Anpassung Menschen Videofluoroscopic Swallow Studienmethoden nachgewiesen und charakterisiert Dysphagie in Murine Krankheitsmodelle

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Diese Studie menschlichen videofluoroscopic Schlucken Studie (VFSS) Methoden zur Verwendung mit murinen Krankheitsmodellen zwecks Translations Dysphagie Forschung erleichtern erfolgreich angepasst.

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Lever, T. E., Braun, S. M., Brooks, R. T., Harris, R. A., Littrell, L. L., Neff, R. M., Hinkel, C. J., Allen, M. J., Ulsas, M. A. Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models. J. Vis. Exp. (97), e52319, doi:10.3791/52319 (2015).

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Abstract

Diese Studie angepaßt menschlichen videofluoroscopic Schlucken Studie (VFSS) Methoden zur Verwendung mit murinen Krankheitsmodellen zwecks Translations Dysphagie Forschung erleichtern. Erfolgreiche Ergebnisse sind abhängig von drei wichtigen Komponenten: Testkammern, die Selbst-Fütterung zulassen, während er ungebremst in einem geschlossenen Raum, Rezepte, die den unangenehmen Geschmack / Geruch von im Handel erhältlichen oralen Kontrastmittel zu maskieren, und eine Schritt-für-Schritt-Test-Protokoll, ermöglicht die Quantifizierung von Schwalbe Physiologie. Eliminierung von einem oder mehreren dieser Komponenten eine nachteilige Wirkung auf die Ergebnisse der Studie. Darüber hinaus wird das Energieniveau Fähigkeit des Durchleuchtungssystem bestimmen, welche schlucken Parameter untersucht werden können. Die meisten Forschungszentren haben eine hohe Energie Fluoroskope für die Verwendung mit Menschen und größere Tiere, die in außergewöhnlich schlechten Bildqualität führt bei der Prüfung von Mäusen und anderen kleinen Nagetieren konzipiert. Trotz dieser Einschränkung haben wir sieben VFS identifiziertenS Parameter, die bei Mäusen konsistent quantifizierbar sind bei der Verwendung eines Hochenergie-Röntgenapparat in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll. Wir haben vor kurzem erhalten einen niedrigen Energiedurchleuchtungssystem mit Bildauflösung und Vergrößerung-Fähigkeiten außergewöhnlich hoch, die für den Gebrauch mit Mäusen und anderen kleinen Nagetieren konzipiert wurde. Vorarbeiten mit diesem neuen System, in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll hat 13 Schwalbe Parameter, die bei Mäusen konsequent quantifizierbar sind, die fast doppelt so viele wie mit herkömmlichen (dh hohe Energie) erhalten wird, ist identifiziert Fluoroskope. Identifizierung weiterer Schluck Parameter wird erwartet, da wir dabei, die Möglichkeiten des neuen Systems. Die bisherigen Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit der Verwendung einer geringen Energiedurchleuchtungssystem nachzuweisen und zu quantifizieren subtile Änderungen in Schwalben Physiologie, die sonst bei der Verwendung von Hochenergie Fluoroskope murine Krankheitsmodellen untersucht übersehen werden kann.

Introduction

Dysphagie (Schluck Impairment) ist ein häufiges Symptom von zahlreichen medizinischen Bedingungen, die Menschen aller Altersgruppen. Beispiele hierfür sind Schlaganfall, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, zerebrale Lähmung, Muskeldystrophie, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Neuronale Ceroid-Lipofuszinose, Kopf- und Halskrebs, Frühgeburt und erweiterte Hautalterung. Dysphagie ist stark mit Mortalität korreliert, typischerweise als Folge von schweren Mangelernährung oder Pneumonie, die bei bakteriellen haltige Lebensmittel / flüssig / Speichel in die Lunge aspiriert 1-4 entwickelt. Diese schwächenden und lebensbedrohlichen Erkrankung betrifft mehr als 15 Millionen Menschen jedes Jahr in den Vereinigten Staaten allein 3. Trotz der hohen Prävalenz und die damit verbundenen negativen Folgen werden die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten für Schluckstörungen auf palliative (und nicht heilenden) nähert, wie Ernährungsumstellung (zB Vermeidung von bestimmten Lebensmitteln / flüssig Konsistenz), Haltungsveränderungen (zB Tucki begrenztng des Kinn beim Schlucken), Motor Ansätze (zB ausübt Targeting Muskeln in der Mundhöhle, des Rachens und Kehlkopfes), sensorischen Ansätze (zB Führungs Geschmack, der Temperatur und / oder mechanischer Stimulation) und Sondenernährung (zum Beispiel Ernährung und Flüssigkeitszufuhr über eine Nasensonde (NG) Rohr oder eine perkutane endoskopische Gastrostomie (PEG) Rohr) verwaltet. Diese Behandlungen nur als symptomatische Therapie dienen als die Konzentration auf die eigentlichen Ursachen des Problems. In der Tat ist ein großes Hindernis für die Entdeckung neuartiger, wirksame Behandlungen für Dysphagie der begrenzten wissenschaftlichen Erkenntnissen der zuständigen pathologische Mechanismen, die wahrscheinlich für jede Krankheit.

Schluckstörungen Diagnose wird überwiegend mit Hilfe eines radiologischen Verfahren genannt videofluoroscopic Schlucken Studie (VFSS), auch als modifizierte Bariumbreischluck Studie bekannt gegeben. In den letzten 30-plus Jahren hat sich diese Diagnosetest wurde als Goldstandard für die evaluating schlucken Funktion 5-7. Dieser Test bringt es mit sich der Patient sitzen oder stehen im Weg der Röntgenstrahl eines Durchleuchtungsmaschine während freiwillige Nahrungsaufnahme und mit einem oralen Kontrastmittel gemischt flüssiger Konsistenz, in der Regel Bariumsulfat 8,9 oder Iohexol 10. Da der Patient schluckt, Nahrung und Flüssigkeit, die Kontrastmittel kann in Echtzeit über einen Computerbildschirm auf dem Weg vom Mund in den Magen zu sehen. Weichgewebestrukturen sind ebenfalls sichtbar und kann relativ zu der Struktur und Funktion zu beurteilen. Die Patienten werden aufgefordert, mehrere Schwalben der einzelnen Lebensmittel und flüssigen Konsistenz durchführen, die alle Video für spätere Betrachtung und Frame-by-Frame-Analyse, um das Vorhandensein und den Grad der Dysphagie quantifizieren aufgezeichnet sind. Zahlreiche physiologische Komponenten Schlucken sind in der Regel untersucht, wie die anatomischen Triggerpunkt der Rachen Schwalbe, Bolus Gangszeit durch den Rachen und Speiseröhre, Umfang und Dauer der Laryngeal Höhe, Position und Höhe der Post-Schwalbe-Rest, und das Auftreten von und physiologische Grund für Aspiration 7,11.

Aspekte der menschlichen VFSS Protokoll wurden kürzlich für die Untersuchung frei verhalten Ratten geeignet ist; Allerdings wurden die Ergebnisse beschränkt, da die Ratten nicht in der videofluoroscopic Sichtfeld während des Tests 12 zu bleiben. VFSS zuvor nicht mit Mäusen versucht worden. Erfolgreiche Anpassung des menschlichen VFSS Protokoll zur Verwendung mit Mäusen und Ratten wäre eine neuartige Untersuchungsmethode, die Hunderte von derzeit vorhandenen murinen (Maus und Ratte) Modelle von Erkrankungen, die dafür bekannt sind, Schluckstörungen bei Menschen verursachen Analyse zu schaffen. Diese neue Methode (im Folgenden als murine VFSS genannt) würde daher beeilen Identifizierung und Validierung von Mausmodellen von Dysphagie, die sich für die Untersuchung der zugrunde liegenden neurophysiologischen Mechanismen in Muskeln, Nerven und Hirngewebe, die pathologische sind und einen Beitrag zu Dysphagie sind in Menschen. Außerdem murine VFSS würde Identifizierung objektive Maßnahmen (Biomarker) von Schwalbe Funktion / Dysfunktion, die direkt mit dem Menschen verglichen werden könnte ermöglichen. Diese Quer Arten videofluoroscopic Biomarker könnten dann dienen als neue Zielparameter um die Wirksamkeit der Behandlung in präklinischen Studien mit Mäusen und Ratten, die besser an klinischen Studien mit Menschen zu übersetzen wäre zu quantifizieren.

Zu diesem Zweck wurde die murine VFSS Protokoll mit ~ 100 Mäusen beiderlei Geschlechts etabliert. Alle Mäuse wurden entweder C57 oder Hybrid C57 / SJL-Stämme. Die C57-Mäuse wurden nicht gentechnisch veränderten, während C57 / SJL war die Hintergrundstamm für eine Kolonie von transgenen SOD1-G93A (oder SOD1) Mäusen, die am weitesten verbreitete Tiermodell der ALS. Die SOD1 Kolonie war eine ungefähre 50-50 Mischung aus transgenen (dh ALS betroffenen) Mäusen und nicht transgenen (dh unbeeinflusst) Geschwistern.

Die murine VFSS Protokoll besteht aus drei Komponenten:

  1. Rezepte, die den unangenehmen Geschmack / Geruch von oralen Kontrastmittel zu maskieren und zu produzieren ausreichenden Röntgendichte, um eine angemessene Darstellung der Schlucken zu ermöglichen,
  2. Ein Schritt-für-Schritt-Test-Protokoll, das Tier Compliance maximiert, minimiert die Gesamttestzeit und Strahlenbelastung und ermöglicht die Quantifizierung von mehreren Schwalbe Parameter für die einzelnen Phasen des Schluckens (dh oral, Rachen und Speiseröhre).

Der kombinierte Effekt erzeugt eine komfortable, niedrige Stress, Selbst Fütterung Prüfung Umgebung, die Beurteilung der typischen Ernährungs- und Schluckverhalten von Mäusen ermöglicht.

Protocol

Die murine VFSS Protokoll folgt ein zuge Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Protokoll und NIH-Richtlinien.

