di valutare l'alimentazione tipica e deglutizione comportamenti dei topi.

Protocol

Il protocollo VFSS murino segue un protocollo approvato Cura e uso Comitato Animal Istituzionale (IACUC) e delle Linee Guida NIH.

1. Chambers Construct osservazione dal policarbonato Tubi e Fogli (Figura 1)

  1. Tagliare 5 cm di larghezza tubi in policarbonato, quadrato (~ 2 mm di spessore) in 16 centimetri di lunghezza con una fresatrice manuale. La maggior parte dei mouse adeguatamente inseriscono all'interno di queste dimensioni, che si traduce in una camera di prova stretta che permette di camminare e girare intorno, se lo desideri. Uno spessore di ~ 2 mm consente un'adeguata rigidità senza attenuare in modo significativo il fascio di raggi X.
    1. Due tipi di camere sono essenziali per questo protocollo: "tubi becco", progettati per fornire liquidi con beccuccio e "tubi di ventilazione", progettati per fornire liquidi via peg-bowl.
      1. Per "tubi" becco, fare un piccolo foro oblungo (12 x 8 mm) nella parte superiore di ogni tubo vicino ad una estremità mediante una fresatura mach manualeine. Questo foro è utilizzato per fornire soluzioni potabile attraverso un beccuccio tubo sipper durante il condizionamento comportamentale e test VFSS.
      2. Per i "tubi di ventilazione", trapano 9 piccoli fori di ventilazione nella parte superiore di ogni tubo vicino ad una estremità. Questo tubo è utilizzato durante i test VFSS con peg-ciotola invece di tubo di aspirazione.
      3. È possibile utilizzare tubi becco quando trasporta liquido tramite peg-ciotola; Tuttavia, l'apertura del soffitto della camera deve essere bloccato per evitare comportamenti esplorativi distrazione dai topi (vedi punto 6.2.2).
  2. Teli Cut policarbonato ("spessore 3/4) in testate (50 x 50 mm, 2 per provetta) con una fresatrice computerizzata, chiamato anche un controllo numerico (CNC) macchina computerizzata.
    1. Mill una scanalatura oblunga (19 x 6 mm) prossimità di un bordo della faccia interna di ciascun tappo terminale. Utilizzare questa scanalatura per garantire un piolo-ciotola per i topi di bere durante i test VFSS.
    2. Mill 5 fori di ventilazione circolari (6 mm di diametro) Attraverso ciascuna testata.
    3. Mill un foro più piccolo rotondo (diametro 5 mm) fino alla fine-cap, direttamente sopra la scanalatura oblunga. Utilizzare questo foro per trasportare il liquido nel peg-ciotola durante il test VFSS.
    4. Sulla faccia esterna del fine-cap, mulino a 9/16 "di diametro svasatura che è 1/4" in profondità intorno a questo foro più piccolo.
    5. Mill via 2 mm lungo il perimetro della faccia interna del tappo terminale ad una profondità di 7 mm a fare un passo che inserisce facilmente nella estremità del tubo.
    6. Mill una scanalatura circa 1 mm le passo del tappo terminale per ospitare un O-ring, che è necessario per evitare il tappo terminale cadere dal estremità del tubo.
    7. Concludete bordi esposti e smussare tutti gli angoli delle testate per prevenire masticare dai topi.
  3. Fai PEG-ciotole di policarbonato teli utilizzando una macchina CNC. Ingombro dovrebbero essere 24 x 19 x 6 mm 3, con una depressione 10 x 3 mm 2 ciotola forma ad una estremità. Un peg-bowl è needed per ogni provetta. Peg-ciotole dovrebbero inserire comodamente nella scanalatura oblunga nelle testate (Figura 2).

Figura 1
Figura 1:. Osservazione Chambers camere di osservazione sono stati progettati per mantenere gli animali si comportano liberamente nel campo fluoroscopia di vista. Queste immagini mostrano componenti della camera essenziali per lo svolgimento di VFSS. Top: "tubo becco", progettato per fornire liquidi via beccuccio. In basso: "tubo di ventilazione", progettato per fornire liquidi via peg-bowl. Le due testate sono intercambiabili tra i tubi becco e ventilazione.

Figura 2
Figura 2:. PEG-bocce Ogni peg-bowl scatta in una scanalatura nella faccia interna di ogni end-cap. A sinistra:componenti smontati. Componenti assemblati: Medio. A destra:. Faccia esterna del fondello Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Costruire Bottiglie Sipper Tubo da centrifuga Provette, silicone Tappi e Beccucci metallo (Figura 3)

  1. Utilizzare una sonda di tappo (5/16 ") per fare un foro centrale attraverso ogni tappo in silicone.
  2. Applicare qualche goccia di olio minerale nel foro e inserire manualmente un beccuccio di metallo nella estremità larga del tappo. Diritte beccucci sfera sono preferiti perché diritte beccucci aperti provocano eccessiva fuoriuscita e schizzi di mezzo di contrasto all'interno della camera di osservazione, che possono interferire con la visualizzazione durante il test.
  3. Regolare la lunghezza becco modo che occupa l'intera lunghezza del tappo silicone e estende circa 3 cm oltre l'estremità larga del tappo.
  4. Inserire l'estremità più stretta di ciascun tappo (che contiene un tubo di aspirazione), in un tubo da centrifuga di 30 ml.
  5. Verificare che la lunghezza del beccuccio è adeguata inserendolo attraverso il foro oblungo nella parte superiore della camera di osservazione. La punta beccuccio deve riposare circa 1 cm dal soffitto della camera, che è sufficientemente lungo per i topi adulti sani di raggiungere.
    NOTA: Longer lunghezze producono topi bere mentre si gira / si inclina la testa, che oscura la visualizzazione di deglutizione durante VFSS.
  6. Estendere la lunghezza becco per ospitare topi più giovani, ceppi di topi di dimensioni più piccole, e modelli di malattia di topo che non possono raggiungere il beccuccio a causa del motore compromissione degli arti.
  7. Lavare i beccucci appena effettuate prima dell'uso per rimuovere l'olio minerale, detriti silicone, e altri contaminanti durante la movimentazione.

Figura 3
Figura 3: Sipper. Tubo Bottiglie sinistra: i componenti smontati. Componenti assemblati: Medio. A destra:. Del mouse potabile dal tubo di aspirazione in camera di osservazione Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Costruire un sistema di consegna siringa per l'uso con PEG-bocce (Figura 4)

  1. Utilizzare un tornio per fare gli adattatori per il polietilene (PE) tubi di collegamento alle testate camera di osservazione, descritto come segue.
    1. Tagliare 1/2 "di diametro in resina acetalica materiale dell'asta in 1 1/4" sezioni di lunghezza, in appresso denominate adattatori tubo (o schede).
    2. Ad una estremità di ciascun adattatore, ridurre una "parte lunghezza alla punta 3/16" 1/2 di diametro, qui di seguito denominato l'estremità più stretta.
    3. Per il restante sezione "lunghezza di ciascun adattatore (cioè, 1/2" 3/4 estremità di diametro), scanalature Apparecchiatura di presa manuale durante use. Questa sezione è qui indicata come la parte più larga.
    4. Nel vasto termine di ciascuna scheda, praticare un foro centrale che è 0,098 "di diametro e 1" in profondità.
    5. Drill e alesare la parte restante del foro centrale in ciascun adattatore a 0.096 "per fornire una perfetta aderenza sul tubo PE.
  2. Tagliare tubi PE (PE 240, diametro interno 1,67 millimetri) alla lunghezza desiderata con una forbice. Una lunghezza 3-4 piedi aumenta sufficientemente la distanza tra il ricercatore e il fluoroscopio durante i test VFSS per migliorare la sicurezza di radiazioni.
    NOTA: Longer lunghezze utilizzeranno un volume maggiore di soluzione di contrasto durante i test VFSS, forse superiore allo standard 30 ml ricetta.
  3. Inserire un 15 G ago a punta smussata pienamente in una delle estremità del tubo in PE. Il raccordo deve essere aderente.
  4. Inserire l'altra (libero) un'estremità del tubo PE attraverso il foro centrale del tubo dell'adattatore, partendo tegli end largo.
  5. Estrarre il tubo PE fuori l'estremità stretta dell'adattatore modo che si estenda ~ 2 mm.
  6. Inserire l'estremità stretta dell'adattatore (con tubi PE ~ 2 mm che si estende da esso) nel tappo terminale di un tubo di osservazione; dovrebbe andare bene comodamente nel foro con lamatura che si trova direttamente sopra la peg-bowl.
  7. Regolare la lunghezza del tubo PE alla fine stretta dell'adattatore in modo che si estende poco sopra la depressione ciotola nella peg-bowl.
  8. Riempire una siringa da 10 ml (senza ago) con acqua da un bicchiere ed eliminare eventuali bolle d'aria.
  9. Attaccare la siringa riempita all'estremità dell'ago del tubo in PE.
  10. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per erogare acqua nella peg-ciotola nella camera di osservazione. Fermarsi quando il peg-bowl è quasi pieno. Evitare di riempire eccessivamente, che causerà schizzi durante potabile.
  11. Se il peg-ciotola non riempie correttamente, regolare la lunghezza del tubo PE estende sopra il piolo-ciotola.
  12. Over-estensione del PEtubi attirerà topi per masticare su di esso durante le prove, piuttosto che bere dal peg-bowl.
  13. Se il tubo PE non è abbastanza estesa, liquido eseguire sul pavimento della camera di osservazione piuttosto che riempire il piolo-ciotola.
  14. Dopo l'uso, staccare la siringa e lavare l'intero sistema di erogazione siringa con acqua e sapone. Utilizzare una siringa da 10 ml per spingere aria attraverso il tubo PE per rimuovere l'acqua. Sterilizzare in autoclave come necessario.

