Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

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Degrandi-Hoffman, G., Eckholm, B., Huang, M. Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers. J. Vis. Exp. (97), e52448, doi:10.3791/52448 (2015).

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Abstract

Le api da miele ottenere nutrienti dal polline che raccolgono e conservare in alveare come beebread. Abbiamo sviluppato metodi per controllare la fonte di polline che le api raccolgono e convertono beebread mettendo colonie in una zona chiusa volo appositamente costruito. I metodi sono stati sviluppati per analizzare le proteine ​​e aminoacidi composizione acida del polline e pappa reale di api. Descriviamo inoltre come il consumo del beebread è stata misurata e metodi utilizzati per determinare operaie adulte titoli proteine ​​ape emolinfa dopo nutrendosi di beebread per 4, 7 e 11 giorni dopo la nascita. I metodi sono stati applicati per determinare se il genotipo riguarda la conversione di polline beebread e il tasso api consumano e acquisiscono proteina da esso. Due sottospecie (api mellifere europee e africanizzate, EHB e AHB rispettivamente) sono stati forniti con la stessa fonte di polline. Sulla base dei metodi sviluppati, beebread fatta da entrambe le sottospecie aveva concentrazioni di proteine ​​più bassi e valori di pH che il polline. In generale, ammino con acidocentrazioni in beebread prese dal EHB o AHB erano simili e si sono verificate a livelli superiori a beebread che nel polline. Sia AHB e EHB consumato significativamente più del beebread fatta da AHB che da EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, concentrazioni di proteine ​​emolinfa in AHB erano superiori a EHB. Le differenze di acquisizione delle proteine ​​tra AHB e EHB potrebbero riflettere adattamenti ambientali legati alla regione geografica dove ogni sottospecie si sono evoluti. Queste differenze potrebbero contribuire alla creazione di successo delle popolazioni AHB nel Nuovo Mondo a causa degli effetti sulla covata allevamento e la crescita delle colonie.

Introduction

La nutrizione gioca un ruolo fondamentale nella salute e il vigore di miele colonie di api e nel loro stabilimento come popolazioni. Nutrienti dal cibo forniscono energia e componenti biochimici necessari per allevamento della covata, termoregolazione, foraggiamento e la risposta immunitaria. Per miele colonie di api, i nutrienti necessari per crescere popolazioni delle colonie e mantenere la loro salute viene da nettare e polline. Nettare fornisce carboidrati e polline fornisce le esigenze alimentari restanti quali proteine, lipidi, vitamine e minerali 1.

Sottospecie di api possono differire nei parametri a livello di colonia a base nutrizionale come la longevità lavoratore, covata allevamento, e meccanismi di immunità sociale 2-6. Queste differenze possono essere collegati a come il cibo, specialmente il polline viene elaborato dalla colonia e digerito in individui. Il polline è immagazzinato nelle cellule pettine e attraverso microbiologicamente mediato fermentazione lattica viene modificato chimicamente 11-14.

Qui si descrivono i metodi utilizzati per confrontare la composizione e il consumo di beebread fatta da diverse sottospecie di api. Metodi per misurare le conseguenti emolinfa titoli di proteine ​​in api operaie sono anche descritti. Precedenti studi sulla composizione nutrizionale del beebread sono stati fatti con le api europee miele (EHB) 10,15,16. Tuttavia, ci possono essere differenze di beebread fatta da api di diverse sottospecie, anche quando si nutrono lo stesso polline. EHB e AHB sono stati confrontati, perché questi subwooferpecies hanno differenze comportamentali e fisiologiche distinte che potrebbero essere collegati alla trasformazione dei prodotti alimentari e dei nutrienti acquisizione 17. Alcune delle differenze più importanti sono che AHB raccogliere e consumare più polline di EHB e sembrano per convertire più facilmente in covata 18. Colonie AHB hanno tassi più elevati rispetto brulicanti EHB e tentare la fuga, quando le risorse alimentari diventano limitate 19-23. Fuga è rara in EHB. AHB hanno anche tassi metabolici più elevati rispetto EHB 24. La base nutrizionale per le differenze a livello di colonia tra EHB e AHB potrebbe essere correlato al tasso di raccolta del polline e anche per il suo contenuto di nutrienti (ad esempio, aminoacidi e proteine) dopo che è stato convertito in beebread. Consumo beebread e la conseguente acquisizione di proteine ​​anche potrebbero svolgere un ruolo nelle differenze a livello di colonia tra EHB e AHB. Utilizzando i metodi sviluppati, EHB e AHB reso beebread dalla stessa fonte di polline. La pappa reale di api è stata reimmessa alle api di each sottospecie e potrebbe determinare se api acquisiscono proteine ​​da beebread in modo distintivo ai loro sottospecie o alla fonte del beebread.