1. Konstruieren Beobachtungskammern aus Polycarbonat Schläuche und Folien (Abbildung 1)

  1. Schneiden Sie 5 cm breit, quadratisch Polycarbonat-Schlauch (~ 2 mm Wandstärke) in 16 cm Länge mit einem manuellen Fräsmaschine. Die meisten Mäuse ausreichend in diesen Dimensionen, die in einem engen Testkammer, die zu Fuß und drehte sich um, wie gewünscht ermöglicht Ergebnisse passen. Eine Wanddicke von ~ 2 mm eine ausreichende Steifigkeit ohne signifikante Dämpfung des Röntgenstrahls.
    1. Zwei Arten von Kammern sind für dieses Protokoll: "Auslauf Rohre", für die Bereitstellung von Flüssigkeiten über Auslauf konzipiert und "Lüftungsrohre", für die Bereitstellung von Flüssigkeiten über PEG-Schale ausgelegt.
      1. Für "Auslauf tubes", stellen eine kleine Langloch (12 x 8 mm) in der Oberseite jedes Rohr nahe einem Ende mit einem Hand Fraesmaschinine. Dieses Loch wird verwendet, um Trinklösungen über einen Zuführungsschlauch Tülle während Verhaltensanlage und VFSS Tests zu liefern.
      2. Für "Paukenröhrchen", bohren 9 kleinen Lüftungsöffnungen in der Spitze jedes Rohr in der Nähe von einem Ende. Dieses Rohr wird während VFSS Tests mit peg-Schüssel statt Zuführungsschlauch verwendet.
      3. Es ist möglich, Auslauf Rohre bei der Auslieferung von Flüssigkeit über PEG-Schale zu verwenden; muss jedoch die Öffnung in der Kammerdecke blockiert werden, um störende Erkundungsverhalten von Mäusen (siehe Schritt 6.2.2) zu verhindern.
  2. Cut Polycarbonat-Platten (3/4 "Dicke) in Endkappen (50 x 50 mm, 2 pro Röhre) mit Hilfe eines computergesteuerten Fräsmaschine, auch als CNC-Steuerung (CNC) Maschine.
    1. Mühle eine längliche Nut (19 x 6 mm) in der Nähe einer Kante der Innenfläche jeder Stirnkappe. Verwenden Sie diese Nut einen zapfen Schüssel sichern für Mäuse von während VFSS Tests trinken.
    2. Mühle 5 runde Lüftungsöffnungen (6 mm Durchmesser) Durch jede Endkappe.
    3. Mühle ein kleineres rundes Loch (5 mm Durchmesser) durch die Endkappe, direkt über der länglichen Nut. Verwenden Sie diese Bohrung, um Flüssigkeit während VFSS Tests in die peg-Schüssel zu liefern.
    4. Auf der Außenseite der Endkappe, eine 9/16 "Durchmesser Senkung das ist 1/4" Mühle Tiefen um diese kleinere Loch.
    5. Wegzufräsen 2 mm entlang des Umfangs der Innenfläche der Endkappe zu einer Tiefe von 7 mm, einen Schritt, die leicht in das Ende der Rohreinsätze zu machen.
    6. Mühle eine 1 mm aufweist, in der Stufe der Endkappe, um einen O-Ring, der notwendig ist, um die End-Kappe fallen aus dem Ende des Rohrs zu verhindern, aufzunehmen.
    7. Runden Sie freiliegenden Kanten abgeschrägt und alle Ecken der Endkappen Kauen von Mäusen zu verhindern.
  3. Stellen peg-Schalen aus Polycarbonat-Platten mit einer CNC-Maschine. Abmessungen sollte 24 x 19 x 6 mm 3, mit einem 10 x 3 mm 2 Schüssel-Form Depression an einem Ende sein. Eine PEG-Schale ist needed für jedes Röhrchen. Peg-Schalen sollte eng in die längliche Nut in den Endkappen (Abbildung 2) einzufügen.

Figur 1
Abb. 1: Beobachtung Chambers Beobachtungskammern wurden entwickelt, um frei zu verhalten Tiere in der Durchleuchtung Sichtfeld zu erhalten. Diese Bilder zeigen Kammerkomponenten unerlässlich für die Durchführung VFSS. Top: "Tüllenrohres", für die Bereitstellung von Flüssigkeiten über Auslauf konzipiert. Unten: "Belüftungsschlauch", für die Bereitstellung von Flüssigkeiten über PEG-Schale ausgelegt. Die beiden Endkappen sind zwischen Auslauf und Lüftungsrohre.

Abbildung 2
Abb. 2: Peg-Schalen Jede PEG-Schale rastet in eine Nut in der Innenfläche jeder Endkappe. Links:unmontiert Komponenten. Mitte: montierten Komponenten. Rechts:. Außenseite der Endkappe Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

2. Construct Sipper Rohr Flaschen von Zentrifugenröhrchen, Silikon-Stopper und Metall Tüllen (Abbildung 3)

  1. Verwenden Sie einen Stopper Bohrer (5/16 "), um ein Mittelloch durch jeden Silikonstöpsel machen.
  2. Geben Sie einige Tropfen Mineralöl in das Bohrloch und von Hand eine Metallauslauf in das breite Ende des Stopfens einfügen. Gerade Kugelschreiber Tüllen sind bevorzugt, weil gerade Maul Tüllen führen zu übermäßiger Leckage und Verspritzen des Kontrastmittels innerhalb der Beobachtungskammer, die während der Prüfung mit Visualisierung beeinträchtigen können.
  3. Stellen Sie die Auslauflänge, so dass er überspannt die gesamte Länge des Silikonstopfen und erstreckt sich etwa 3 cm über das breite Ende des Stopfens.
  4. Legen Sie die schmale Ende jeder Stopper (der eine Zuführungsschlauch) in ein 30 ml Zentrifugenröhrchen.
  5. Stellen Sie sicher, dass die Auslauflänge, indem Sie es durch das Langloch in der Spitze der Beobachtungskammer ausreichend ist. Der Auslauf Spitze sollte ca. 1 cm von der Kammerdecke, die lang genug für einen gesunden erwachsenen Mäusen zu erreichen, ist Ruhe.
    HINWEIS: Überlängen führen bei Mäusen zu trinken, während Sie / Neigen des Kopfes, die Visualisierung von Schlucken während VFSS verdeckt.
  6. Verlängern Sie die Auslauflänge zu jüngeren Mäusen, kleinere Mausstämme und Maus Krankheitsmodelle, die den Auslauf nicht erreichen können, durch motorische Beeinträchtigung der Glieder unterzubringen.
  7. Die neu gemacht Tüllen waschen vor dem Einsatz auf Mineralöl, Silikon Schmutz und andere Verunreinigungen während der Behandlung zu entfernen.

Figur 3
Abbildung 3: Sipper. Rohr Flaschen Links: nicht montierten Komponenten. Mitte: montierten Komponenten. Rechts:. Maus Trinken aus Zuführungsschlauch in Beobachtungskammer Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

3. Konstruieren Sie eine Spritze Delivery System für die Verwendung mit Peg-Schalen (Abbildung 4)

  1. Verwenden Sie eine Drehbank, Adapter für den Anschluss von Polyethylen (PE) Schlauch auf die Beobachtungskammer Endkappen machen, wie folgt beschrieben.
    1. Geschnitten 1/2 "Durchmesser Acetalharz Stangenmaterials in 1 1/4" Längenabschnitte, die hier als Rohradapter (oder Adapter) bezeichnet.
    2. An einem Ende jedes Adapters, reduzieren eine 1/2 "Längenabschnitt an der Spitze bis 3/16" Durchmesser, die hierin als das schmale Ende.
    3. Für die verbleibenden 3/4 "Längenabschnitt jedes Adapters (dh der Durchmesser von 1/2" Ende), Maschinen Nuten zur manuellen Greifen beim use. Dieser Abschnitt wird im folgenden als das breite Ende bezeichnet.
    4. In dem breiten Ende jedes Adapters, bohren Sie ein Mittelloch, das 0,098 "Durchmesser und 1" tief ist.
    5. Bohrer und ream den verbleibenden Abschnitt des Mittellochs in jedem Adapter 0,096 ", um eine enge Passung auf dem PE-Schlauch bereitzustellen.
  2. Geschnitten PE-Schlauch (PE 240, Innendurchmesser 1,67 mm) auf die gewünschte Länge mit einer Schere. A 3-4 Fußlänge während VFSS Tests ausreichend vergrößert den Abstand zwischen dem Prüfer und Röntgenapparat zu Strahlenschutz zu verbessern.
    HINWEIS: Größere Längen wird ein größeres Volumen des Kontrastmittels Lösung während VFSS Tests, vielleicht größer als die Standard 30 ml Rezeptur zu nutzen.
  3. Legen Sie eine stumpfe Spitze 15 G-Nadel vollständig in das eine Ende des PE-Schlauch. Der Einbau sollte fest.
  4. Stecken Sie das andere (freie) Ende des PE-Schlauch durch das mittlere Loch der Adapterrohr, beginnend bei ter breite Ende.
  5. Ziehen Sie den PE-Schlauch aus dem engen Ende des Adapters so, daß sie sich ~ 2 mm.
  6. Stecken Sie das schmale Ende des Adapters (mit ~ 2 mm PE-Schlauch, der sich von ihm) in der Endkappe eines Beobachtungsrohr; es sollte genau in die Schulterbohrung direkt über dem zapfen Schüssel befindet passen.
  7. Stellen Sie die PE Schlauchlänge an dem schmalen Ende des Adapters, so dass es kaum erstreckt sich oberhalb der Schüssel Vertiefung in der PEG-Schüssel.
  8. Füllen Sie einen 10-ml-Spritze (ohne Nadel befestigt) mit Wasser aus einem Becher, und entfernen Sie die Luftblasen.
  9. Bringen Sie die Fertigspritze an die Nadel Ende des PE-Schlauch.
  10. Langsam schieben Sie den Spritzenkolben, um Wasser in die peg-Schüssel in der Beobachtungskammer zu liefern. Stoppen Sie, wenn der Zapfen-Schüssel ist fast voll. Überfüllung, die Spritzen beim Trinken verursachen zu vermeiden.
  11. Wenn der Zapfen-Schüssel nicht richtig füllen, muss die Länge der PE-Schlauch, der sich über die peg-Schüssel.
  12. Überdehnung des PESchlauch wird zu locken Mäuse darauf während der Prüfung zu kauen und nicht trinken aus dem zapfen Schüssel.
  13. Wenn die PE-Schlauch ist nicht weit genug ausgedehnt wird Flüssigkeit auf den Boden der Beobachtungskammer statt Befüllen des zapfen Schüssel laufen.
  14. Nach dem Gebrauch entfernen Sie die Spritze und waschen Sie den gesamten Spritzenabgabesystem mit Wasser und Seife. Verwenden Sie ein 10-ml-Spritze, um Luft durch den PE-Schlauch zu drücken, um Wasser zu entfernen. Durch Autoklavieren sterilisieren nach Bedarf.