Figura 4
Figura 4:. Siringa Delivery System sinistra: i componenti smontati. Componenti assemblati: Medio. A destra:. Del mouse potabile da peg-bowl in camera di osservazione Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Costruire una SCISS motorizzatoSollevare il Tavolo per posizionamento remoto della Camera di osservazione (Figura 5)

  1. Costruire un ascensore a forbice con una piattaforma di 12 x 12 cm, può sollevare e inferiore di 5 cm per ospitare topi visualizzazione in diverse posizioni all'interno del campo visivo fluoroscopia. Ascensore materiale dovrebbe essere di metallo o di plastica per facilità di pulizia con disinfettanti.
  2. Motori passo-passo Mount per regolare l'altezza e la posizione longitudinale dell'ascensore.
  3. Coppia il primo motore passo-passo al meccanismo a forbice per controllare l'altezza traducendo una traversa. Questo accoppiamento può essere una vite o cremagliera e pignone ingranaggi piombo.
  4. Coppia il secondo motore passo-passo al telaio a forbice per controllare la posizione longitudinale traducendo l'intero telaio di sollevamento rispetto alla tavola. Questo accoppiamento può essere una vite o cremagliera e pignone ingranaggi piombo.
  5. Collegare un sistema di telecomando per i motori passo-passo per consentire la regolazione della posizione della camera di osservazione durante l'imaging minimizzando investigal'esposizione alle radiazioni tor.
  6. Interfaccia tasti del telecomando palmare con un chip microcontrollore per controllare l'attivazione e la direzione di ogni motore passo-passo.

Figura 5
Figura 5:. Telecomandato Scissor Lift Tabella A sinistra: vista laterale della tavola a forbice. Destra: Piano di sollevamento con camera di osservazione posizionato in fluoroscope. La tabella di sollevamento regola la posizione della camera di osservazione per mantenere i topi nel campo visivo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Eseguire condizionamento comportamentale Prima VFSS test per garantire la partecipazione massima

  1. 1-2 settimane prima VFSS test, i topi sottoposti a una notte (12-16 ore) periodo di regolazione dell'acqua per indurrela sete, durante i quali l'acqua è trattenuta dalla gabbia di casa. L'obiettivo del regolamento è l'acqua per gli animali siano sete, disidratati. Gli animali devono restare vigile e reattivo. Questo telaio durata e il tempo è essenziale per prevenire la disidratazione, che può verificarsi come risultato di 2 acqua regolazione episodi entro 1 settimana (cioè, uno per condizionamento comportamentale e una per il test VFSS).
  2. Posizionare un "tubo erogatore" (con una estremità chiusa da un tappo terminale) sul pavimento di una gabbia contenente casa lettiera fresca. L'estremità chiusa dovrebbe essere più vicina all'apertura beccuccio nel soffitto della camera. Questo passaggio garantisce una adeguata ventilazione, mentre più topi dormire rannicchiato all'interno della profondità della camera durante la notte. L'estremità aperta consente topi di entrare / uscire nella camera libera.
  3. Rimuovere altro materiale di arricchimento (ad esempio, nestlet e rifugio) per incoraggiare i topi da esplorare e dormire nella camera durante la notte (Figura 6). Questo passaggio garantisce che i topisono acclimatati per essere nella camera per lunghe durate prima del test VFSS.
  4. Fornire un unico standard alimentare pellet per topo sul pavimento della gabbia per mangiare overnight; non forniscono acqua o altre fonti di idratazione.
  5. Utilizzare un top filtro standard per contenere i topi nella gabbia durante la notte, le dimensioni della camera di osservazione impediscono un coperchio filo standard dal raccordo nella gabbia. Conservare il coperchio rimosso filo (contenente cibo e bottiglia di acqua) sulla parte superiore della parte superiore del filtro appesantire il coperchio ed impedire la fuoriuscita topi.
  6. Eseguire appetibilità test la mattina seguente, descritta come segue.
    1. Fare una soluzione di test al cioccolato in una bottiglia tubo sipper 30 ml, senza l'aggiunta di mezzo di contrasto (ad esempio, acqua sostituto ioexolo). Questa ricetta è descritto nella Tabella 1. Effettuare una bottiglia per gabbia da testare.
    2. Togliere la camera di osservazione e sostituire il coperchio del filo standard. Offrire al cioccolatoSoluzione (temperatura ambiente ~ 22 ° C) per 2 min per gabbia, inserito attraverso il coperchio del filo.
    3. Valutare appetibilità osservando i comportamenti di consumo durante il periodo di prova di 2 min.
    4. Punteggio appetibilità secondo i seguenti criteri:
      1. Latenza fino ai primi bevande mouse nel beccuccio per almeno 5 secondi, senza interruzioni.
      2. Percentuale di topi per gabbia che bevono la soluzione.
      3. Numero di topi che bevono simultaneamente al beccuccio.
    5. La soluzione viene considerata accettabile se la maggior parte dei topi in ogni gabbia hanno più lunga (> 5 sec) attacchi di bere e se più topi bere simultaneamente dal beccuccio (Figura 7).
    6. Se la soluzione al cioccolato non è accettabile, ripetere il test appetibilità con altri esaltatori di sapidità a varie concentrazioni per identificare una singola soluzione preferita.
    7. Offrono fino a quattro diverse soluzioni (a varie concentrazioni) uno alla voltain modo randomizzato a più gabbie di topi in un solo giorno di test, senza un periodo di washout o soluzione washout. Sapori adatti esaltatori da considerare per i topi sono zucchero, formaggio, burro di arachidi, vari gusti di frutta e noci, e latte.
      NOTA: non eseguire l'appetibilità prova più di una volta alla settimana per prevenire la disidratazione da ripetuti episodi di regolazione dell'acqua.
    8. Si può richiedere diverse settimane per identificare con successo la soluzione preferita per ogni ceppo di topi. L'obiettivo è quello di individuare i sapori candidati che si traducono in più lungo (> 5 sec) attacchi di bere dai topi immediatamente (<30 sec) dopo l'esposizione, come queste qualifiche sono ritenute essenziali per ottenere risultati VFSS successo.
  7. Dopo aver individuato una soluzione gusto preferito, tornare alla camera di osservazione di ogni gabbia a casa per continuare condizionamento comportamentale, descritto come segue.
    1. Collegare un tappo terminale alla camera di osservazione alla fine più vicino laovale (becco) foro.
    2. Offrire topi soluzione cioccolato aromatizzato da 2-3 hr inserendo bottiglia tubo di aspirazione attraverso il foro ovale nella parte superiore della camera. Questo passaggio garantisce che tutti i topi sono stati condizionati a bere in profondità all'interno della camera di osservazione.
    3. Rimuovere il coperchio del filo per accogliere la camera di osservazione.
    4. Mettere 1 cibo pellet per mouse sul pavimento della gabbia per ad libitum consumo durante il periodo di prova.
    5. Coprire la gabbia con un alto filtro standard per impedire la fuoriuscita topi per il resto del periodo di condizionamento comportamentale. Conservare il coperchio rimosso filo (contenente cibo e bottiglia di acqua) sulla parte superiore della parte superiore del filtro appesantire il coperchio.
  8. Fornire acqua e cibo ad libitum nella gabbia casa quando condizionamento comportamentale è completato.
  9. Lavare le camere di osservazione (tubi e testate) e bottiglie tubo di aspirazione (beccucci e provette) con acqua e sapone; sterilizzare in autoclave come necessario. Evitareutilizzando acetone per pulire i tubi in quanto provoca un effetto permanente opacità che rende il tubo opaca anziché traslucida.