Protocol

1. Ottenere beebread da AHB e EHB Colonie

  1. Mettere trappole polline sul miele colonie di api e raccogliere il polline. Macinare il polline in una polvere fine (simile a polline far da antere) con un macinino da caffè.
  2. Stabilire 5 colonie ciascuno di AHB e EHB in un'area recintata di volo (EFA), in modo che le api foraggio solo sul polline fornito. Per evitare che i lavoratori alla deriva tra EHB e colonie AHB, dividere la EFA in sezioni separate, in modo che le api non possono attraversare tra di loro. Mettere EHB individuo o colonie AHB con 3500-4000 api operaie, pettine di cera con nettare, miele, covata immaturo e pettine vuoto in ogni sezione del EFA.
    NOTA: Le colonie non hanno conservato il polline quando stabilito. La velocità che il polline viene memorizzato può essere aumentato di non includendo una regina, che nelle colonie.
  3. Feed polline terra per colonie inserendo un vassoio con il polline in ogni sezione del EFA. Diffusione circa 60 g di polline su ciascun vassoio in modo che foraging api possono ritirarla carichi come corbicular e conservare il polline nelle loro colonie come beebread. Continuare fornendo polline fresco su ciascun vassoio giorno per 3 settimane.
  4. Fare riferimento alle beebread dalle colonie europee beebread europeo (EBB), e da colonie africanizzate come beebread africanizzate (ABB).

2. Api di alimentazione in gabbie

  1. Luogo fotogrammi di sigillato covata lavoratore AHB e EHB colonie in gabbie emergenza separati in una camera ambientale fissati a 32-34 ° C e il 40% di umidità relativa ..
  2. Quando gli operai emergono e sono circa 24 ore di età, stabilire 12 plexiglas biodosaggio gabbie (dimensioni = 11,5 x 7,5 x 16,5 centimetri 3) e aggiungere o 100 EHB appena emerse o 100 nuovi emersi AHB api operaie per ogni gabbia. Mettere una sezione di pettine con un numero noto di cellule sia EBB o ABB (24-30 cellule per gabbia) in ogni gabbia per generare le seguenti combinazioni di trattamento: AHB fed ABB, EHB fed ABB, AHB nutriti EBB e EHB fed EBB. (4 trattamenti; 6gabbie per il trattamento; 24 gabbie in totale).
  3. Aggiungi fiale di acqua e un miele del 50% e la soluzione di acqua formulati in volume per ogni gabbia. Riempire i flaconi miele e acqua al giorno per il periodo di studio 11 giorni.

3. Api campionamento dei lavoratori e beebread e stima del consumo

  1. Esempio 10 recentemente emerse EHB e AHB lavoratori prima di metterli nelle gabbie. Fare riferimento a questi come giorno 0 api e li servono come base per concentrazioni di proteine ​​emolinfa.
  2. Rimuovere 10 api da ogni gabbia dopo che nutrivano EBB o ABB per 4, 7, e 11 giorni.
  3. Posizionare le api vive in tubi microcentrifuga individuali e impostare su impacchi di ghiaccio. Selezionare un sottocampione di quattro api per l'analisi della concentrazione di proteine ​​emolinfa.
  4. Dopo aver assaggiato le api il giorno-11, contare il numero di celle a pettine che contengono ancora beebread. Si tratta di una misura relativa del consumo beebread.
  5. Rimuovere il beebread restante dalle cellule in ogni gabbia e memorizzare in SEPARmangiato microprovette secondo gabbia. Mantenere i campioni beebread a -80 ° C fino al momento dell'analisi per pH, concentrazione di proteine ​​solubili, e il contenuto di amminoacidi.

4. Stima pH di polline e pappa reale di api

  1. Prendete sei casuali 0,3 g campioni di polline alimentato per le api nel EFA e farla sciogliere in 300 ml di acqua distillata. Misurare il pH con un impermeabile doppia giunzione pH lancia con una precisione di 0,01.
  2. Prendere 0,3 g campione di beebread che è rimasto dopo il periodo di alimentazione di 11 giorni in ogni gabbia. Sciogliere il beebread in 300 ml di acqua distillata e la misura del pH come descritto per polline (4.1).