4
Abb. 4: Spritze Delivery System Links: nicht montierten Komponenten. Mitte: montierten Komponenten. Rechts:. Maus Trinken aus PEG-Schale in Beobachtungskammer Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4. Konstruieren Sie eine motorisierte Scissoder Heben Tabelle für die Fernpositionierung der Beobachtungskammer (Abbildung 5)

  1. Erstellen Sie eine Scherenhebebühne mit einer 12 x 12 cm Plattform, erhöhen kann und unteren 5 cm zu betrachten Mäuse in verschiedenen Positionen innerhalb der Durchleuchtung Sichtfeld unterzubringen. Fahrstuhl Material sollte aus Metall oder Kunststoff zur einfachen Reinigung mit Desinfektionsmitteln sein.
  2. Halterung Schrittmotoren, um die Höhe und Längsposition der Hubeinstellung.
  3. Koppeln des ersten Schrittmotors auf die Scherenhebemechanismus, um die Höhe von der Übersetzung einer Querstange zu steuern. Diese Kopplung kann eine Gewindespindel oder Zahnstange-Ritzel-Getriebe ist.
  4. Paar der zweite Schrittmotor an die Scherenheberahmen, um die Längsposition durch Verschieben der gesamten Liftrahmen relativ zu dem Tisch zu kontrollieren. Diese Kopplung kann eine Gewindespindel oder Zahnstange-Ritzel-Getriebe ist.
  5. Draht ein Fernsteuersystem, um die Schrittmotoren, um die Einstellung der Beobachtungskammer Position während der Bilderzeugung zu ermöglichen, während die Minimierung Untersutor Strahlenbelastung.
  6. Schnittstelle Handfernbedienungstasten mit einem Mikrochip, um die Aktivierung und die Richtung jedes Schrittmotors zu steuern.

Abbildung 5
Abb. 5: Ferngesteuerte Scherenhubtisch Links: Seitenansicht Scherenhubtisch. Rechts: Hubtisch mit Beobachtungskammer in Durchleuchtungs positioniert. Der Hubtisch stellt die Position der Beobachtungskammer an Mäuse in das Blickfeld zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

5. Führen Behavioral Anlage Vor VFSS Testing zu Maximale Teilnahme Stellen Sie sicher,

  1. 1-2 Wochen vor der Prüfung unter Mäusen auf eine über Nacht (12-16 Stunden) die Wasserregulierung Zeitraum VFSS zu induzierenDurst, während dieser Zeit Wasser aus dem Käfig zurückgehalten. Das Ziel der Wasserregulierung ist für Tiere durstig, nicht dehydriert sein. Die Tiere sollten wach und ansprechbar zu bleiben. Diese Dauer und Zeitrahmen ist wesentlich, Dehydrierung, die als ein Ergebnis von 2 Wasserregulierung Folgen innerhalb 1 Woche auftreten kann (das heißt, eine für Verhaltensanlage und ein anderes für VFSS Testen).
  2. Legen Sie eine einzelne "Tüllenrohres" (mit einem Ende durch eine Endkappe verschlossen) auf dem Boden eines Hauses Käfig mit frischem Einstreu. Das geschlossene Ende sollte der Auslauf nächsten Öffnung in der Kammerdecke sein. Dieser Schritt stellt sicher ausreichende Lüftung während mehrere Mäuse Schlaf drängten sich in der Kammertiefe über Nacht. Das offene Ende ermöglicht Mäusen, frei zu geben / aus der Kammer austreten.
  3. Entfernen Sie weitere Anreicherung Material (zB nestlet und Hütte) an Mäuse zu erkunden und Schlaf in der Kammer über Nacht (Abbildung 6) zu fördern. Dieser Schritt stellt sicher, dass Mäusesind es gewohnt, in der Kammer für längere Laufzeiten vor VFSS Testen akklimatisiert.
  4. Geben Sie einen einzigen Standard Futterpellet per Maus auf dem Boden des Käfigs zur Übernachtung Essen; bieten nicht Wasser oder anderen Flüssigkeitszufuhr Quellen.
  5. Verwenden Sie eine Standard-Filteraufsatz, um die Mäuse in den Käfig über Nacht enthalten, die Abmessungen der Beobachtungskammer zu verhindern, eine Anschlussleitung Deckel passend in den Käfig. Bewahren Sie den entfernten Drahtdeckel (mit Nahrung und Wasser-Flasche) auf der Oberseite des Filterober zu belasten den Deckel und Mäusen verhindern entweichen.
  6. Führen Schmackhaftigkeit Prüfung am nächsten Morgen, wie folgt beschrieben.
    1. Machen Sie eine Schokoladengeschmack-Test-Lösung in einem 30 ml-Flasche Zuführungsschlauch, ohne Zusatz von Kontrastmittel (dh Ersatz Wasser Iohexol). Dieses Rezept ist in Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie eine Flasche pro Käfig zu prüfen.
    2. Entfernen Sie die Beobachtungskammer und ersetzen Sie die Standarddrahtdeckel. Bieten die SchokoladengeschmackLösung (Raumtemperatur ~ 22 ° C) für 2 min pro Käfig, durch den Draht Deckel eingesetzt.
    3. Beurteilen Schmackhaftigkeit durch Beobachtung Trinkverhalten während der 2 Minuten Testzeit.
    4. Ergebnis Schmackhaftigkeit nach folgenden Kriterien:
      1. Latenz, bis die erste Maus Getränke an der Tülle für mindestens 5 Sekunden ohne Unterbrechung.
      2. Prozentsatz der Mäuse pro Käfig, der die Lösung trinken.
      3. Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig trinken am Auslauf.
    5. Die Lösung wird als schmackhaft, wenn die Mehrheit der Mäuse in jeder Käfig mehrere lange (> 5 s) Anfälle von Trinkwasser haben und wenn mehrere Mäuse gleichzeitig trinken aus dem Auslauf (Bild 7).
    6. Wenn der Schokoladengeschmack Lösung ist nicht schmackhaft, wiederholen Schmackhaftigkeit Tests mit anderen Geschmacksverstärker in verschiedenen Konzentrationen, um eine einzelne bevorzugte Lösung zu identifizieren.
    7. Bieten bis zu vier verschiedenen Lösungen (bei verschiedenen Konzentrationen) eine zu einem Zeitpunktin zufälliger Reihenfolge auf mehrere Käfige von Mäusen in einem einzigen Testtag ohne Auswaschphase oder Auswaschlösung. Geeignete Geschmacksverstärker für Mäuse berücksichtigen sind Zucker, Käse, Erdnussbutter, verschiedene Obst- und Nussaromen und Milch.
      HINWEIS: Schmackhaftigkeit führen nicht Prüfung mehr als einmal pro Woche, um Austrocknung durch wiederholte Wasserregulierung Episoden zu verhindern.
    8. Es kann mehrere Wochen dauern, um die bevorzugte Lösung für jeden Stamm von Mäusen erfolgreich zu identifizieren. Das Ziel ist, Kandidaten Aromen, die in mehreren langen (> 5 s) führen Anfälle von Trinkwasser durch Mäuse sofort erkennen (<30 s) nach der Exposition, da diese Qualifikationen gelten als wesentlich für den Erhalt erfolgreiche VFSS Ergebnisse.
  7. Nach einer bevorzugten Geschmacksstofflösung wird identifiziert, stellen Sie den Beobachtungskammer zu jedem Käfig zu Verhaltensanlage weiter, wie folgt beschrieben.
    1. Befestigen Sie ein Ende-Kappe zu der Beobachtungskammer am Ende der nächstenoval (Auslauf) Loch.
    2. Angebot Mäusen die Schokoladengeschmack Lösung für 2-3 Stunden, indem Sie den Zuführungsschlauch Flasche durch die ovale Öffnung in der Oberseite der Kammer. Dieser Schritt stellt sicher, dass alle Mäuse zu tief zu trinken in der Beobachtungskammer konditioniert worden.
    3. Entfernen Sie den Draht Deckel, um die Beobachtungskammer unterzubringen.
    4. Zeigen 1 Futterpellet pro Maus auf dem Käfigboden für ad libitum Verbrauch während der Testperiode.
    5. Bedecken Sie den Käfig mit einem Standard-Filter oben nach Mäusen an der Flucht für den Rest des Verhaltensanlage Periode zu verhindern. Bewahren Sie den entfernten Drahtdeckel (mit Nahrung und Wasser-Flasche) auf der Oberseite des Filterober zu belasten den Deckel.
  8. Geben Sie Wasser und Nahrung ad libitum im Käfig, wenn Verhaltensanlage abgeschlossen ist.
  9. Waschen Sie die Beobachtungskammern (Rohre und Endkappen) und Zuführungsschlauch Flaschen (Tüllen und Zentrifugenröhrchen) mit Wasser und Seife; Sterilisieren durch Autoklavieren bei Bedarf. Vermeidenmit Aceton, um die Rohre zu reinigen, da es eine permanente Trübung Effekt, dass das Rohr undurchsichtig und nicht durchscheinend macht verursacht.

Figur 6
Abb. 6: Mäuse Explo Beobachtung Chambers Mäuse sind natürlich geneigt, um Schutz in kleinen Räumen zu suchen. Als Ergebnis, werden sie frei betreten und erkunden Sie die Beobachtungstubus, wenn es im Käfig gesetzt wird. Die meisten Mäuse gefunden schlafen in der Kammer in den Morgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

<td> Schokoladensirup
ZUTATEN Schokoladen-Lösung (für Schmackhaftigkeit Testing) Schokoladengeschmack Iohexol (für VFSS Testing)
3 ml 3 ml
Iohexol (350 mg Iod / ml) 0 ml 15 ml
Wasser (DI oder gefiltert) Einstellen auf 30 ml Endvolumen (27 ml) Einstellen auf 30 ml Endvolumen (12 ml)
Endvolumen 30 ml 30 ml

Tabelle 1: Schokoladengeschmack Testlösung von C57 und C57 / SJL Maus-Stämme bevorzugt.

7
Abb. 7: Schmackhaftigkeit Testing Ein Indikator für Geschmackspräferenz während Schmackhaftigkeit Prüfung ist die Anzahl von Mäusen, die gleichzeitig zu trinken aus einer Tülle im Käfig. Dieses Bild zeigt vier Mäuse gleichzeitig trinken einen Schokoladengeschmack Lösung, die als das identifiziert wurde,bevorzugte Geschmacksverstärker von C57 und C57 / SJL Stämme.