Figura 6
Figura 6:. Mice Esplorare osservazione Chambers Mice sono naturalmente inclini a cercare riparo in piccoli spazi. Di conseguenza, essi liberamente entrare ed esplorare il tubo di osservazione quando è posto nella gabbia di casa. La maggior parte dei mouse sono trovati a dormire nella camera del mattino. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<td> Sciroppo Cioccolato
INGREDIENTI Soluzione Chocolate (per Appetibilità Testing) Al cioccolato Iohexol (per VFSS Testing)
3 ml 3 ml
Iohexol (350 mg di iodio / ml) 0 ml 15 ml
Acqua (DI o filtrata) Regolare a 30 ml di volume finale (27 ml) Regolare a 30 ml di volume finale (12 ml)
Volume finale 30 ml 30 ml

Tabella 1: Soluzione Test Preferita da C57 e C57 / SJL mouse Ceppi aromatizzato al cioccolato-.

Figura 7
Figura 7:. Appetibilità Testing Un indicatore del gusto preferenza durante la prova appetibilità è il numero di topi che bevono simultaneamente da un beccuccio in gabbia casa. Questa immagine mostra quattro topi contemporaneamente bere una soluzione al cioccolato, che è stato identificato come ilpreferito esaltatore di sapidità da ceppi C57 e C57 / SJL.

6. VFSS Test Preparation

  1. Topi soggetti a una notte periodo di regolazione dell'acqua (ad esempio, trattenere l'acqua per 12-16 ore), come descritto al punto 5.
    1. Posizionare un "tubo di ventilazione" (con una estremità chiusa da un tappo terminale) sul pavimento di una gabbia contenente casa lettiera fresca. L'estremità chiusa dovrebbe essere più vicino ai fori di ventilazione sul soffitto della camera. Questo passaggio garantisce una adeguata ventilazione, mentre più topi dormire rannicchiato all'interno della profondità della camera durante la notte. L'estremità aperta consente topi di entrare / uscire nella camera libera.
  2. La mattina seguente, rimuovere camere osservazione sporchi da gabbie e sciacquare brevemente con acqua di rubinetto e completamente asciutto, in preparazione per il test VFSS.
    1. Rimuovere e lavare esclusivamente una camera alla volta per evitare mescolando camere tra gabbie, che può causare comportamenti esplorativi eccessiveinterferire significativamente con test VFSS.
    2. Se becco "tubi" sono utilizzati al posto di "tubi di ventilazione" per test VFSS, inserire una spina di silicone nell'apertura beccuccio del soffitto della camera di osservazione per prevenire comportamenti esplorativi (Figura 8).
    3. Etichettare ogni camera (per esempio, con il numero della gabbia di casa) per evitare confusione.
      NOTA: Usare un pennarello cancellabile di etichettare ogni provetta pulita prima di reinserirlo nella gabbia di casa. Marcatore permanente deve essere evitato perché viene assorbito dal materiale del tubo e non lavare, anche con alcool o acetone.
  3. Preparare la soluzione ioexolo al cioccolato (o altra soluzione appetibile).
    1. Effettuare una singola ricetta (30 ml) della soluzione di test (Tabella 1) per diversi gabbie.
    2. PRECAUZIONI PER ioexolo: conservare le bottiglie ioexolo non aperto a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Utilizzare aperto bottiglie ioexolo entro 24hr, come la viscosità e il gusto possono variare entro un giorno o dopo l'esposizione all'aria. In alternativa, congelamento aliquote di-porzioni singole (15 ml) in provette per la conservazione a lungo termine. Le soluzioni di test preparati ioexolo devono essere utilizzati entro poche ore per garantire freschezza e prevenire l'evasione dai topi. Somministrare soluzioni ioexolo a temperatura ambiente per evitare confusione studio a causa di effetti di temperatura sulla funzione rondine. Non congelare ogni residuo soluzione di prova preparata, come il sapore del cioccolato diventa amaro con congelamento e risultati in evasione dai topi.
  4. Preparare l'ambiente fluoroscopia.
    1. Utilizzare un ricambio camera (vuoto) osservazione e peg-ciotola (o canna tubo di aspirazione) per determinare l'altezza ottimale e la posizione all'interno del fascio fluoroscopio che permette la visualizzazione di bere nel piano laterale (orizzontale).
    2. Impostare il frame rate fluoroscopia a 30 fotogrammi al secondo; superiori (ma non inferiore) frame rate possono essere usate se disponibili.
    3. ENsure che un marcatore radiopaco calibrazione è opportunamente posizionato sulla fotocamera fluoroscopio / rilevatore in modo che sia visibile sul monitor durante tutta la prova. Questo passaggio è necessario per consentire una taratura di misure di lunghezza utilizzate per la quantificazione dei parametri di rondine.

Figura 8
Figura 8:. Plug Silicone nell'utilizzo PEG-Bowls Sinistra: tappo di silicone. Destra: Una spina silicone è tirato attraverso l'apertura del tubo di aspirazione nella parte superiore della camera di osservazione. Questo plug impedisce topi di diventare distratti dall'apertura beccuccio quando si utilizza un peg-ciotola piuttosto che il tubo di aspirazione durante la prova VFSS. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

7. VFSS Prove di Mice

  1. Sollevare la camera fuori dalla gabbia e delicatamente fissare il tappo terminale 2 ° (con peg-ciotola collegata, se non verrà utilizzato un tubo di aspirazione), facendo attenzione a non schiacciare il mouse (in particolare la coda).
    NOTA: Questo approccio minimizza risposta allo stress del topo a causa di manipolazione, che è particolarmente importante per i topi che sono stati testati per la prima volta.
  2. Con ripetute prove, i topi possono essere facilmente forzati a entrare nella camera quando è posto di fronte a loro all'interno della gabbia, o quando sospeso per la coda sopra l'apertura della camera.
  • Posizionare la camera di osservazione (contenente il mouse) all'interno della macchina fluoroscopia per iniziare il test VFSS nel piano laterale (cioè, trave orizzontale X-ray).
  • Fornire la soluzione ioexolo al cioccolato (Tabella 1) via peg-ciotola o in bottiglia tubo di aspirazione.
    1. Se si utilizza un peg-bowl, Fornire la soluzione attraverso il sistema di erogazione della siringa di cui al precedente punto 3. Questo sistema consente facile e veloce riempimento del peg-ciotola come necessario.
    2. Se si utilizza un tubo di bottiglia sipper, inserire il tubo di aspirazione attraverso l'apertura ovale nella parte superiore della camera di osservazione. Inclinare la bottiglia in modo che il becco è diretta verso il centro della camera.
  • Avviare la registrazione videofluoroscopia quando il mouse comincia a bere.
    1. Regolare la posizione della camera di osservazione (utilizzando la tabella telecomandato forbice descritto al punto 4) in modo che il meccanismo di deglutizione è visibile nel campo visivo.
    2. In pausa la registrazione ogni volta che il mouse si allontana dal peg-ciotola o becco ridurre al minimo la durata dell'esposizione alle radiazioni.
    3. Riprendere la registrazione quando il mouse si ritorna alla bocca o peg-bowl.
    4. Riempire il peg-ciotola, se necessario.
    5. Stop ai Test se il mouse non beve entro 5 min. L'obiettivo è quello di registrare diversi long (> 5 sec) attacchi di abbeveratoio continuo, che è tipico per la maggior parte dei topi entro il primo 2 min di test.
    6. Ritorna topi non conforme alla gabbia di casa (senza acqua) per la ripetizione delle analisi in un secondo momento lo stesso giorno; non superare un periodo di regolazione acqua 24 ore. I topi che rimangono non conformi per tre prove vengono rimossi dallo studio.
  • Se necessario, riposizionare il fluoroscopio testare topi nel piano dorso-ventrale (cioè, trave verticale X-ray). Questo piano è utilizzato per identificare le deviazioni in bolo flusso attraverso la faringe e dell'esofago durante la deglutizione.
  • Durante il test di più i topi dalla stessa gabbia di casa:
    1. Pulire il peg-bowl (e punta del tubo PE) o il tubo di aspirazione bocca con un tovagliolo di carta asciutto tra i topi.
    2. Pulire la camera di osservazione come necessario tra topi per rimuovere eventuali ioexolo schizzato sulle pareti della camera. Sciacquare la camera con acqua corrente e asciugare con un tovagliolo di carta.
  • Durante il test i topi froma diverso gabbia di casa:
    1. Utilizzare un nuovo peg-ciotola (o modificare il tubo beccuccio di aspirazione). In caso contrario, i topi possono essere distratti dall'odore di altri topi che hanno bevuto dalla stessa peg-ciotola o il tubo di aspirazione. I PEG-ciotole e tubi sipper devono essere etichettati per evitare confusione.
  • Quando il test di tutti i topi in una singola gabbia è completato, fornire acqua e cibo nella gabbia di casa.
  • Lavare le camere di osservazione (tubi e testate), PEG-bocce, sistema di consegna siringhe e bottiglie tubo di aspirazione (beccucci e provette, se utilizzate) con acqua e sapone; sterilizzare in autoclave come necessario.
  • Smaltire qualsiasi soluzione ioexolo rimanente come indicato dalle linee guida di sicurezza; smaltimento di scarico può essere accettabile in maggior parte delle strutture.
  • 8. Analisi Video