Analisi 5. Proteine

  1. Prendete sei campioni di polline e di un campione di EBB e ABB da ogni gabbia. Conservare i campioni a -20 ° C fino analizzati per la concentrazione di proteina solubile.
  2. Mescolare 20 mg di una polline o beebread con 1.000 ml di 0,1 M tampone fosfato (PBS).
  3. VoRTEX la miscela per 10 secondi e centrifugare a 571,2 g per 1 min.
  4. Rimuovere un campione di 10 ml del surnatante e posto in pozzetti di una ben fondo piatto lastra di polistirene 96 EIA / RIA. Replicare ogni campione in tre pozzi.
  5. Disegnare emolinfa dalle api raccolte da ogni gabbia inserendo un tubo capillare 20 microlitri (che era stato riscaldato e tirato ad un punto ago-sharp) nella porzione laterale destra del torace vicino al punto di attacco delle ali. Raccogliere emolinfa aggiuntivo, se necessario, inserendo lo stesso tubo nella membrana tra le tergiti addominali.
  6. Aggiungere 1 ml di emolinfa a 9 ml di 0,1 M PBS. Conservare la soluzione emolinfa a -20 ° C fino all'analisi per proteina solubile.
  7. Determinare totale concentrazioni di proteine ​​solubili nel polline, pappa reale di api, e campioni emolinfa utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​Bradford commerciale. Seguire le istruzioni del produttore.
  8. Stabilire una curva standard per stimare proteina solubile concentration nei campioni misurando proteina assorbanza con concentrazioni di proteine ​​note in albumina di siero bovino (BSA). Misurare proteina assorbanza a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro.

6. Amino Acid Analysis

  1. Piscina campioni individuali da cellule favo di ogni colonia per creare un campione rappresentativo di EBB e ABB per l'analisi.
  2. Prendete un 50 mg di polline o campione beebread pesato in vial, e aggiungere 1 ml di acqua distillata al flacone, insieme a 100 ml di una soluzione di 50 ng / ml di standard interno costituito da d 4 -alanina, d 23 Acido -lauric, 13 C 6 Glucosio e d 39 acido -arachidiac.
  3. Tappare il campione e ultrasuoni per 5 min.
  4. Presupposti una cartuccia HLB aggiungendo 1 ml di metanolo, equilibrato aggiungendo 1 ml di acqua distillata seguita dalla aggiunta di 1 ml del campione beebread o il polline. Lavare la cartuccia con 1 ml di 5,0% MeOH / H 2 O e Elute con 1 ml di 80% MeOH / H 2 O.
  5. Evaporare il campione a secco sotto corrente di azoto. Ricostituire il campione con 50 ml di piridina e 100 ml di N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetammide + Trimetilclorosilano (BSTFA + TMCS).
  6. Cap e incubare il campione a 70 ° C per 30 min.
  7. Lasciare raffreddare il campione e trasferirlo ad un campionatore provetta pulita.
  8. Cap e posizionare il campione in un rivelatore selettivo di massa interfacciati ad un gas cromatografo per analizzare i campioni sia per i composti volatili e acidi organici. Separare gli zuccheri e acidi organici seguenti TMS derivatizzazione con BSTFA + TMCS usando una colonna (30 mx 0,25 mm di diametro) con spessore 1,0 micron pellicola.
  9. Impostare il forno a colonna a 50 ° C per 2 min, quindi aumentare la temperatura linearmente a 290 ° C a 5 C / min. e tenere premuto per 7 min. Impostare l'iniettore GC e GC interfaccia / MS a 250 ° C e 290 ° C rispettivamente.
    1. Utilizzare elio come vettore in un flotasso w di 1,0 ml / min. Impostare la temperatura della sorgente di MS a 230 ° C.
  10. Tune e calibrare lo spettrometro di massa ogni giorno con perflurotributilammina (parte dell'PFTBA). Utilizzare una iniezione 1 ml di parte dell'PFTBA nella scansione completa (35-700 amu) modalità ioni positivi per ottenere dati sulla presenza e concentrazione di aminoacidi.

Representative Results

Beebread stato immagazzinato nel -80 ° C per meno di un mese prima di essere analizzati per pH e la concentrazione di proteine, e per circa 4 mesi prima analisi degli aminoacidi. Beebread differiva dal polline in pH e concentrazione di proteine ​​(Figura 1). Il pH beebread era inferiore al polline era la concentrazione di proteine. Sia EHB e AHB consumato più ABB di EBB (Figura 2).

I livelli di proteina solubile nel emolinfa di AHB erano significativamente superiori EHB indipendentemente dal tipo di beebread hanno consumato (figura 3). Queste differenze nei livelli di proteina emolinfa si sono verificati anche se EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread. L'età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Le concentrazioni di proteine ​​erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto al giorno 7 o 11 che non differiscono.