6. VFSS Testing Vorbereitung

  1. Betreff Mäuse über Nacht Wasser Regulierungsperiode (dh zurückzuhalten Wasser für 12 bis 16 h), wie in Schritt 5 beschrieben.
    1. Legen Sie eine einzelne "Paukenröhrchen" (mit einem Ende durch eine Endkappe verschlossen) auf dem Boden eines Hauses Käfig mit frischem Einstreu. Das geschlossene Ende sollte am nächsten zu den Lüftungsöffnungen in der Kammerdecke sein. Dieser Schritt stellt sicher ausreichende Lüftung während mehrere Mäuse Schlaf drängten sich in der Kammertiefe über Nacht. Das offene Ende ermöglicht Mäusen, frei zu geben / aus der Kammer austreten.
  2. Am nächsten Morgen, entfernen Sie verschmutzte Beobachtungskammern von Käfigen und kurz mit Leitungswasser spülen und in Vorbereitung auf VFSS Tests vollständig trocken ist.
    1. Entfernen und reinigen nur eine Kammer zu einer Zeit durcheinander Kammern zwischen den Käfigen, um zu verhindern, das übermäßige Sondierungs Verhaltensweisen führen kann, dasssignifikant mit VFSS Tests stören.
    2. Wenn "Auslauf Rohre" anstelle von "Lüftungsrohre" für VFSS Tests verwendet, legen Sie eine Silikon-Stecker in die Ausgussöffnung der Beobachtungskammer Decke zu Erkundungsverhalten (Abbildung 8) zu verhindern.
    3. Beschriften Sie jedes Kammer (zum Beispiel mit dem Heimnetzkäfignummer), um Verwechslung zu vermeiden.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein trockenes Löschenmarkierung, jedes Rohr gereinigt, bevor es wieder in den Käfig zu kennzeichnen. Permanent Marker sollte vermieden werden, da er durch das Rohrmaterial absorbiert wird und nicht abwaschbar, auch mit Alkohol oder Aceton.
  3. Bereiten Sie den Schokoladengeschmack Iohexol Lösung (oder andere schmackhafte Lösung).
    1. Machen Sie eine einzelne Rezept (30 ml) der Testlösung (Tabelle 1) für mehrere Käfige.
    2. VORSICHTSMASSNAHMEN FÜR DIE Iohexol: Ungeöffnete Iohexol Flaschen bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Angebrochene Iohexol Flaschen innerhalb von 24hr, wie die Viskosität und Geschmack kann in einem Tag oder so nach der Exposition gegenüber Luft zu ändern. Alternativ gefrier Aliquote von single-Portionen (15 ml) in Zentrifugenröhrchen für die langfristige Lagerung. Vorbereitet Iohexol Testlösungen müssen innerhalb weniger Stunden genutzt werden, um die Frische zu gewährleisten und zu verhindern Vermeidung von Mäusen. Verwalten Iohexol Lösungen bei Raumtemperatur, um zu vermeiden zu verwechseln die Studie aufgrund von Temperatureffekten auf Schwalbe Funktion. Nicht einfrieren restliche Testlösung, wie der Schokoladengeschmack wird bitter mit Gefrierfach und führt zu Vermeidung von Mäusen.
  4. Bereiten Sie die Durchleuchtung Umwelt.
    1. Verwenden Sie ein Ersatz (leer) Beobachtungskammer und peg-Schale (oder Zuführungsschlauch Tülle), um die optimale Höhe und Position innerhalb des Durchleuchtungsstrahl, der Visualisierung von Trinkwasser in der lateralen (horizontal) Ebene ermöglicht zu bestimmen.
    2. Stellen Sie den Durchleuchtungsbildrate auf 30 Bilder pro Sekunde; höher (aber nicht senken) Bildraten verwendet, sofern vorhanden.
    3. ENSure dass eine strahlenundurchlässige Kalibrierungsmarke wird in geeigneter Weise an der Fluoroskop-Kamera / Detektor angeordnet, so daß sie auf dem Anzeigebildschirm sichtbar ist, während des gesamten Tests. Dieser Schritt ist notwendig, um die Kalibrierung der Längenmessungen zur Quantifizierung Schluckparametern ermöglichen.

8
Abb. 8: Silikon Stecker bei der Benutzung von Peg-Bowls Links: Silikon-Stecker. Rechts: Ein Silikon-Stecker wird durch den Zuführungsschlauch Öffnung an der Oberseite der Beobachtungskammer gezogen. Dieses Plug Mäusen verhindert Entstehung von durch die Einspritzöffnung bei Verwendung eines PEG-Schale statt Zuführungsschlauch während VFSS Tests abgelenkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7. VFSS Prüfung von Mäusen

  1. Heben Sie die Kammer aus dem Käfig und sanft bringen Sie den 2. Abschlusskappe (mit peg-Schale angebracht, wenn ein Zuführungsschlauch wird nicht verwendet werden), darauf achten, daß Sie die Maus (besonders der Schwanz) einklemmen.
    HINWEIS: Diese Vorgehensweise minimiert Stress-Reaktion der Maus die durch die Handhabung, die besonders wichtig für die Mäuse, die zum ersten Mal getestet sind.
  2. Mit wiederholten Prüfung können Mäuse leicht gelockt werden, um in die Kammer einzutreten, wenn sie vor ihnen im Inneren des Käfigs angeordnet ist, oder durch den Schwanz über die Kammeröffnung suspendiert.
  • Positionieren der Beobachtungskammer (enthaltend das Maus) innerhalb des Durchleuchtungs Maschine VFSS Tests in der lateralen Ebene (dh horizontale Röntgenstrahls) beginnen.
  • Geben Sie den Schokoladengeschmack Iohexol Lösung (Tabelle 1) über peg-Schüssel oder Zuführungsschlauch Flasche.
    1. Bei Verwendung eines PEG-Schale, Liefern die Lösung über die in Schritt 3 oben beschriebenen Spritzenabgabesystem. Dieses System ermöglicht eine schnelle und einfache Wiederbefüllung des zapfen Schüssel, wie gebraucht.
    2. Bei Verwendung eines Zuführungsschlauch Flasche, stecken Sie den Zuführungsschlauch durch die ovale Öffnung in der Spitze der Beobachtungskammer. Kippen Sie die Flasche, so dass die Tülle in Richtung der Mitte der Kammer gerichtet.
  • Starten Sie den videofluoroscopy Aufnahme, wenn die Maus beginnt zu trinken.
    1. Stellen Sie die Position der Beobachtungskammer (unter Verwendung der in Schritt 4 beschrieben ferngesteuert Scherenhubtisch), so dass der Schluckmechanismus in das Sichtfeld zu sehen ist.
    2. Pause der Aufnahme bei jedem Drücken der Maus wendet sich von der Stange-Schüssel oder Auslauf, um die Dauer der Strahlenexposition zu minimieren.
    3. Aufnahme fortzusetzen, wenn die Maus wieder in den Ausguss oder zapfen Schüssel.
    4. Füllen Sie die peg-Schüssel, wie gebraucht.
    5. Stoppen Sie die Prüfung, wenn die Maus nicht innerhalb von 5 Minuten zu trinken. Das Ziel besteht darin, mehrere lon aufzeichneng (> 5 sec) Anfälle von kontinuierlichen trinken, was typisch für die meisten Mäuse innerhalb der ersten 2 min des Tests ist.
    6. Zurück widrige Mäuse an den gewohnten Käfig (ohne Wasser) für die erneute Prüfung zu einem späteren Zeitpunkt am selben Tag; haben eine 24-Stunden-Wasserregulierungsperiode nicht überschreiten. Mäuse, die für die drei Versuche noncompliant verbleiben, werden aus der Studie entfernt.
  • Wenn nötig, die Position des Röntgenapparats zu Mäusen der dorsal-ventralen Ebene (dh in vertikaler Röntgenstrahls) zu testen. Diese Ebene wird verwendet, um Abweichungen im Bolus Strömung durch den Rachen und Speiseröhre beim Schlucken zu identifizieren.
  • Bei der Prüfung von mehreren Mäusen aus dem gleichen Käfig:
    1. Reinigen Sie die PEG-Schale (und Spitze der PE-Schlauch) oder Zuführungsschlauch Tülle mit einem trockenen Papiertuch zwischen Mäusen.
    2. Die Beobachtungskammer reinigen zwischen Mäusen benötigt wird, um jede bespritzt Iohexol an den Kammerwänden zu entfernen. Mit einem Papiertuch Spülen Sie die Kammer mit Leitungswasser und trocknen.
  • Bei der Prüfung von Mäusen herma verschiedenen Heimkäfig:
    1. Verwenden Sie eine neue PEG-Schale (oder ändern Sie den Zuführungsschlauch Tülle). Andernfalls können die Mäuse durch den Geruch von anderen Mäusen, die von der gleichen PEG-Schüssel oder Zuführungsschlauch tranken abgelenkt werden. Die PEG-Schalen und Sipper Rohre sollten markiert werden, um Verwechslungen zu vermeiden.
  • Beim Testen von allen Mäusen in einem Käfig abgeschlossen ist, bieten Wasser und Nahrung im Käfig.
  • Waschen Sie die Beobachtungskammern (Rohre und Endkappen), peg-Schalen, Spritzenabgabesystem und Zuführungsschlauch Flaschen (Tüllen und Zentrifugenröhrchen, falls verwendet) mit Wasser und Seife; Sterilisieren durch Autoklavieren bei Bedarf.
  • Entsorgen Sie Rest Iohexol Lösung von Sicherheitsrichtlinien gerichtet; Ablauf Entsorgung kann auf den meisten Anlagen zulässig sein.
  • 8. Video Analysis

    1. Verwenden Sie eine Video-Editing-Software-Programm, Frame-by-Frame-Analyse der videofluoroscopy Aufnahmen ermöglicht, die Schwalbe interessierenden Parameter (Tabelle 2) zu quantifizieren. Identifizieren von mindestens zwei ausgebildeten Rezensenten, jedes Video verblindet analysieren: Eine primäre Gutachter und ein oder zwei Sekundär Rezensenten.
      1. Primäre Rezensent: Informieren Sie jedes Video zu identifizieren und zu analysieren 5.3 lang (ca. 5 sec) Trinkgelage. 5 Maßnahmen pro Schwalbe Parameter reichen für statistische Auswertungen - Dieses Kriterium basiert auf veröffentlichten nicht-radiologische schlucken Studien mit Mäusen 13,14 und VFSS mit Ratten zeigen, dass 12 3 basiert.
      2. Sekundäre Rezensenten: Unabhängig analysieren die 3-5 Maßnahmen pro Schwalbe Parameter für jede Maus, die zunächst identifiziert und durch den primären Gutachter analysiert wurden.
    2. Identifizieren Sie Rezensent Abweichungen für jede Maus. Re-Analyse aller Diskrepanzen als Gutachter Gruppe zu 100% Konsens zu gelangen.
    3. Der Mittelwert der (dh unbestrittene) Werte 3-5 Konsens für jeden Parameter zu schlucken, um den Mittelwert für jede Maus für den Einsatz in statistischen Analysen zu erhalten. Wenn weniger als 3 Messes werden für eine einzige Schwalbe Parameter für eine bestimmte Maus erhalten, geben Sie einen fehlenden Wert (dh nicht Null) in der statistischen Datenbasis für die entsprechenden Parameter schlucken.