    1. Utilizzare un software di editing video che permette l'analisi fotogramma per fotogramma delle registrazioni videofluoroscopia quantificare i parametri di rondine di interesse (tabella 2). Individuare almeno due revisori qualificati per analizzare ogni video in cieco: Un membro primario e uno o due revisori secondari.
      1. Recensore primaria: Guarda ogni video di identificare e analizzare 3-5 lunghi (circa 5 sec) bevute. Questo criterio si basa su studi rondine non radiografici pubblicati con i topi 13,14 e VFSS con ratti 12 mostrano che 3 - 5 misure per parametro rondine sono sufficienti per le analisi statistiche.
      2. Revisori secondari: Indipendentemente analizzare le 3-5 misure per parametro rondine per ogni mouse che sono stati inizialmente identificati e analizzati dal revisore principale.
    2. Identificare discrepanze utente per ogni mouse. Re-analizzare tutte le discrepanze come gruppo recensore per raggiungere il 100% di consenso.
    3. La media dei valori 3-5 di consenso (cioè, indiscussi) per ogni rondine parametro per ottenere il valore medio per ogni mouse per l'uso in analisi statistiche. Quando meno di 3 measures sono ottenuti per un parametro rondine unico per un dato del mouse, immettere un valore mancante (cioè, non zero) nella base di dati statistici per il parametro rondine corrispondente.

    PARAMETRI SWALLOW DESCRIZIONE
    Inter-Rondine Interval (ISI) Il numero di fotogrammi video tra due successivi, rondini ininterrotte. Il telaio di partenza per il calcolo ISI è la "cornice resto" che precede immediatamente il trasferimento visibile del bolo dal vallecule all'esofago. La cornice finale è la "cornice resto" del prossimo rondine. Il numero di fotogrammi tra i due rondini successivi è poi diviso per 30 fotogrammi al sec (fps) per convertire a tempo (sec).
    Jaw Escursione Rate (Lick tasso equivalente) La lingua non è chiaramentevisibile durante VFSS per consentire la quantificazione del tasso di leccare; Tuttavia, il tasso di escursione mascella è facilmente quantificabile. Durante leccare, la mandibola deve aprire per permettere la lingua per sporgere dalla bocca. Pertanto, il numero di mascella di apertura / chiusura (escursione) cicli al secondo (30 fotogrammi), mentre bere equivale a leccare rate. Ogni ciclo escursione mascella inizia con la ganascia massimo aperto (che coincide con protrusione della lingua) e termina quando la ganascia ritorna alla posizione di apertura massimo. Cicli successivi di chiusura mascella e riapertura sono contati come mascella singoli episodi di escursione.
    Jaw Escursione Distanza La distanza la mascella si apre durante i cicli di escursioni mascella, misura in mm tra il mascellare e incisivi inferiori.
    Lick-Rondine Rapporto Il numero di cicli escursione ganasce che si verificano durante ogni ISI (cioè, tra due successivi, rondini ininterrotte).
    Rondine Tasso Il numero di rondini che si verificano durante ogni episodio 2 sec di bere ininterrotto al beccuccio.
    Faringea Tempo di transito (PTT) Il tempo necessario il bolo da deglutire attraverso la faringe. Il fotogramma iniziale è identico al fotogramma iniziale ISI (cioè, il "telaio riposo" che precede immediatamente visibile trasferimento del bolo dal vallecule). La struttura finale è quando la coda del bolo ha completamente superato il 2 ° vertebra cervicale (C2), che è il più evidente riferimento anatomico della colonna vertebrale cervicale del mouse. Il numero di fotogrammi tra i fotogrammi iniziale e finale viene poi diviso per 30 fps e convertito in millisecondi (msec).
    Bolo velocità attraverso faringe Faringea velocità del bolo è misurata rispetto al PTT (sopra descritto). Utilizzando il software ImageJ, la distanza (mm) dal vallecule alla vertebra C2 viene misurata, scalato utilizzando un marcatore calibrazione. Questo distance (mm) viene quindi divisa per PTT (msec) per determinare la velocità di bolo (mm / msec).
    Esofagea Tempo di transito (ETT) Il telaio inizio ETT è identico al telaio fine PTT (sopra descritto). Il telaio end ETT è quando il bolo è inserito completamente lo stomaco, che è definita come la scomparsa del bolo dall'esofago. Il numero di fotogrammi tra i ETT inizio e di fine frame viene diviso per 30 fps e convertito in msec.
    Bolo velocità attraverso Esofago Velocità bolo esofageo è misurata rispetto al ETT (sopra descritto). Utilizzando il software ImageJ, la distanza (mm) misurato è dalla vertebra C2 alla giunzione gastroesofagea, scalato con pennarello calibrazione. Tale distanza (mm) viene quindi divisa per ETT (msec) per determinare la velocità di bolo (mm / msec).
    Bolo velocità attraverso faringe e dell'esofago Questo parametro viene utilizzato quando C2 non è un punto di riferimento anatomico ben visibile; quindi,non è possibile distinguere tra la faringe e dell'esofago fasi della deglutizione. In tali casi, la velocità di bolo attraverso la faringe e la laringe è combinato in un unico parametro rondine. Il fotogramma iniziale è identico al fotogramma iniziale PTT (cioè, il "telaio riposo" che precede immediatamente visibile trasferimento del bolo dal vallecule). La struttura finale è identica alla struttura fine ETT (cioè, quando il bolo è completamente inserito stomaco). Il numero di fotogrammi tra i due eventi è diviso da 30 fps e convertito in msec.
    Bolo Area Utilizzando il software ImageJ, zona del bolo è valutato al vallecula "frame riposo" prima di iniziare la faringe rondine, scalato con un pennarello di calibrazione.
    Faringea Residue Area Faringea zona residuo viene misurata utilizzando il software ImageJ, scalato con un pennarello di calibrazione.
    Volume di Consu Liquidmed Il volume di liquido consumato da una bottiglia tubo sipper è difficile stimare a causa di perdite dal beccuccio. Tuttavia, il volume di liquido consumato da un piolo-ciotola può essere calcolato più precisamente come segue: 1) determinare la densità (cioè, il rapporto peso a volume) del volume di liquido calibrato che è stato somministrato nel peg-ciotola, 2 ) determinare il peso del peg-ciotola contenente il liquido residuo, 3) inserire questi valori in peso convertitore volume (per esempio, http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php .

    Tabella 2: Swallow parametri quantificabili Durante Murine VFSS.