_content "> Dei 10 amminoacidi che sono essenziali per api, tutti tranne istidina sono stati rilevati nel polline. Nella maggior parte dei casi, le concentrazioni di aminoacidi misurate in beebread erano superiori nel polline (figura 4). Per esempio, le concentrazioni di leucina e treonina erano superiori di circa il 60% in beebread rispetto al polline, e valina concentrazioni erano superiori di circa il 25%. alanina, acido livelli, glutammina, metionina e aspartico anche erano superiori in beebread che nel polline. concentrazioni Aminoacidi non differiscono notevolmente tra ABB e EBB con l'eccezione di fenilalanina e cisteina. livelli di fenilalanina erano circa il doppio in ABB rispetto sia con EBB o polline. Le concentrazioni cisteina erano inferiori in EBB rispetto a ABB o polline. triptofano era l'unico aminoacido presente in concentrazioni più elevate in polline che in EBB o ABB. Le concentrazioni di prolina in polline e ABB erano superiori in EBB.


Figura 1: Confronti di pH (A) e le concentrazioni di proteine ​​solubili (B) nel polline e pappa reale di api da parte europea (EHB) o Africanized (AHB) api. Il pH di polline era significativamente superiore alla beebread come determinato mediante analisi della varianza (F 2,12 = 3725, p <0,0001) seguito da un test di confronto multiplo Tukeys W-. La concentrazione di proteine ​​nel polline era significativamente più alta rispetto a beebread fatta da EHB (EBB) o AHB (ABB) (F = 2,27 16.49; p <0.0001). Mezzi seguiti dalla stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05.

Figura 2
Figura 2: La percentuale media di cells contenenti beebread che sono state completamente consumato in un intervallo 11 giorni dalle api in gabbia. La beebread è stata fatta da uno europeo (EHB) o Africanized (AHB) le api utilizzano la stessa sorgente di polline. Mezzi sono stati stimati da cinque gabbie di ogni trattamento; quelli con la stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05 come determinato da un'analisi uno della varianza (F 3,16 = 7.3, p = 0,003) e W test di Tukey. Questa figura è stata modificata da 25.

Figura 3
Figura 3: la concentrazione media di proteine ​​in emolinfa da europeo (EHB) o Africanized (AHB) api mellifere beebread alimentato fatta da africanizzate (ABB) api europeo (EBB) o per 4, 7, e 11 giorni Una analisi ripetute misure di. varianza ha indicato differenze significative tra il 4 treagruppi TIMENTO (F 3,20 = 19,7, p <0.001). I livelli di proteina solubile in AHB fed ABB erano significativamente superiori a EHB fed ABB (p = 0.008) o EBB (p = 0,018). L'età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Livelli erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto ai giorni-7 (p <0,0001) o 11 (p = 0.001). Giorno 7 e Day11 api non differivano (p = 0,149). Questa cifra è stata modificata da 25.

Figura 4
Figura 4:. Concentrazioni di aminoacidi (mcg per grammo di polline o beebread) nel polline o beebread fatta da esso EBB è beebread fatta dalle api europee e ABB è stata fatta dalle api africanizzate. Triptofano, cisteina, fenilalanina e prolina sono state tracciate separatamente a fini di chiarezza in presentano loro quantità. Questa cifra è stata modificata da 25.

Discussion

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo scoperto che il beebread fatta da AHB è stato consumato in quantità maggiore da parte sia AHB e EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, AHB aveva maggiori emolinfa titoli di proteine. I risultati basati sui nostri metodi erano simili ai precedenti, dove i livelli di proteina emolinfa in AHB erano superiori in EHB se entrambi sono stati alimentati la stessa dieta 26. Misurando il consumo di EBB e ABB che sono stati consumati a velocità diverse da parte sia EHB e AHB, è stato stabilito che la concentrazione di proteine ​​emolinfa in ogni sottospecie non poteva essere sollevata, aumentando il consumo di cibo. Sembra che ci sia un plateau di concentrazione di proteine ​​emolinfa in lavoratori di età infermiere api e che il set point per l'altopiano è più alto in AHB di EHB.

Ci sono diverse condizioni importanti per stabilire colonie per la produzione di pappa reale di api che ottimizzano la velocità di archiviazione polline. Innanzitutto, la colonies bisogno telai con covata aperta. Senza covata aperta per nutrire, i lavoratori non raccoglie molto polline. In secondo luogo, la colonia deve essere queenless quindi non covata addizionale viene prodotto. Brood allevamento richiede grandi quantità di polline, e solo il polline in eccesso viene immagazzinata. Nelle piccole colonie stabilite in EFA, ci sarebbe poco di polline deve essere conservato come beebread se le aree di covata sono state espandendo così le colonie devono essere queenless. Infine, per beebread da effettuare, il polline deve essere raccolto come carichi corbicular e conservato in celle pettine. Se il polline viene raccolto in trappole polline, deve essere ridotta in polvere fine, prima di fare le api modo che possano raccogliere come carichi corbicular.