    SWALLOW PARAMETER BESCHREIBUNG
    Inter-Swallow-Intervall (ISI) Die Anzahl der Videobilder zwischen zwei aufeinanderfolgenden, ununterbrochene schluckt. Das Startbild für die Berechnung der ISI ist die "Ruhesystem", die sichtbar Übertragung des Bolus aus dem Valleculae an der Speiseröhre unmittelbar vorangeht. Das Lagerschild ist die "Ruhesystem" des nächsten Schluck. Die Anzahl der Rahmen zwischen den beiden aufeinander schluckt wird dann von 30 Bildern pro Sekunde (fps) geteilt, um die Zeit (sec) zu konvertieren.
    Jaw Ausflug Rate (Lecken Bewerten Equivalent) Die Zunge ist nicht eindeutigwährend VFSS sichtbar Quantifizierung der Leckrate zu ermöglichen; jedoch Kiefer Ausflug Rate leicht quantifizierbar. Während lecken, muss die Zange zu öffnen, um die Zunge zu erlauben, aus dem Mund herausragt. Während also das Trinken ist die Anzahl der Kiefer öffnen / schließen (Ausflug) Zyklen pro Sekunde (30 Bilder) äquivalent zu Rate zu lecken. Jede Backe Ausflug Zyklus beginnt mit dem Kiefer maximal geöffnet (die mit Zungenstoß übereinstimmt), und endet, wenn die Kiefer wieder auf maximal geöffneten Stellung. Nachfolgende Zyklen des Kiefers Schließen und Wiederöffnen als einzelne Backe Exkursion Episoden gezählt.
    Jaw Ausflug Entfernung Der Abstand der Kiefer öffnet sich während Kiefer Ausflug Zyklen messen in mm zwischen der oberen und unteren Schneidezähne.
    Lecken-Swallow-Verhältnis Die Anzahl der Backen Exkursion Zyklen, die während jeder ISI auftritt (dh, zwischen zwei aufeinanderfolgenden, ununterbrochene schluckt).
    Swallow Bewerten Die Zahl der Schwalben während jeder 2 Sek Folge ununterbrochener trinken an der Düse auftreten.
    Rachen-Transit-Zeit (PTT) Die Zeit, die der Bolus nimmt, um durch den Rachen geschluckt werden. Das Startbild identisch mit dem ISI Startrahmen ist (dh der "Ruhesystem", die sichtbar Übertragung des Bolus aus dem Valleculae unmittelbar vorausgeht). Das Lagerschild ist, wenn der Schwanz des Bolus vollständig die 2. Halswirbel (C2), die die offensichtlichste anatomischen Landmarke in der Halswirbelsäule der Maus ist vergangen. Die Anzahl der Frames zwischen den Start- und den Endrahmen wird dann von 30 fps aufgeteilt und bis Millisekunden (ms) umgewandelt.
    Bolus Geschwindigkeit durch Rachen Rachen Bolus Geschwindigkeit relativ zu PTT (oben beschrieben) gemessen. Mit ImageJ Software wird der Abstand (mm) von der Valleculae dem C2 Wirbel gemessen skaliert mit einer Kalibrierungsmarke. Diese distance (mm) wird dann durch PTT (msec) zur Bolus-Geschwindigkeit (mm / ms) bestimmen unterteilt.
    Ösophagus-Transit-Zeit (ETT) Der ETT Startrahmen ist identisch mit der PTT Endrahmen (oben beschrieben). Der ETT Endrahmen ist, wenn die Kapsel vollständig in den Magen, die das Verschwinden des Bolus aus der Speiseröhre definiert wird eingegeben. Die Anzahl der Frames zwischen den ETT Start- und Endbild wird dann von 30 fps unterteilt und umgewandelt in msec.
    Bolus Geschwindigkeit durch Speiseröhre Speiseröhren Bolus Geschwindigkeit relativ zu ETT (oben beschrieben) gemessen. Mit ImageJ-Software, ist der Abstand (mm), gemessen von der C2 Wirbel bis zu den gastro-Kreuzung, skaliert mit Kalibrierungsmarke. Dieser Abstand (mm) wird dann durch ETT (msec) zur Bolus-Geschwindigkeit (mm / ms) bestimmen unterteilt.
    Bolus Geschwindigkeit durch Rachen und Speiseröhre Dieser Parameter wird verwendet, wenn C2 ist kein gut sichtbar anatomischen Landmarke; somites ist nicht möglich, zwischen der Rachen- und Speiseröhrenstufen Schluck unterscheiden. In solchen Fällen wird Bolus Geschwindigkeit durch den Rachen und Kehlkopf zu einem einzigen Parameter kombiniert schlucken. Das Startbild identisch mit der PTT-Startrahmen ist (dh der "Ruhesystem", die sichtbar Übertragung des Bolus aus dem Valleculae unmittelbar vorausgeht). Der Endrahmen ist identisch mit dem ETT Endrahmen (dh, wenn der Bolus vollständig den Magen eingetragen). Die Anzahl der Rahmen zwischen diesen beiden Ereignissen wird durch 30 geteilt und fps umgewandelt msec.
    Bolus Umgebung Mit ImageJ Software wird Bolus-Bereich am vallecular "Ruhesystem" vor Beginn der Rachen Schwalbe gemessen, skaliert mit einem Kalibrierungsmarke.
    Rachenraum Rückstands Rachenrückstandsbereich mit ImageJ-Software gemessen, skaliert mit einem Kalibrierungsmarke.
    Flüssigkeitsvolumen Consumed Das Volumen der Flüssigkeit von einem Zuführungsschlauch Flasche verbraucht ist schwierig, aufgrund der Leckage von dem Ausguss zu schätzen. Jedoch kann das Volumen der Flüssigkeit aus einem zapfen Schüssel verbraucht wird genauer wie folgt berechnet werden: 1) Bestimmen der Dichte (dh das Verhältnis von Gewicht zu Volumen) von kalibrierten Flüssigkeitsvolumen, das in die Zapfenschale verabreicht wurde, erhielten 2 ) zu bestimmen, das Gewicht des zapfen Schüssel mit der Restflüssigkeit, 3) Geben Sie diese Werte in einer Gewicht zu Volumen-Wandler (zB http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php .

    Tabelle 2: Swallow Parameter Quantifizierbare Während Murine VFSS.

    Representative Results

    Wir haben erfolgreich eine neue und replizierbar Mäuse spezifische VFSS Protokoll, Testkammern, die Selbst-Fütterung zulassen, Rezepte zum Aromatisieren von oralen Kontrastmittel und eine Schritt-für-Schritt-Test-Protokoll, das die Quantifizierung der Schwalbe Physiologie ermöglicht, schließt konzipiert. Das Energieniveau Fähigkeit des Durchleuchtungssystem bestimmt, welche Parameter konnte in Mäusen untersucht werden, zu schlucken. Wir haben uns zunächst verwendet hochenergetische Fluoroskope für die Verwendung mit Menschen und größere Tiere entwickelt (zB GE Advantx, GE OEC 9600 und Omega Cardiac Cath CS-25, die jeweils mit 30 Bildern pro Sekunde). Jedoch hatten diese Systeme unzureichend Vergrößerung Fähigkeiten zum Testen Mäuse, die in der Tierfüllung nur einen kleinen Teil des Sichtfeldes resultierte (Figur 9). Als Ergebnis war die Bildqualität außerordentlich schlecht, was es unmöglich macht, die meisten Strukturen der Schluckmechanismus sichtbar zu machen. Trotz dieser Einschränkung haben wir festgestellt 7 Ziel VFSS schlucken Parameter, wenn ein herkömmliches (dh, hohe Energie) Fluoroskop in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll (Tabelle 3) durchgängig quantifizierbar Mäuse waren. Außerdem identifizierten wir die vallecular Raum als anatomische Auslösepunkt zum Schlucken bei gesunden erwachsenen Mäusen (3-17 Monate alt), sowie Mäuse mit Bedingungen des fortgeschrittenen Alters (> 18 Monate) und im Endstadium ALS.

    9
    Abb. 9: High Energy Durchleuchtungssysteme Links: Repräsentative Bild einer Maus mit hoher Energie (dh herkömmlicher) Durchleuchtungssysteme erhalten. Man beachte, dass die Maus füllt nur einen kleinen Teil der Fluoroskopie Sichtfeld, wodurch die unzureichende Vergrößerungsfunktion herkömmlicher Fluoroskope zur Bildgebung Nagetieren zeigen. Rechts: Dasselbe Bild vergrößert post capture mit einem Videobearbeitungsprogramm. Schwarzer Pfeil: schlucken Triggerpunkt (Valleculae). Weißer Pfeil:. Bolus im distalen Ösophagus, unmittelbar vor, die durch die Anschlussstelle GE (weiße Stern) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    SWALLOW PARAMETER High Energy Systems Low Energy System
    Inter-Swallow-Intervall (ISI) X X
    Jaw Ausflug Rate (Lecken Bewerten Equivalent) X X
    Jaw Ausflug Entfernung X X
    Lecken-Swallow-Verhältnis X X
    Swallow Bewerten X X
    Pharyngeal Transitzeit (PTT) X
    Bolus Geschwindigkeit durch Rachen X
    Ösophagus-Transit-Zeit (ETT) X
    Bolus Geschwindigkeit durch Speiseröhre X
    Bolus Geschwindigkeit durch Rachen und Speiseröhre X X
    Bolus Umgebung X
    Rachenraum Rückstands X
    Flüssigkeitsvolumen Consumed X X

    Tabelle 3: Swallow Parameter Quantifizierbare Verwendung von Hoch Versus Low Energy Fluoroskopie-Systeme.

    Wir haben vor kurzem erhalten ein niedriger Energie Vergrößerung Durchleuchtungssystem namens The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ), die speziell für unser Labor für die Verwendung mit entwickelt wurde,Mäuse und andere kleine Nagetiere (Abbildung 10). Jedoch sind die deutlich größer Vergrößerungen dieses Systems machte es unmöglich, die gesamte Schluckmechanismus einer Maus in einem einzigen Sichtfeld anzuzeigen. Stattdessen werden zwei Testpositionen erforderlich, wie in Abbildung 11. Position 1 ermöglicht die Visualisierung der gesamten Kopf und proximalen Brustbereich angezeigt. Diese Position ist für die Bewertung der Mund- und Rachenstadien Schlucken notwendig. Position 2 ermöglicht Visualisierung von der Schwalbe Triggerpunkt (dh Valleculae) an den gastroösophagealen (GE) Kreuzung. Diese Position ist für die Beurteilung der Ösophagus-Phase des Schluck notwendig. Vorarbeiten mit The LabScope in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll 13 Ziel Schwalbe Parameter, die bei Mäusen konsequent quantifizierbar sind, die fast doppelt so viele mit hoher Energie (dh herkömmlicher) Durchleuchtung (Tabelle 3) erhalten wird, identifiziert. Diese o zB Zungenbein, der Luftröhre und Halswirbel: utcome an den erweiterten Vergrößerung Fähigkeiten des LabScope, die zur Visualisierung der Vielzahl anatomischer Strukturen ermöglicht (Figur 12), die bei der Verwendung von herkömmlichen Systemen im Wesentlichen unsichtbar waren zurückzuführen. Als Ergebnis konnten wir auch die Videos auf Anzeichen von Kehlkopf-Penetration und Aspiration analysieren. Weder Penetration noch Aspiration wurde für jede Maus in dieser Studie beobachtet, unabhängig von Gesundheit oder Krankheit Bedingungen.