    Representative Results

    Abbiamo progettato con successo un romanzo e replicabile protocollo VFSS specifici murino che include camere di prova che permettono di auto-alimentazione, ricette per aromatizzanti agenti di contrasto per via orale, e un protocollo di step-by-step test che consente di quantificare rondine fisiologia. La capacità di livello di energia del sistema di fluoroscopia determinato che ingoiare parametri potrebbero essere studiate in topi. Inizialmente abbiamo usato fluoroscopes alta energia progettati per essere utilizzati con le persone e gli animali più grandi (ad esempio, GE Advantx, GE OEC 9600, e Omega Cardiac Cath CS-25, ciascuna a 30 fotogrammi al secondo). Tuttavia, questi sistemi hanno avuto capacità di ingrandimento insufficienti per i topi di prova, che ha portato il riempimento animali solo una piccola porzione del campo visivo (Figura 9). Come risultato, la qualità dell'immagine era eccezionalmente scarsa, rendendo impossibile visualizzare maggior parte delle strutture del meccanismo di deglutizione. Nonostante questa limitazione, abbiamo identificato 7 obiettivo VFSS rondine parametri che sono stati costantemente quantificabili per i topi quando si utilizza un convenzionale (cioè, alta energia) fluoroscopio in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino (Tabella 3). Inoltre, abbiamo identificato lo spazio vallecula come punto di trigger anatomica per la deglutizione in topi adulti sani (3-17 mesi di età), così come i topi con le condizioni di età avanzata (> 18 mesi) e SLA allo stadio terminale.

    Figura 9
    Figura 9:. High Energy fluoroscopia Sistemi Sinistra: immagine Rappresentante di un mouse ottenuto con alta energia (ad esempio, i sistemi convenzionali) fluoroscopia. Si noti che il mouse riempie solo una piccola porzione del campo di vista fluoroscopia, dimostrando così la capacità di ingrandimento insufficiente fluoroscopes convenzionali per roditori imaging. Destra: Stessa immagine ingrandita post-capture utilizzando un programma software di editing video. Freccia nera: ingoiare punto di trigger (vallecule). Freccia bianca:. Bolo nell'esofago distale, immediatamente prima di passare attraverso la giunzione GE (asterisco bianco) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    PARAMETRI SWALLOW Alta Energy System Low Energy System
    Inter-Rondine Interval (ISI) X X
    Jaw Escursione Rate (Lick tasso equivalente) X X
    Jaw Escursione Distanza X X
    Lick-Rondine Rapporto X X
    Rondine Tasso X X
    PharyngEAL Tempo di transito (PTT) X
    Bolo velocità attraverso faringe X
    Esofagea Tempo di transito (ETT) X
    Bolo velocità attraverso Esofago X
    Bolo velocità attraverso faringe e dell'esofago X X
    Bolo Area X
    Faringea Residue Area X
    Volume di liquido Consumed X X

    Tabella 3: Rondine parametri quantificabili Utilizzando alta Versus Low Energy fluoroscopia Systems.

    Recentemente abbiamo ottenuto un sistema di fluoroscopia basso ingrandimento energetico chiamato The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) che è stato specificamente progettato per il nostro laboratorio per l'uso contopi e altri piccoli roditori (Figura 10). Tuttavia, i marcatamente maggiori livelli di ingrandimento di questo sistema reso impossibile vedere l'intero meccanismo deglutizione di un topo in un unico campo di vista. Invece, due posizioni di prova sono richiesti, come mostrato in Figura 11. Posizione 1 consente la visualizzazione dell'intera testa e prossimale regione toracica. Questa posizione è necessaria per valutare le fasi orale e faringea della deglutizione. Posizione 2 consente la visualizzazione dal punto di innesco rondine (cioè, vallecule) alla gastroesofageo (GE) giunzione. Questa posizione è necessaria per valutare la fase esofagea della deglutizione. Operazioni preliminari con il LabScope in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino ha identificato 13 parametri rondine oggettivi che sono costantemente quantificabile nei topi, che è quasi il doppio del numero ottenuto con alta energia (ad esempio, convenzionali) fluoroscopes (Tabella 3). Questo o E SITO è attribuita alle capacità avanzate di ingrandimento Il LabScope, che consente la visualizzazione di numerose strutture anatomiche (Figura 12) che erano in sostanza invisibile quando si usano sistemi convenzionali: ad esempio, l'osso ioide, trachea, e vertebre cervicali. Come risultato, siamo anche stati in grado di analizzare i video delle prove di penetrazione laringea e aspirazione. Né penetrazione né aspirazione è stato osservato per qualsiasi mouse in questo studio, indipendentemente dalle condizioni di salute o di malattia.

    Figura 10
    Figura 10:. Il LabScope sinistra: Il LabScope esibisce come fluoroscopio desktop per piccoli animali. Destra: Vista del primo piano di The LabScope con componenti etichettati. La tabella forbice sta posizionando una camera di osservazione all'interno del campo fluoroscopio visivo. tp_upload / 52319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 11
    Figura 11:. Low Energy fluoroscopia sistema Immagini di un topo ottenuta utilizzando un sistema di bassa fluoroscopia energetico. Si noti che la capacità alto ingrandimento impedisce visualizzazione dell'intero meccanismo rondine all'interno del campo di vista fluoroscopia. A sinistra: Posizione 1 - consente di visualizzare l'intera testa e prossimale regione toracica. Il punto di innesco rondine (freccia nera) è essenzialmente centrato all'interno del campo visivo. Destra: Posizione 2 - permette la visualizzazione dal punto di innesco rondine (freccia nera) fino al bivio di GE (asterisco bianco). Nota il bolo passa attraverso l'esofago distale (freccia bianca). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 12
    Figura 12:. Usando strutture anatomiche visibile una fluoroscopia sistema energetico a basse anche con l'impostazione di ingrandimento più basso (a sinistra), strutture ossee della testa e del collo di un mouse sono facilmente visibili utilizzando il nostro sistema di bassa fluoroscopia energia (cioè, il LabScope). Strutture anatomiche all'interno del quadrato nero sono mostrati (ed etichettati) a più alto ingrandimento per la destra. Migliorata la visualizzazione delle strutture ossee consente la quantificazione di alcuni parametri aggiuntivi rondine che erano impossibili da analizzare con fluoroscopes alta energia. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    t "> Rondine rate e l'intervallo tra rondine sono parametri VFSS rappresentativi che possono essere quantificate con sistema basse o alte fluoroscopia energia in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino Questi due parametri di rondine sono stati quantificati per tre gruppi di topi:. SOD1-G93A (SOD1) topi transgenici (cioè, un modello di SLA) in stadio terminale della malattia tra i 4-5 mesi di età, di età compresa tra i topi C57 (18-24 mesi di età), e un gruppo di controllo di soggetti sani giovani (4-8 mesi di età) topi C57 e fratellini nontransgenic dalla colonia SOD1. Tutti i dati si riferiscono a becco solo bere, utilizzando un sistema a bassa o ad alta energia fluoroscopia. Non sono state riscontrate differenze significative tra i giovani topi C57 e giovane nontransgenic (controllo) i topi dalla SOD1 colonia rispetto a questi due parametri, rondine. Pertanto, i dati sono stati combinati in un gruppo generale di "controllo" di giovani topi sani per il confronto con età compresa tra i topi C57 e topi SOD1 stadio terminale Rondine rate (ad esempio,il numero di rondini per 2 secondi consecutivi di bere ininterrotto) è stata significativamente più lenta per i topi SOD1 rispetto ai topi di età e controlli C57. Intervallo Inter-rondine (cioè il tempo che intercorre tra due rondini successivi) non era significativamente differente tra i due gruppi. Questi risultati supportano l'idea che i profili disfagia sono suscettibili di essere nettamente diverso per ogni condizione di malattia (Figura 13).