I metodi per misurare il consumo di beebread generato qualitative piuttosto che stime assolute. L'unico consumo che è stato contato è stato quando le cellule sono state completamente svuotate di pane d'api. Una stima più accurata del consumo totale pane ape può essere ottenuta rimuovendo il br apeead dalle cellule e farne una polpetta che potrebbe essere pesati prima e dopo il periodo di studio. Tuttavia, abbiamo voluto mantenere il pane ape nelle cellule in modo che le api potrebbero nutrirsi di esso come farebbero in una colonia e forse continuare l'elaborazione durante il periodo di studio. La differenza di peso delle sezioni pettine prima e dopo lo studio non è stato usato come stima del consumo perché il peso potrebbe aumentare perché api mettere il miele diluito alimentato loro in alcune cellule.

I lavoratori potrebbero anche hanno aggiunto alcuni del miele diluito al pane d'api. Per queste ragioni, cellule contenenti approssimativamente uguali quantità di pane ape prima e dopo il periodo di alimentazione sono state contate e generati una misura qualitativa. Tuttavia, vi era una differenza evidente tra i due tipi di beebread del numero di celle vuote ABB contate rispetto EBB dopo 11 giorni.

Determinare quando polline conservato diventa beebread può essere difficult perché le api aggiungono continuamente polline per le cellule. Le colonie usate per la produzione di pappa reale di api sono state stabilite con cornici di covata aperte così le api sarebbero raccogliere il polline. Tuttavia, le colonie erano queenless quindi c'erano larve per alimentare solo per circa 9 giorni dopo la colonia è stata stabilita. Per il resto del periodo di 3 settimane, quando le colonie erano in EFA, il polline che le api raccolti sono stati conservati e di essere convertiti in beebread. Mantenere il polline immagazzinato nelle cellule pettine per ulteriori 11 giorni in cui l'alimentazione è per le api in gabbie anche può aver continuato il trattamento di polline beebread. La conversione di polline al pane d'api richiede circa 7 giorni 8. Il beebread alimentato a EHB e AHB aveva minore pH e concentrazioni di proteine ​​ridotte rispetto alla Fed polline. Risultati simili di cambiamenti nel polline dopo beebread conversione sono stati segnalati da altri 7,10,27. I nostri risultati differiscono da precedenti relazioni tuttavia, in che c'erano differenze nelle concentrazioni of alcuni aminoacidi tra beebread e polline. I cambiamenti in entrambe le concentrazioni di acido proteine ​​e aminoacidi potrebbe essere dovuta all'attività di enzimi proteolitici, la cui fonte potrebbe essere le api stesse o delle comunità microbiche stabiliti nel beebread 7,8,28,29.

I metodi utilizzati per misurare la concentrazione della proteina erano simili a quelli precedentemente descritti per determinare gli effetti di proteine ​​alimentari su Africanized e api europee 26. Come estensione dei metodi, siamo stati in grado di stimare proteina solubile nel polline e pappa reale di api. Tali metodi hanno generato risultati simili a precedenti rapporti 7,10,27. I nostri risultati forniscono ulteriori prove che AHB più efficiente assimilare proteine ​​nella dieta di EHB, e che questo potrebbe essere un fattore chiave per il dominio ecologico di AHB nella maggior parte delle regioni in cui è emigrato e affermata 30-32.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
waterproof double junction pH spear  Thermo Fisher
Coffee Grinder Mr. Coffee  model 1DS77
Dulbecco's phosphate buffer solution Emd-millipore BSS-1005-B
EIA/RIA polystyrene plate Sigma-Aldrich-Corning CLS3590-100EA
microcapillary pipets Kimble Glass Inc.
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2  Bio-Rad #500-0202
Spectrophotometer Biotek Synergy HT 
Mass Selective Detector  Agilent 5973N
HLB cartridge
gas chromatograph  Agilent 6930
 gas chromatography column  A J&W Scientific  DB-1701
d4-alanine  Sigma-Aldrich 488917
d23-lauric acid Sigma-Aldrich 451401
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374
Pyridine  Sigma-Aldrich 270970
N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +  
Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) Sigma-Aldrich 33148
Perfluorotributylamine (PFTBA) Sigma-Aldrich 442747-U
d39-arachidiac acid Cambridge Isotope 

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References

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