    10
    Abb. 10: Die LabScope Links: Die LabScope führt als Desktop-Röntgenapparat für Kleintiere. Rechts: Nahaufnahme von The LabScope mit markierten Komponenten. Der Scherenhubtisch ist Positionierung einer Beobachtungskammer im Durchleuchtungsfeld. tp_upload / 52.319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    11
    Abb. 11: Low Energy Fluoroskopiesystem Bilder einer Maus mit einem geringen Energiedurchleuchtungssystem erhalten. Beachten Sie, dass die hohe Vergrößerung Fähigkeit verhindert Visualisierung des gesamten Schluckmechanismus innerhalb des Durchleuchtungsfeld. Links: Position 1 - ermöglicht die Visualisierung des gesamten Kopf- und Brustbereich proximal. Die Schwalbe Triggerpunkt (schwarzer Pfeil) im wesentlichen innerhalb des Sichtfeld zentriert. Rechts: Position 2 - ermöglicht die Visualisierung von der Schwalbe Triggerpunkt (schwarzer Pfeil), um die Anschlussstelle GE (weiße Stern). Beachten Sie den Bolus durch den distalen Ösophagus (weißer Pfeil). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    12
    Abb. 12: Anatomische Strukturen sichtbar Mit Hilfe eines Niedrigenergie-Fluoroskopie-System bereits bei der geringsten Vergrößerungseinstellung (links), sind knöchernen Strukturen von Kopf und Hals eines Maus gut sichtbar mit unserer niedrigen Energiedurchleuchtungssystem (dh die LabScope). Anatomischen Strukturen innerhalb des schwarzen Quadrats gezeigt (und markiertem) bei höherer Vergrößerung nach rechts. Verbesserte Darstellung der knöchernen Strukturen erlaubt die Quantifizierung von mehreren zusätzlichen Schluck Parameter, die unmöglich zu analysieren, mit hohem Energie Fluoroskope waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    t "> Schlucken Rate und inter Schwalbe Intervall repräsentativ VFSS Parameter, die entweder niedriger oder hoher Energiedurchleuchtungssysteme in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll quantifiziert werden kann Diese beiden Schwalbe Parameter wurden für drei Gruppen von Mäusen quantifiziert. SOD1 G93A- (SOD1) transgenen Mäusen (dh ein Modell der ALS) bei Krankheit im Endstadium zwischen 4-5 Monate alt, im Alter von C57-Mäusen (18-24 Monate alt) und eine Kontrollgruppe von gesunden jungen (4-8 Monate alt) C57 Mäusen und nicht transgenen Wurfgeschwistern aus der SOD1 Kolonie. Alle Angaben beziehen sich auf nur Auslauf trinken, entweder mit einem niedrigen oder hohen Energiedurchleuchtungssystem. Wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen jungen C57 Mäusen und nicht transgenen junge (Kontrolle) Mäuse aus der SOD1 gefunden Kolonie im Verhältnis zu diesen beiden Parametern Schwalbe;. Deshalb wurden die Daten in eine allgemeine "Kontrolle" Gruppe von jungen gesunden Mäusen für den Vergleich mit alten C57 Mäusen und im Endstadium SOD1 Mäusen kombiniert Schlucken Rate (dh,die Zahl der Schwalben während 2 Sekunden lang ununterbrochen trinken) war deutlich langsamer für SOD1 Mäusen im Vergleich zu im Alter von C57-Mäusen und Kontrollen. Inter-Schwalbenintervall (dh die Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden schluckt) war nicht signifikant verschieden zwischen den Gruppen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vorstellung, dass Dysphagie Profile sind wahrscheinlich deutlich verschieden für jeden Krankheitszustand (Figur 13) sein.

    13
    Abb. 13: Erste Ergebnisse Die Abbildung zeigt repräsentative vorläufigen Ergebnisse für zwei VFSS Schwalbe Parameter quantifiziert unter Verwendung des murinen VFSS Protokoll: schlucken Rate (links) und Inter-Schwalbe Intervall (rechts). Schlucken Sie lag deutlich langsamer für SOD1 Mäusen im Vergleich zu im Alter von C57-Mäusen und Kontrollen. Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurden für die inter Schwalbe unter identifiziertval. Zeilen am oberen der Balken zeigen statistisch signifikante Unterschiede (p <0,05) zwischen den Gruppen, mit Angabe Bonferroni paarweisen Vergleiche. Fehlerbalken stellen ± 1 SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    Discussion

    Hunderte von murinen (Maus und Ratte) Modelle sind im Handel erhältlich, um menschliche Krankheiten zu studieren. Allerdings wurden nur drei murine Krankheitsmodellen speziell untersucht relativ zu Dysphagie: Mausmodell der ALS 13,14 und Rattenmodellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall 12,15-17 18. Jede dieser Voruntersuchungen verwendet verschiedene Methoden, um Dysphagie zu bewerten, wodurch es unmöglich ist, aussagekräftige Vergleiche zwischen den Arten und Krankheiten abzuleiten. Diese große Einschränkung kann in zukünftigen Studien durch den Einsatz der neu entwickelten Mäuse VFSS Protokoll, das objektive Quantifizierung zahlreicher Schwalbe Parameter in Selbst Füttern von Tieren erlaubt überwunden werden.

    Erfolgreiche VFSS Ergebnisse sind abhängig von drei wichtigen Komponenten: 1) Testkammern, die Selbst-Fütterung zulassen, während er ungebremst in einem geschlossenen Raum, 2) Rezepte, die den unangenehmen Geschmack / Geruch von handelsüblichen Mund Gegensatz ag MaskeEltern, und 3) eine Schritt-für-Schritt-Test-Protokoll, das die Quantifizierung der Schwalbe Physiologie erlaubt. Der kombinierte Effekt erzeugt eine komfortable, niedrige Stress, Selbst Fütterung Prüfung Umgebung, die typisch Ernährungs- und Schluckverhalten hervorruft. Eliminierung von einem oder mehreren dieser Komponenten eine nachteilige Wirkung auf die Ergebnisse der Studie. Beispiele für negative Ergebnisse schließen die Unfähigkeit, Tiere in der Durchleuchtung Feld, unerwünschte Verhaltensweisen, die vom Trinken, Abneigung gegen die orale Kontrastmittel ablenken zu halten und Unfähigkeit zu schlucken Parameter durch unzureichende Trinken Episoden zu quantifizieren.

    Eine der größten Herausforderungen bei der Beschaffung optimale VFSS Ergebnisse wurde die Gestaltung einer geeigneten Testkammer. Zahlreiche Änderungen unserer Prototyp-Design in einem Beobachtungsraum, der ausreichend hält Mäuse in das Blickfeld und verhindert, dass Verhaltensweisen, die vom Trinken ablenken gipfelte. Die Kammern wurden mit Fräsmaschinen, einheitliche Abmessungen ten erhalten hate Rohren und Endkappen, wodurch sichergestellt wird, Austauschbarkeit von Komponenten für mehrere Beobachtungskammern mit dem gleichen Durchmesser. Die Innenmaße (Durchmesser und Länge) wurden abgestimmt etwas größer als die Körpergröße eines Erwachsenen-Maus, die in einem engen Testkammer, die ausreichend ermöglicht zu Fuß in einer geraden Linie und drehte sich um führte zu sein. Das schmale Design, in Kombination mit der strategischen Positionierung der Tülle und peg-Schüssel nur am Ende, hält die Kopf und Körper von Mäusen, die entlang der Länge der Kammer ausgerichtet beim Trinken. Einmal in Trink engagiert bleiben Mäuse bemerkenswert selbst stabilisierte sich die Tülle oder Schale für einige Sekunden zu einer Zeit, was zu einer minimalen Bewegung Artefakt mit Tests stören. So ist es möglich, unverzerrten, close-up Beobachtung / Video-Aufzeichnung und videofluoroscopic Bildgebung von Mäusen beim Trinken in der lateralen und dorsalen-ventralen Flächen zu erhalten.

    Mäuse (und andere kleine Nagetiere) sind natürlich geneigt, um zu sehenk Schutz in kleinen Räumen. Als Ergebnis haben sie frei (mit einem Ende bereits durch eine Endkappe geschlossen ist), wenn es im Käfig angeordnet ist, um dadurch Stress / Angst durch die Handhabung (dh manuell Aufnehmen des Tieres, um es zu platzieren verursachte Beseitigung geben die Prüfkammer in der Kammer). Wenn die Maus in die Kammer eintritt, wird das andere Ende durch Anfügen einer 2. Endkappe verschlossen. Dieses Design verhindert Flucht während der Erstellung einer niedrigen Angst Prüfkammer für Mäuse, sich frei zu erkunden.

    Die quadratische Form der Kammer bietet integrierte Bewegungsstabilität, die sie in einem freistehenden Weise verwendet werden, wodurch die Notwendigkeit für die Prüfung innerhalb eines Standard-Nagerkäfig erlaubt. Die gesamte Vorrichtung ist leicht, tragbar, stapelbar zu Lagerzwecken, robust, leicht zu reinigen und kann autoklaviert werden. Während die Kammern wurden zunächst für den Einsatz mit Durchleuchtung entwickelt, auch sind sie mit Zielaufnahme, Neuroimaging (zB MRT, PET, CT) und Visualisierungs-kompatibell Beobachtung / Video-Aufzeichnung der verschiedenen Verhaltensweisen.

    Eine zweite große Herausforderung zu bewältigen war Maskierung des unangenehmen Geschmack / Geruch von oralen Kontrastmittel (dh, Bariumsulfat und Iohexol). Da die Geschmacksempfindlichkeit variiert zwischen Mausstämmen 19-21 und vielleicht mit dem Alter 22,23, war es notwendig, einen einzelnen Testlösung, schmackhaft zu allen Mäusen war, unabhängig von Stamm und Alter zu identifizieren. Dieses Ergebnis ist aufgrund der Unterschiede der rheologischen (zB Viskosität, Dichte, etc.) und die chemischen Eigenschaften der Testlösungen wichtig, ein direkter Vergleich der Schluckfunktion / Dysfunktion in Stämmen und Alter zu ermöglichen, während die Beseitigung verwirrende Ergebnisse. Zu diesem Zweck wird eine einfache, schnelle Schmackhaftigkeit Screening-Ansatz, um die bevorzugte Geschmacksverstärker, um den unangenehmen Geschmack / Geruch von oralen Kontrastmittel während der murinen VFSS Maske zu identifizieren entwickelt. Methoden wurden nach dem kurzzeitiger Tests, der einen lecken erfordert modelliertMeter (dh lecken Sensor) zu lecken Kurse während der ersten 2 Minuten nach einer Wasserregulierungsperiode (dh der Quellen Wasser über Nacht), um Durst 24,25 induzieren aufzuzeichnen. Ein lickometer nicht für diese Studie zur Verfügung; daher wurde Präferenz von Verhaltensbeobachtungen, sowie Standard-Video-Aufnahme-Methoden zur Leckrate, die zuvor in unserem Labor 13,14 validiert wurden bewertet. Mit dieser Schmackhaftigkeit Screening wurde Schokolade als bevorzugte Geschmacksverstärker von C57 und C57 / SJL Stämme identifiziert. Genauer gesagt, zu 100% der Mäuse in jedem Käfig leicht tranken Schokoladegeschmack Lösungen innerhalb von 30 sec der Belichtung mit mehreren Mäusen gleichzeitig trinken am Auslauf. Die Zugabe von Bariumhydroxid führte jedoch nur kurze Saufgelage von den meisten Mäusen, unabhängig davon, Barium oder Schokolade-Konzentration.