    Figura 13
    Figura 13:. I risultati preliminari Questa figura mostra i risultati preliminari rappresentativi per due parametri di rondine VFSS quantificati utilizzando il protocollo VFSS murino: ingoiare rate (a sinistra) e l'intervallo inter-rondine (a destra). Rondine tasso era significativamente più lenta per i topi SOD1 rispetto ai topi di età e controlli C57. Non significative differenze di gruppo sono stati identificati per inter-rondine traval. Le linee nella parte superiore delle barre indicano differenze statisticamente significative (p <0.05) tra i gruppi, identificati utilizzando Bonferroni confronti a coppie. Barre di errore rappresentano ± 1 SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Discussion

    Centinaia di modelli murini (topi e ratti) sono disponibili in commercio per lo studio delle malattie umane. Tuttavia, solo tre modelli di malattia murini sono stati specificamente studiati rispetto a disfagia: un modello murino di SLA 13,14 e ratto modelli di Parkinson malattia 12,15-17 e ictus 18. Ciascuno di questi studi preliminari utilizzati metodologie diverse per valutare disfagia, rendendo impossibile derivare confronti significativi tra le specie e le malattie. Questo importante limitazione può essere superata in studi futuri utilizzando il protocollo VFSS murino di nuova concezione che consente la quantificazione oggettiva dei numerosi parametri di rondine in animali auto-alimentazione.

    Risultati VFSS di successo dipendono tre componenti critici: 1) camere di prova che permettono di auto-alimentazione, mentre in piedi sfrenato in uno spazio ristretto, 2) ricette che mascherano la avversiva gusto / odore di disponibile in commercio contrasto ag oraleents, e 3) un protocollo passo-passo test che consente di quantificare rondine fisiologia. L'effetto combinato produce un comodo basso stress, ambiente esame, auto-alimentazione che evoca l'alimentazione tipica e comportamenti deglutizione. Eliminazione di uno o più di questi componenti avranno un impatto negativo sui risultati dello studio. Esempi di esiti negativi comprendono incapacità di mantenere gli animali nel campo fluoroscopia di vista, comportamenti indesiderati che distraggono da bere, l'avversione per il mezzo di contrasto per via orale, e l'incapacità di quantificare i parametri di rondine a causa di episodi di bere insufficienti.

    Una sfida importante per ottenere risultati ottimali VFSS stava progettando una camera di prova adeguato. Numerose revisioni della nostra progettazione del prototipo culminarono in una camera di osservazione che mantiene sufficientemente topi nel campo visivo e previene comportamenti che distraggono dal bere. Le camere sono state effettuate utilizzando frese per ottenere dimensioni uniformi di thtubi elettronici e testate, garantendo così intercambiabilità di componenti per diverse camere osservazione dello stesso diametro. Le dimensioni interne (diametro e lunghezza) sono stati abbinati per essere leggermente più grande del formato il corpo di un topo adulto, che ha portato in una camera di prova stretta che consente sufficiente camminare in linea retta e girando intorno. Il disegno stretto, in combinazione con il posizionamento strategico del beccuccio e peg-ciotola a soli fine, mantiene la testa e il corpo di topi allineati lungo la lunghezza della camera bevendo. Una volta impegnati nel bere, topi rimangono notevolmente auto-stabilizzata al beccuccio o ciotola per alcuni secondi alla volta, con conseguente minima circolazione artefatto di interferire con i test. Così, è possibile ottenere falsata, primo piano osservazione registrazione / video e immagini videofluoroscopia di topi bevendo nei piani laterali e dorsale-ventrale.

    Mice (e altri piccoli roditori) sono naturalmente inclini a vederek riparo in piccoli spazi. Come risultato, essi liberamente entrano nella camera di prova (con un'estremità già chiuso da un tappo terminale) quando è posto nella gabbia casa, eliminando così lo stress / ansia causata da manipolazione (cioè, raccogliendo manualmente l'animale di immissione nella camera). Una volta che il mouse entra nella camera, l'altra estremità è chiusa attaccando un fondello 2 nd. Questo design impedisce fuga durante la creazione di un basso camera di prova ansia per i topi di esplorare liberamente.

    La forma quadrata della camera fornisce incorporato stabilità di movimento che consente di essere utilizzato in modo autoportante, eliminando così la necessità di test all'interno di una gabbia roditori standard. L'intero apparato è leggero, portatile, impilabile per fini di stoccaggio, robusti, facili da pulire, e può essere sterilizzato in autoclave. Mentre le camere sono stati inizialmente progettati per l'utilizzo con fluoroscopia, essi sono anche compatibili con spot-film di radiografia, neuroimaging (ad esempio, la risonanza magnetica, PET, CT), e Visual osservazione / registrazione video di vari comportamenti.

    Una seconda sfida da superare è mascherare il avversiva gusto / odore di agenti di contrasto per via orale (ad esempio, solfato di bario e ioexolo). Dato che la sensibilità gusto varia ampiamente tra ceppi di topi 19-21 e forse con 22,23 età, era necessario individuare una soluzione di prova singola che era accettabile per tutti i topi, indipendentemente ceppo ed età. Questo risultato è essenziale per consentire il confronto diretto dei funzione rondine / disfunzione di tutti i ceppi ed età, eliminando risultati confondenti dovuti a differenze reologiche (ad esempio, viscosità, densità, ecc) e le proprietà chimiche delle soluzioni di prova. A questo scopo, abbiamo sviluppato un rapido appetibilità semplice approccio di screening per identificare l'esaltatore di sapidità preferito per mascherare il gusto avversivo / odore di mezzi di contrasto per via orale nel VFSS murino. I metodi sono stati modellati dopo la breve prova di esposizione, che richiede una manoometer (cioè, sensore leccare) per registrare i tassi di leccare durante i primi 2 minuti dopo un periodo di regolazione dell'acqua (ad esempio, ritenuta acqua durante la notte) per indurre la sete 24,25. Un lickometer non era disponibile per questo studio; Pertanto, la preferenza è stata valutata da osservazioni comportamentali, così come i metodi di registrazione video standard per tasso leccare precedentemente validati nel nostro laboratorio 13,14. Usando questo approccio di screening appetibilità, il cioccolato è stato identificato come l'esaltatore di sapidità preferito da ceppi C57 e C57 / SJL. In particolare, il 100% dei topi in ogni gabbia facilmente bevve soluzioni cioccolato aromatizzato entro 30 secondi di esposizione, con più topi simultaneamente bere al beccuccio. Tuttavia, l'aggiunta di bario provocato solo bevute brevi dalla maggior topi, indipendentemente bario o di concentrazione cioccolato.

    Un'alternativa è di bario ioexolo, un agente di contrasto a base di iodio che solo recentemente riconosciuta come suitavolo alternativa al solfato di bario per VFSS umano 10; pertanto, non è ancora stata standardizzata per questo scopo. Diverse concentrazioni diverse di ioexolo al cioccolato sono stati offerti per topi. Ricette contenenti fino a una soluzione al 50% del capitale ioexolo (350 mg di iodio per ml) sono stati prontamente bevevano dalla maggior parte dei topi dopo una notte periodo di regolazione dell'acqua. Concentrazioni più elevate portato a comportamenti di evitamento. Un ioexolo 50% (350 mg di iodio per ml) soluzione prodotta radiodensity sufficiente mentre viene inghiottito dai topi, mentre le concentrazioni inferiori erano nettamente meno visibile e ostacolato la quantificazione di rondine fisiologia. Pertanto, la soluzione di test ottimale per VFSS con topi è stato identificato come una soluzione ioexolo 50% con sapore di cioccolato aggiunto. Test appetibilità ripetuta non ha determinato comportamenti di evitamento o eventi avversi.

    Una terza sfida per superare impediva topi di girare / inclinare la testa mentre si beve, che oscura la visualizzazionedel meccanismo di deglutizione durante VFSS. Bere da un piolo-ciotola posizionata appena sopra il pavimento ad una estremità della camera risolto questo problema. Ci sono diversi vantaggi aggiuntivi di un piolo-ciotola invece di una bottiglia tubo aspirazione. Ad esempio, un volume calibrata di liquido può essere pipettato nel peg-ciotola attraverso un foro di ventilazione nel tappo terminale del tubo di osservazione. Questo approccio consente di quantificare il volume minuto di soluzione di prova consumata durante la breve durata della prova VFSS. Inoltre, l'aumento della superficie della soluzione in esame nel peg-ciotola, a fronte di una piccola apertura del tubo di aspirazione, può offrire una maggiore stimolazione olfattiva per motivare ulteriormente bere. PEG-ciotole può essere più adatto per lo studio giovani o più piccoli topi deformazione, come l'altezza ciotola è una distanza standardizzata dal pavimento. Al contrario, le lunghezze dei tubi sipper devono essere regolati per topi di dimensioni diverse, che aggiunge un'altra variabile potenzialmente confusione da considerare. Inoltre, la modalità del mousels di malattie neurologiche possono avere difficoltà a raggiungere una bottiglia tubo sipper grazie al motore compromissione degli arti, mentre si può facilmente raggiungere una ciotola piolo. I topi con la lingua e / o disfunzione della mascella potrebbe non essere in grado di premere adeguatamente la palla in bocca per accedere al liquido; con PEG-ciotole in grado di eliminare questo confound. Per questi motivi, l'uso di PEG-bocce su bottiglie tubo sipper è il metodo preferito di test VFSS murino. Tuttavia, le camere di osservazione sono stati progettati per ospitare beccuccio bere come necessario. Un avvertimento importante da considerare è che i tassi di leccare sono noti per differire da beccuccio e ciotola bere 13,26. Pertanto, la scelta di beccuccio o peg-ciotola per VFSS deve essere coerente all'interno e tra esperimenti.

    Una quarta sfida era quella di identificare i parametri di rondine quantificabili per i topi che sono paragonabili ai parametri VFSS comunemente utilizzati negli studi di ricerca umana e la pratica clinica. I nostri risultati preliminari hanno mostrato latipo di sistema di fluoroscopia determina quali ingoiare parametri possono essere studiati in topi. La maggior parte dei centri di ricerca e strutture mediche hanno alta energia (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopes progettato per l'uso con le persone e gli animali più grandi, che si traducono in eccezionalmente scarsa qualità delle immagini durante il test topi e altri piccoli animali. A titolo di esempio, un recente studio con un fluoroscopio alta energia con i ratti è stato in grado di identificare solo 4 parametri quantificabili rondine 12, e siamo stati in grado di identificare solo 7 parametri di rondine per topi in questo studio. Per superare questa limitazione importante, abbiamo recentemente ottenuto un sistema di bassa fluoroscopia energetico chiamato The LabScope (Glenbrook Technologies). Il sistema è un fluoroscopio miniatura che genera una continua cono-fascio di raggi X con energie fotoni tra 15 e 40 kV e corrente del tubo di picco di 0,2 mA (8 W potenza massima). I livelli di energia inferiore di tale sistema sono meglio attenuati dall'osso sottile e tessuti molli di topi e quindi forniscono higherisoluzione di contrasto r rispetto ai convenzionali (cioè ad alta energia) fluoroscopes. Il fascio di raggi X di The LabScope è diretto a 5 cm brillanza diametro, che è notevolmente più piccolo del 15-57 cm di diametro intensificatore di immagine fluoroscopes convenzionali. La distanza minima source-to-intensificatore (SID) di The LabScope è ~ 6 cm (a differenza di ~ 30 cm per fluoroscopes convenzionali), che offre una maggiore capacità di ingrandimento. Inoltre, The LabScope utilizza la tecnologia brevettata che ingrandisce digitalmente l'immagine fino a 40 volte in tempo reale, senza alterare il SID. Il risultato è in sostanza un microscopio a raggi X che può ingrandire e in tempo reale per visualizzare piccole regioni di interesse, come il meccanismo di deglutizione di un mouse.

    Un importante vantaggio di questo sistema di fluoroscopia a bassa energia viene migliorata la sicurezza radiazioni. Oltre agli animali trattati con dosi di radiazioni inferiore con il LabScope, ricercatori utilizzando il sistema sono esposti a significativamente less dispersione di radiazioni. L'esposizione a radiazioni direttamente davanti dell'unità sul pannello di controllo è 10,3 mR / hr. Ad una distanza di 1 m davanti dell'unità, l'esposizione scende a 580 μR / hr. La maggior parte delle altre posizioni nella stanza hanno molto bassa esposizione al di sotto del 10 μR / hr. Nonostante questo miglioramento, abbiamo preso misure supplementari per migliorare la protezione dalle radiazioni. Ad esempio, piombo schermatura acrilico è stato aggiunto intorno Il LabScope di bloccare fotoni sparsi raggi X, che consente ai ricercatori di condurre test VFSS murino senza indossare schermatura personale (ad esempio, grembiuli di piombo, scudi della tiroide, e bicchieri). Inoltre, l'acrilico permette la visualizzazione del mouse a distanza. Ulteriore protezione dalle radiazioni è provvisto da un tavolo a forbice motorizzato, che è controllato a distanza dallo sperimentatore. Da una distanza fino a 3 m dal fluoroscopio, i ricercatori possono utilizzare il dispositivo telecomandato per regolare la posizione verticale e orizzontale della camera di osservazione all'interno bea X-raym. Di conseguenza, le regioni anatomiche di interesse possono essere mantenuti all'interno del campo di vista fluoroscopia mentre il mouse si muove liberamente all'interno della camera di osservazione. Anche se la forbice è stato progettato per l'utilizzo con la LabScope, è anche compatibile per l'utilizzo con fluoroscopes convenzionali per migliorare la sicurezza di radiazione per i ricercatori. Un passo finale per migliorare la sicurezza radiazioni durante murino VFSS comporta l'uso di un sistema di erogazione siringa per liquidi. Questo sistema comprende un piede 3-4 (o più, se necessario) pezzo di tubo PE, che consente la consegna veloce ed efficiente di liquidi nel peg-ciotola a distanza. Questo sistema di erogazione siringa per liquidi, in combinazione con le camere di osservazione, può anche essere utilizzato con fluoroscopes convenzionali.

    Il lavoro preliminare usando LabScope, in combinazione con il nuovo protocollo VFSS murino, dimostra un importante vantaggio rispetto ai sistemi tradizionali: il numero di parametri rondine che può essere quantificato attendibilmente is quasi raddoppiato. Tuttavia, le strutture dei tessuti molli del meccanismo di deglutizione (ad esempio, lingua, velo, parete faringea posteriore e epiglottide) di topi non sono facilmente visibili quando si utilizzano sistemi di fluoroscopia a bassa o ad alta energia. Pertanto, ci siamo concentrati sulla quantificazione misure di flusso in bolo, piuttosto che la biomeccanica di deglutizione. Eravamo principalmente interessati a parametri che potrebbero essere quantificati sulla base di unità di tempo, zona, distanza, volume, ecc, invece di usare misure Likert-tipo di scala. Numerosi parametri di flusso bolo soddisfino questa condizione sono stati descritti in letteratura VFSS umana, come il tempo di transito 27-29 orale, faringea tempo di transito 27-33, e il tempo di transito esofageo 34-36, per citarne alcuni. Trasporto bolo attraverso la cavità orale non era facilmente visibile nei topi, probabilmente a causa delle ridotte dimensioni del bolo durante potabile spontanea. Tuttavia, siamo stati in grado di quantificare in modo affidabile faringei e di transito esofageo volte, come purecome diverse altre misure relative al flusso di bolo e spazio. Individuazione di ulteriori parametri di traslazione di rondine è atteso come ottimizziamo le capacità del LabScope.

    I risultati di questo studio hanno mostrato che i topi prendono diversi fraseggi ritmici per rondine durante bere spontaneo, con ogni piccola sequenza bolo liquido riempiendo lo spazio vallecula prima di far scattare la rondine faringeo. Questo comportamento, che è tipico per i mammiferi che usano leccare come mezzo principale di ingestione di liquido 37-40, assomiglia al modello ritmico suck-sorso di deglutizione infantile umana e di tutti i mammiferi neonati in generale. Infant deglutizione la fisiologia è caratterizzata da diversi ritmica succhia seguita da una faringeo rondine riflessiva, comunemente descritta come il ciclo di succhiare-rondine 37,41-43. Così, i movimenti della lingua e della mandibola ritmici coinvolti nei comportamenti Ingestive leccate di topi possono essere più paragonabile a Ingestive succhiare comportamenti di ronzioun infanti anziché coppa per bambini e adulti. Abbiamo quindi quantificare il tasso di leccare e leccare-rondine rapporto di topi per i confronti futuri con il rapporto di succhiare tasso e succhiare-sorso di neonati umani. Forse la ricerca VFSS murino fornirà spaccato disturbi della deglutizione sviluppo.