    Eine Alternative zu Barium ist Iohexol, eine Jod-basierte Kontrastmittel, das erst vor kurzem als sui anerkanntTabelle Alternative zu Bariumsulfat für die menschliche VFSS 10; Somit ist es noch nicht zu diesem Zweck standardisiert. Mehrere verschiedene Konzentrationen von mit Schokoladegeschmack Iohexol wurden Mäusen angeboten. Rezepte, die bis zu einem 50% igen Aktien Iohexol (350 mg Iod pro ml) wurden gut von den meisten Mäusen nach nächtlichem Wasserregulierungsperiode trank. Höhere Konzentrationen führte zu Vermeidungsverhalten. Eine 50% Iohexol (350 mg Iod pro ml) hergestellt ausreichende Röntgendichte, während sie von Mäusen verschluckt, während niedrigere Konzentrationen waren deutlich weniger sichtbar und erschwert die Quantifizierung von Schwalbe Physiologie. Deshalb wurde die optimale Testlösung VFSS mit Mäusen identifiziert, wie eine 50% ige Lösung von Iohexol mit Schokoladenaroma zugegeben. Wiederholen Sie die Schmackhaftigkeit Tests nicht in Vermeidungsverhalten oder Nebenwirkungen führen.

    Eine dritte Herausforderung zu überwinden, wurde vom Drehen / Kippen ihren Kopf, während Trinkwasser, die Visualisierung verdeckt verhindert Mäuseder Schluckmechanismus während VFSS. Trinken aus einer PEG-Schale positioniert knapp über dem Boden an einem Ende der Kammer dieses Problem gelöst. Es gibt einige zusätzliche Vorteile der Verwendung einer PEG-Schale statt eines Zuführungsschlauch Flasche. Zum Beispiel kann eine kalibrierte Flüssigkeitsvolumen in die Zapfenschale durch eine Belüftungsöffnung in der Endkappe des Beobachtungstubus pipettiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung des Minutenvolumens der Testlösung während der kurzen VFSS Testdauer verbraucht wird. Außerdem ist die erhöhte Oberfläche der Testlösung in der PEG-Schale, im Vergleich zu einer kleinen Zuführungsschlauch Öffnung kann erhöht ist olfaktorische Stimulation weiter motivieren Trinken. Peg-Schalen kann zur Untersuchung der jungen oder kleiner Dehnungs Mäusen besser geeignet, als die Schüssel Höhe ist eine standardisierte Abstand vom Boden. Im Gegensatz dazu müssen Zuführungsschlauch Längen eingestellt werden, um verschieden große Mäusen, die eine andere potentiell verwirrende Variable zu prüfen, fügt aufzunehmen. Auch Mausmodusls von neurologischen Erkrankungen können Schwierigkeiten Erreichen einer Zuführungsschlauch Flasche durch motorischen Beeinträchtigung der Gliedmaßen zu haben, während sie leicht erreichen können einen Stift Schüssel. Mäuse, die mit der Zunge und / oder Kieferfehlfunktion kann nicht in der Lage, den Ball in der Schnauze, um die Flüssigkeit zugreifen ausreichend zu drücken; mit peg-Schalen können diese verwechseln beseitigen. Aus diesen Gründen ist die Verwendung von PEG-Schalen über Zuführungsschlauch Flaschen die bevorzugte Methode der murine VFSS Tests. Jedoch wurden die Beobachtungskammern zur Tülle Trinkwasser aufnehmen nach Bedarf. Ein wichtiger Vorbehalt zu berücksichtigen, dass Leckraten sind dafür bekannt, zwischen Mittelkörper und Schale trinken 13,26 abweichen. Daher muss die Wahl zwischen Auslauf und peg-Schüssel für VFSS innerhalb der und zwischen den Experimenten zu sein.

    Eine vierte Herausforderung bestand darin, quantifizierbare Schwalbe Parameter für Mäuse, die vergleichbar mit den VFSS Parameter, die häufig in der Humanforschung und der klinischen Praxis verwendet werden, zu identifizieren. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dieArt der Durchleuchtungssystem bestimmt, welche Parameter bei Mäusen untersucht werden schlucken. Die meisten Forschungszentren und medizinischen Einrichtungen haben hohe Energie (75-95 kV, 1-5 mA) Fluoroskope für die Verwendung mit Menschen und größere Tiere, die in außergewöhnlich schlechten Bildqualität führen beim Test-Mäuse und andere Kleintiere konzipiert. Als Beispiel wurde eine aktuelle Studie mit einem Hochenergieröntgenapparat mit Ratten in der Lage, nur 4 quantifizierbare Schwalbe Parameter 12 zu identifizieren, und wir waren in der Lage, nur 7 Schwalbe Parameter für Mäuse in dieser vorliegenden Studie zu identifizieren. Um diese wichtige Einschränkung zu überwinden, vor kurzem erhielten wir einen niedrigen Energiedurchleuchtungssystem namens The LabScope (Glenbrook Technologies). Das System ist eine Miniaturröntgenapparat, der einen kontinuierlichen Kegelstrahl von Röntgenstrahlen mit Photonenenergien zwischen 15 und 40 kV und einer Spitzenröhrenstrom von 0,2 mA (8 W Maximalleistung) generiert. Die unteren Energieniveaus des Systems besser vom dünnen Knochen und Weichgewebe von Mäusen abgeschwächt und somit higher Kontrastauflösung als herkömmliche (dh hohe Energie) Fluoroskope. Das Röntgenstrahl der LabScope bei einer 5 cm Durchmesser Bildverstärker, die deutlich kleiner als die 15-57 cm Durchmesser Bildverstärker herkömmlicher Fluoroskope gerichtet. Die minimale Source-Verstärker Abstand (SID) des LabScope beträgt ~ 6 cm (im Gegensatz zu ca. 30 cm für herkömmliche Durchleuchtung), die bei Änderung der Vergrößerung Fähigkeiten bietet. Darüber hinaus nutzt die LabScope patentierte Technologie, die digital vergrößert das Bild bis zu 40-mal in Echtzeit, ohne dass die SID. Das Ergebnis ist im Wesentlichen ein Röntgenmikroskop, das in und in Echtzeit zu vergrößern kann, um kleine Bereiche von Interesse, wie der Schluckmechanismus einer Maus zu sehen.

    Ein großer Vorteil dieser Niedrigenergie-Durchleuchtungssystem Strahlenschutz verbessert. Neben den Tieren, die niedriger Strahlendosen mit The LabScope Forscher das System ausgesetzt sind, deutlich less Streustrahlung. Die Strahlenexposition direkt vor dem Objekt in dem Bedienfeld 10,3 mR / h. In einer Entfernung von 1 m vor der Einheit fällt Einwirkung von 580 & mgr; R / hr. Die meisten anderen Standorten im Zimmer haben einen sehr geringen Exposition unter 10 uR / h. Trotz dieser Verbesserung haben wir zusätzliche Maßnahmen zum Strahlenschutz zu verbessern. So wurde beispielsweise bleihaltige Acrylblenden an den LabScope hinzugefügt worden, um Streuröntgenphotonen, die Forschern ermöglicht, murine VFSS Tests ohne das Tragen der persönlichen Schutz führen (zB Bleischürzen, Schilddrüsen Schilde und Gläser) zu blockieren. Darüber hinaus ermöglicht die klare Acryl Visualisierung der Maus aus der Ferne. Weitere Strahlenschutz wird durch eine motorisierte Scherenhubtisch, die aus der Ferne vom Prüfer kontrolliert wird. Aus einer Entfernung von bis zu 3 m vom Fluoroskop können Forscher die ferngesteuerten Gerät benutzen, um die vertikale und horizontale Position der Beobachtungskammer im Röntgen bea justierenMeter Als ein Ergebnis können die anatomischen Regionen von Interesse innerhalb des Durchleuchtungssichtfeld gehalten werden, während die Maus frei innerhalb der Beobachtungskammer bewegt. Obwohl die Scherenhebebühne wurde für die Verwendung mit der LabScope entworfen, es ist auch für die Verwendung mit herkömmlichen Fluoroskope die Strahlungssicherheit für Forscher zu verbessern kompatibel. Ein letzter Schritt Strahlungssicherheit zu erhöhen während murine VFSS erfordert die Verwendung einer Spritze Abgabesystem für Flüssigkeiten. Dieses System beinhaltet eine 3-4 Fuß (oder länger, falls erforderlich) Länge der PE-Schlauch, die eine schnelle und effiziente Lieferung von Flüssigkeiten in die Zapfenschale aus der Ferne ermöglicht. Diese Spritze Abgabesystem für Flüssigkeiten, in Verbindung mit der Beobachtungskammer, die auch mit herkömmlichen Fluoroskope verwendet werden.

    Vorarbeiten mit The LabScope, in Kombination mit der neuen Maus VFSS Protokoll, zeigt einen großen Vorteil gegenüber herkömmlichen Systemen: Die Anzahl der Parameter, die schlucken verlässlich quantifizieren lassen, is nahezu verdoppelt. , Weichgewebestrukturen des Schluckmechanismus (beispielsweise Sprache, Velum Pharynxhinterwand und Epiglottis) von Mäusen, sind jedoch nicht ohne weiteres sichtbar ist, wenn mit niedriger oder hoher Energie Durchleuchtungssysteme. Daher konzentrierten wir uns auf die Quantifizierung Bolus Fluss Maßnahmen als die Biomechanik beim Schlucken. Wir waren vor allem interessiert an Parametern, die auf Basis von Zeiteinheiten, Fläche, Abstand, Volumen etc., anstatt Skala misst Likert-quantifiziert werden konnte. Zahlreiche Bolus Strömungsparameter diese Anforderung erfüllen, sind im menschlichen VFSS Literatur beschrieben, wie orale Laufzeit von 27 bis 29, Rachen Laufzeit von 27 bis 33 und Ösophagus-Transit-Zeit von 34 bis 36, um nur einige zu nennen. Bolustransport durch die Mundhöhle nicht bei Mäusen ohne weiteres sichtbar, wahrscheinlich aufgrund der geringen Größe Bolus während der spontanen Trinken. Allerdings waren wir in der Lage, zuverlässig zu quantifizieren Rachen- und Speiseröhrenlaufzeiten sowiemehrere andere Maßnahmen in Bezug auf Bolus Fluss und Clearance. Identifizierung zusätzlicher Translationsschluckparametern erwartet wird, da wir die Optimierung der Funktionen der LabScope.

    Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass Mäuse nehmen mehrere rhythmische Licks pro schlucken während der spontanen trinken, mit jedem kleinen Flüssigkeits Bolus nacheinander Befüllen des vallecular Platz vor dem Auslösen der pharyngealen schlucken. Dieses Verhalten, das typisch für Säugetiere, die als primäres Mittel der Einnahme von Flüssigkeit 37-40 lecken verwenden ist, ähnelt der rhythmischen Saug-Schluck-Muster des menschlichen Säuglings Schlucken und alle Säuglings Säugetieren im Allgemeinen. Infant Schlucken Physiologie ist durch mehrere rhythmische gekennzeichnet saugt durch eine reflexive Rachen Schwalbe folgt, allgemein bekannt als der Saug-Schluck Zyklus 37,41-43 beschrieben. So können die rhythmische Zunge und Kieferbewegungen in der Nahrungsaufnahme Lecken Verhaltensweisen von Mäusen beteiligt besser vergleichbar sein, saugen Verhaltensweisen hum Nahrungsaufnahmeein Kleinkindern statt Tasse trinken von Kindern und Erwachsenen. Wir haben daher die Quantifizierung der Leckrate und lecken schlucken Verhältnis von Mäusen für zukünftige Vergleiche mit dem saugen Rate und Saug-Schluck-Verhältnis von Menschenkinder. Vielleicht murine VFSS Forschung Einblicke in Entwicklungsschluckstörungen bieten.

    Wie bei jeder neuen Forschungsmethode, haben Verbesserungsbereiche identifiziert. Zum Beispiel wurde das murine VFSS-Protokoll nur C57 und C57 / SJL Mäusestämmen entwickelt; Es ist noch nicht mit Ratten getestet. Die Beobachtungskammern müssen bis in der Größe (Durchmesser und Länge) skaliert werden, um die größere Körpergröße von Ratten unterzubringen. Außerdem ist es nicht bekannt, ob Schokoladegeschmack Iohexol ist als Universal murine VFSS Testlösung geeignet. Daher wird in größerem Maßstab Tests mit mehreren Stämmen von Mäusen und Ratten zu diesem Zweck gewährleistet. Auch sollte die Verwendung von Bariumsulfat als Kontrastmittel für murines VFSS nicht ausgeschlossen werden. Mäuse Bemühungen der iohexol Rezepte über Barium; jedoch strenger und systematische Versuche zur Maskierung des unangenehmen Geschmack / Geruch von Barium kann schmackhaft Alternativen zu Iohexol werden. Zukünftige Studien zum Vergleich der Auswirkungen von Iohexol und Bariumsulfat (sowie andere potenzielle orale Kontrastmittel) auf Geschmacksvorlieben und schlucken Physiologie bei Mäusen und Ratten zweifellos wichtige Informationen, die direkt relevant und translationale der menschlichen VFSS ist.

    VFSS mit Menschen beinhaltet verschiedene Konsistenzen von Lebensmitteln und Flüssigkeit und Dysphagie am deutlichsten beim Schlucken dünne Flüssigkeiten und trockene, feste Nahrung 44,45. Die murine VFSS Protokoll wird daher erweitert, um zusätzliche Konsistenzen, die Detektion und Quantifizierung von Dysphagie in Krankheitsmodellen erleichtern können, umfassen. Es wird auch notwendig sein, um die Viskosität der flüssigen Test Rezepte für murine VFSS, um die Viskosität einzustellen, um die während der menschlichen VFSS timmen durch. Bewältigung dieser Grenzetionen wird die Identifizierung der Translations VFSS Biomarker von Dysphagie, die direkt zwischen Mäusen, Ratten und Menschen, verglichen werden können, erleichtern.

    Die Nützlichkeit der murine VFSS signifikant durch Implantieren radiopaken Markierungen in Weichgewebestrukturen des Schluckmechanismus die sonst nicht sichtbar sind, wodurch eine Untersuchung der Biomechanik des Schluck verbessert werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich seit vielen Jahren verwendet, um die Biomechanik des Schluckens in Säuglings Schweine, mit einem Sortiment von Metallklammern und Leitungen 37,42 zu studieren. Wir erwarten, dass die Verwendung von ähnlichen, aber kleineren Markierungen in Mäusen würde Quantifizierung mehrerer zusätzlicher Schluckparameter zum Vergleich mit größeren Säugetieren, einschließlich des Menschen zulassen. Wir entwickeln Methoden zur Implantation Röntgenmarker in die Zunge, des weichen Gaumens, Rachen, Kehlkopf, und proximalen Ösophagus von Mäusen, um diese Hypothese zu testen.

    Das Video recording Bildrate der LabScope und konventionelle Durchleuchtung ist auf 30 Frames pro Sekunde (fps). Jedoch Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass die gesamte pharyngealen Phase des Schluckens für gesunde Mäuse innerhalb von weniger als 66 ms (dh 2 Frames), was etwa 10 mal schneller als der Mensch ist auftritt. Daher tritt die Rachen Phase des Schluckens bei Mäusen so schnell, dass die Angaben nicht mit einer nennenswerten 30 fps Kamera. Eine höhere Bildrate (Wahrscheinlichkeit> 100 fps) sind notwendig, um ausreichend zu visualisieren und zu quantifizieren, die extrem schnelle und komplexe Bewegungen des pharyngealen Phase des Schluckens in Mäuse und andere Nagetiere. In Verbindung mit einer höheren Bildrate unter Einbeziehung biplanaren Technologie für 3D-Durchleuchtung wäre sicherlich erweitern den Nutzen murine VFSS. Daher sollten künftige Design-Überlegungen eine höhere Bildrate der Kamera und biplanaren Imaging-Funktionen umfassen.

    Schließlich niedrig dosierte Strahlung hat sich gezeigt, Sterilität verursachenweibliche C57 Mäusen, was zu veränderten Spiegeln von Eierstock-stimulierte Hormone, die Lebensdauer Studien 46 verwechseln kann. Ergebnisse im Zusammenhang speziell auf die Auswirkungen der wiederholten niedrig dosierte Bestrahlung mit VFSS Testung noch nicht bei Mäusen, andere Tiere oder den Menschen untersucht. Allerdings hat Eierstockstörungen bei Frauen (nicht auf Strahlenbelastung bezogen) zu Magen-Darm-Motilitätsstörungen in Verbindung gebracht worden, und speziell auf Dysphagie in einigen Fällen 47, die noch eine weitere Einschränkung stellt die bei der Gestaltung zukünftiger VFSS Studien, dass Frauen (Tiere und Menschen sind ). Ausschluss von Frauen sollte vermieden werden, da erhebliche geschlechtsspezifische Unterschiede bei Schwalbe Funktion haben für Menschen, 48,49 berichtet, und wäre es wichtig, zu erkennen und zu charakterisieren, in Tiermodellen Krankheit auch. Daher Ergebnisse von Längs VFSS Studien an Mäusen und Ratten beider Geschlechter haben enorme translationale Potenzial für den Menschen in Bezug auf dysphagia sowie auf die Risiken von niedrig dosiertem Strahlenbelastung mit Wiederholungs VFSS Testung.

    Disclosures

    Open Access für diesen Artikel wird von Glenbrook gesponsert.

    Acknowledgments

    Wir danken gnädig weitere Mitglieder des Hebel Lab, die Datensammlung beigetragen (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce und Matan Kadosh) und Manuskript Kritik (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, und Kate Robbins). Wir erkennen auch Roderic Schlotzhauer und Edwin Honse vom MU Physik Machine Shop für ihr Design Eingang und Fertigung der Nager Beobachtungsrohre in dieser Studie verwendet. Wir sind besonders dankbar für Malea Jan Kunkel (Radiologie Betreuer in der Tiermedizin und Chirurgie Fachbereich an der Universität von Missouri - College of Veterinary Medicine) und Jan Ivey (Leiter des Forschungstierkatheterlabor an der Universität von Missouri - School of Medicine) für den Nachweis der konstanten Geduld und Motivation während der Betätigung der hohen Energie Fluoroskope wie wir das murine VFSS Protokoll entwickelt. Finanzierungsquellen für diese Studie eingeschlossen NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / NINDS (GK Pavlath) Otolaryngologie - Head and Neck Surgery Anschubfinanzierung (TE Lever), MU PRIME Fonds (TE Lever), Mizzou Vorteil (TE-Hebel) und die MU auf dem Altern (TE-Hebel).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Polycarbonate tubing for observation chambers McMaster-Carr 3161T41 Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall
    Polycarbonate sheet  for observation chambers McMaster-Carr 9115K71 End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4"
    Polycarbonate sheet  for observation chambers McMaster-Carr 8574K281 Peg-bowls for observation tubes
    Silicone O-rings  for end-caps of observation chambers McMaster-Carr 9396K108 S1138 AS568-029, pack of 25
    http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r 
    Silicone stoppers for observation chambers McMaster-Carr 2903K22 Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl
    http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
    Centrifuge tubes for sipper tube bottles Evergreen Scientific 222-3530-G80 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile
    https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ 
    Silcone stoppers for sipper tube bottles Saint-Gobain Performance Plastics DX263031-10  Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; 
    http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
    Stopper borers for sipper tube bottles Thomas Scientific 3276G40 Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch 
    http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
    Drinking tubes for sipper tube bottles Ancare TD-100  2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout
    http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point 
    Iohexol for making oral contrast agent solution GE Healthcare 350 mg iodine per ml
    http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque 
    Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent Herseys
    10 ml syringe for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 309604 Luer lock tip syringe without needle, 100 per box
    http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
    Catheter tubing for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 427451 Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100'
    http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp 
    Needle for syringe delivery system Becton, Dickinson and Company 427560 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing
    http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp 
    Delrin acetal resin rod for syringe delivery system McMaster-Carr 8576K15 1/2 inch diameter, black
    http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf 
    Acrylic sheeting for scissor lift Ponoko Laser cut
    http://www.ponoko.com 
    3D printed ABS frame Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
    Brass rods for scissor lift Amazon TTRB-03-12-03 made into axles
    http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
    Drawer slide for scissor lift Richelieu 10292G116 Attaches to base of scissor lift
    http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
    28BYJ-48 stepper motor for scissor lift 2 each
    ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift Toshiba ULN2003APG Used as stepper drivers (2 each)
    ATTINY85 microcontroller for scissor lift Atmel ATTINY85-20PU 2 each
    http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
    Nylon spur gear McMaster-Carr 57655K34 2 each
    http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
    Nylon spur gear rack McMaster-Carr 57655K62 2 each
    http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
    4-40 nylon machine screws McMaster-Carr 95133A315 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
    4-40 nylon hex nuts McMaster-Carr 94812A200 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
    Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 McMaster-Carr 9452K318 Lift assembly
    http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7

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