    Come con qualsiasi nuovo metodo di ricerca, sono state individuate le aree di miglioramento. Ad esempio, il protocollo VFSS murino è stato sviluppato utilizzando solo C57 e C57 / topo SJL ceppi; non è stato ancora testato con ratti. Le camere di osservazione dovranno essere scalato in dimensioni (diametro e lunghezza) per accogliere la dimensione del corpo più grande di ratti. Inoltre, non è noto se ioexolo cioccolato aromatizzato è adatto come soluzione campione VFSS murino universale. Pertanto, maggiore scala test con più ceppi di topi e ratti è garantito per questo scopo. Inoltre, l'uso di bario come agente di contrasto per murino VFSS non dovrebbe essere esclusa. Mice chiaramente preferito la iohexol ricette oltre bario; tuttavia più rigorosi e sistematici tentativi di mascherare la avversiva gusto / odore di bario possono fornire alternative appetibile per ioexolo. Futuri studi che confrontano gli effetti di solfato ioexolo e bario (così come altri potenziali agenti di contrasto per via orale) sul gusto preferenza e ingoiare la fisiologia in topi e ratti sarebbe senza dubbio fornire informazioni importanti che è direttamente rilevante e traslazionale per VFSS umana.

    VFSS con gli esseri umani comprende diverse consistenze di cibi e liquidi, e la disfagia è più evidente quando la deglutizione dei liquidi sottili e asciutti, cibi solidi 44,45. Il protocollo VFSS murino è quindi ampliata per includere consistenze supplementari che possono facilitare il rilevamento e la quantificazione di disfagia in modelli di malattia. Inoltre sarà necessario condurre test di viscosità delle ricette liquidi per VFSS murino al fine di adeguare le viscosità per adeguarli a quelli utilizzati durante VFSS umana. Affrontare questi limitezioni faciliteranno l'identificazione di biomarcatori VFSS traslazionale di disfagia che possono essere comparati direttamente tra topi, ratti e gli esseri umani.

    L'utilità di VFSS murino può essere significativamente migliorata mediante l'impianto di marker radiopachi in strutture dei tessuti molli del meccanismo di deglutizione che altrimenti non visibili, permettendo così le indagini dei biomeccanica di deglutizione. Questo approccio è stato utilizzato con successo per molti anni a studiare la biomeccanica della deglutizione nei suini infantili, con un assortimento di clip metalliche e fili 37,42. Ci aspettiamo che l'uso di marcatori simili, ma più piccoli, nei topi permetterebbe quantificazione dei vari parametri aggiuntivi di rondine per il confronto con i grandi mammiferi, compreso l'uomo. Attualmente stiamo sviluppando una metodologia per l'impianto di marker radiopachi nella lingua, palato molle, faringe, laringe, esofago e prossimale di topi per verificare questa ipotesi.

    Il video Recording frame rate di The fluoroscopes LabScope e convenzionali è limitata a 30 fotogrammi al secondo (fps). Tuttavia, i nostri risultati preliminari hanno mostrato che l'intera fase faringea della deglutizione per topi sani si verifica in meno di 66 msec (cioè, 2 fotogrammi), che è circa 10 volte più veloce di esseri umani. Pertanto, la fase faringea della deglutizione in topi avviene così rapidamente che i dettagli non sono apprezzabili con una fotocamera 30 fps. Un frame rate più elevato (probabilmente> 100 fps) sarà necessario per visualizzare e quantificare i movimenti estremamente rapidi e complessi della fase faringea della deglutizione in topi e altri roditori sufficientemente. In combinazione con un frame rate più elevato, che incorpora la tecnologia biplanare per l'imaging 3D fluoroscopico certamente espandere il murino utility VFSS. Pertanto, considerazioni progettuali futuri dovrebbero includere una più elevata fotocamera frame rate e capacità di imaging biplanare.

    Infine, basse dosi di radiazioni ha dimostrato di causare sterilitàtopi C57 femminili, con conseguenti livelli alterati di ormoni ovarici stimolata che potrebbero confondere gli studi di durata della vita 46. I risultati relativi in ​​particolare agli effetti delle radiazioni a basse dosi ripetuta associata a test VFSS non sono ancora state studiate nei topi, altri animali o esseri umani. Tuttavia, la disfunzione ovarica (non legati all'esposizione alle radiazioni) in femmine umane è stato collegato a disturbi della motilità gastrointestinale, e in particolare disfagia in alcuni casi 47, che fornisce un ulteriore avvertimento da considerare quando si progetta studi VFSS futuri che includono femmine (gli animali e gli esseri umani ). Esclusione delle femmine deve essere evitato, in quanto significative differenze di genere in funzione rondine sono stati riportati per le persone 48,49 e sarebbe importante individuare e caratterizzare in modelli di malattia animali pure. Pertanto, i risultati degli studi VFSS longitudinali su topi e ratti di entrambi i sessi hanno un potenziale enorme traslazionale per gli esseri umani relativi a dysphagia, nonché ai rischi di esposizione alle radiazioni a basso dosaggio associati a test VFSS ripetizione.

    Disclosures

    Open Access per questo articolo è sponsorizzato da Glenbrook.

    Acknowledgments

    Abbiamo gentilmente Ringraziamo i membri aggiuntivi del Lever Lab che hanno contribuito alla raccolta dei dati (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce, e Matan Kadosh) e revisione del manoscritto (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, e Kate Robbins). Riconosciamo inoltre Roderic Schlotzhauer e Edwin Honse dal MU Fisica Machine Shop per il loro contributo la progettazione e la fabbricazione di tubi di osservazione roditori utilizzati in questo studio. Siamo particolarmente riconoscenti Malea Jan Kunkel (Radiologia Supervisor in Medicina Veterinaria e Chirurgia Dipartimento presso l'Università del Missouri - College di Medicina Veterinaria) e Jan Ivey (Responsabile del Animal Research Cath Lab dell'Università del Missouri - Facoltà di Medicina) per dimostrare la pazienza costante e motivazione durante il funzionamento i fluoroscopes ad alta energia, come abbiamo sviluppato il protocollo VFSS murino. Fonti di finanziamento per questo studio includeva NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / NINDS (GK Pavlath), Otolaryngofondi Head and Neck Surgery start-up (TE leva), MU PRIME Fondo (TE Lever), Mizzou Advantage (TE Lever), e il Centro di MU on Aging (TE Lever) - logia.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Polycarbonate tubing for observation chambers McMaster-Carr 3161T41 Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall
    Polycarbonate sheet  for observation chambers McMaster-Carr 9115K71 End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4"
    Polycarbonate sheet  for observation chambers McMaster-Carr 8574K281 Peg-bowls for observation tubes
    Silicone O-rings  for end-caps of observation chambers McMaster-Carr 9396K108 S1138 AS568-029, pack of 25
    http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r 
    Silicone stoppers for observation chambers McMaster-Carr 2903K22 Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl
    http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
    Centrifuge tubes for sipper tube bottles Evergreen Scientific 222-3530-G80 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile
    https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ 
    Silcone stoppers for sipper tube bottles Saint-Gobain Performance Plastics DX263031-10  Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; 
    http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
    Stopper borers for sipper tube bottles Thomas Scientific 3276G40 Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch 
    http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
    Drinking tubes for sipper tube bottles Ancare TD-100  2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout
    http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point 
    Iohexol for making oral contrast agent solution GE Healthcare 350 mg iodine per ml
    http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque 
    Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent Herseys
    10 ml syringe for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 309604 Luer lock tip syringe without needle, 100 per box
    http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
    Catheter tubing for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 427451 Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100'
    http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp 
    Needle for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 427560 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing
    http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp 
    Delrin acetal resin rod for syringe delivery system McMaster-Carr 8576K15 1/2 inch diameter, black
    http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf 
    Acrylic sheeting for scissor lift Ponoko Laser cut
    http://www.ponoko.com 
    3D printed ABS frame Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
    Brass rods for scissor lift Amazon TTRB-03-12-03 made into axles
    http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
    Drawer slide for scissor lift Richelieu 10292G116 Attaches to base of scissor lift
    http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
    28BYJ-48 stepper motor for scissor lift 2 each
    ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift Toshiba ULN2003APG Used as stepper drivers (2 each)
    ATTINY85 microcontroller for scissor lift Atmel ATTINY85-20PU 2 each
    http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
    Nylon spur gear McMaster-Carr 57655K34 2 each
    http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
    Nylon spur gear rack McMaster-Carr 57655K62 2 each
    http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
    4-40 nylon machine screws McMaster-Carr 95133A315 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
    4-40 nylon hex nuts McMaster-Carr 94812A200 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
    Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 McMaster-Carr 9452K318 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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