封装产热前脂肪细胞移植到脂肪组织仓库

1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University
Published 6/02/2015
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Medicine

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Summary

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Xu, L., Shen, Q., Mao, Z., Lee, L. J., Ziouzenkova, O. Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots. J. Vis. Exp. (100), e52806, doi:10.3791/52806 (2015).

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Abstract

电池封装的开发是为了半透膜中俘获的活细胞。嫁接封装细胞所用的处理过的宿主组织中交换的低分子量代谢物,以达到长期存活。半透膜允许移入的封装细胞以避免排斥反应的免疫系统。封装过程是为了使生物活性化合物,诸如胰岛素,其他激素和细胞因子的受控释放。在这里,我们描述了用于分解代谢细胞,其消耗的脂质为产热和能量耗散(产热)的肥胖小鼠的腹腔内脂肪组织的封装的方法。产热分解代谢的细胞封装可能潜在地适用于肥胖的预防和治疗2型糖尿病。分解代谢细胞的另一个潜在的应用可​​以包括由醇或其他有毒的代谢物和环境污染物解毒。

Introduction

慢性疾病1发病率越来越高已经加强了对治疗的细胞群2的移植。同源或异基因干细胞可用于这些应用2中最常用的细胞类型。然而,这些治疗不允许分化和干细胞的迁移植入后的控制,并没有成本效益。遗传修饰的细胞与有益功能的移植预期改善许多疾病的治疗。然而,遗传细胞修饰由宿主的免疫系统所识别,因此,这些处理需要免疫抑制3。细胞产生胰岛素的封装已经制定了张大夫4。该技术是基于细胞的藻酸盐微滴被浸入氯化钙溶液的封装。藻酸盐分子由甘露糖醛(M)和古洛糖醛酸的(G)和可被Ca被连接2+。凝胶化后,将珠粒悬浮聚-L-赖氨酸(PLL)的解决方案。在此步骤期间,PLL结合G和M中的藻酸盐分子其中规定的胶囊型的膜。胶囊的膜的孔隙率可以通过改变M和PLL浓度,孵育时间和温度来调节。 PLL的结合也依赖于类型和藻酸盐的浓度。交联的离子藻酸盐基质,是不稳定的,在生理环境中或在普通缓冲溶液具有高浓度的磷酸盐和柠檬酸根离子。这些缓冲器可以从藻中提取的Ca 2+和液化的核心。海藻酸钠核心的液化提供空间胶囊细胞运动和增长中。细胞封装在聚阴离子藻酸盐与聚阳离子多聚-L-赖氨酸(APL)是不可透过免疫球蛋白,但有营养素涌入毒素和流出。这些APL的特性使长期苏移植到基因不同的主机后rvival封装的细胞。 Elliott 等人报道注入59年后运转包封猪胰腺细胞中的人类患者的生存。

封装技术可分为微囊(3-800微米)和macroencapsulation(大于1000微米)。微囊比大包囊6更耐用。自从被发现由张医生和他的同事在1964年,微胶囊已被广泛用于生产合成代谢胰岛素的细胞,其他激素和生物活性分子7的封装。这些治疗面临的宿主组织,包括肝纤维化和免疫反应8几个挑战。最初,与生物聚合物的质量的副作用也得到了解决。然而,合成代谢细胞移植仍然发起的副作用,如纤维化,如激素overpr的结果一个专门的腺体之外oduction。

近几十年来,肥胖和2型糖尿病已达到流行病的程度9。成年的人超过30%的全球超重和肥胖10。增加腹内(IAB)脂肪形成增加的慢性炎症的发病率,促进2型糖尿病,心血管疾病,某些癌症和其他并发症11-13。若干条证据表明,与IAB脂肪相关发病可由特定脂肪细胞被避免。最近的研究已经表明,移植皮下脂肪细胞的成IAB区域可以改善代谢,降低肥胖和胰岛素抵抗的啮齿动物体内 14。有效减少肥胖和胰岛素抵抗的已用能够在热15,16的形式耗散能量的产热脂肪细胞相关联。脂肪细胞的产热变形可通过稳定转染来实现基因参与线粒体解偶联质子,如解偶联蛋白1(UCP1)或基因调节UCP1等生热基因15,16的表达。我们最近的研究表明,缺乏乙醛脱氢酶1 A1(ALDH1A1)导致的脂肪IAB的产热重塑,减少肥胖和胰岛素抵抗在这些小鼠17,18。值得注意的是,产热ALDH1A1缺陷的封装(ALDH1A1 - / - )前脂肪细胞介导的肥胖野生型小鼠在IAB脂肪相同的治疗效果,这表明对于治疗的IAB脂肪18新的治疗机会。在实验环境中,封装细胞使研究人员能够研究具有成本效益的方式19项具体细胞群的影响。在这里,我们在肥胖的小鼠模型中进行讨论的产热分解代谢细胞系的封装和其实验室和治疗应用的方法。本协议描述牛逼用于微胶囊的生产( 图1)重稀土元素的阶段:藻酸盐微球( 图1A),形成聚阳离子多聚-L-赖氨酸(PLL)的微珠的表面( 图1B)上的膜,并在除去的形成藻芯( 图1C)。

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Protocol

该研究方案经美国俄亥俄州立大学伦理委员会。动物实验批准IACUC协议。所有步骤都在2级生物安全柜,带层流下进行。我们遵循所有标准的安全要求和程序。用于制备微胶囊的微胶囊化技术已经执行如所述17,18。

1.准备材料

  1. 制备出10毫升2%藻酸钠溶液在高压灭菌生理盐水(0.9%NaCl的水)。准备在生理盐水0.05%PLL溶液。前一天制备这些溶液,并搅拌过夜。使用前用0.22微米的过滤器过滤的解决方案。
  2. 制备50mM柠檬酸钠和100mM的CaCl 2中的0.9%NaCl溶液和高压灭菌。
  3. 高压釜所有解决方案,针,电极和烧杯。彻底清洁的针具用导线将避免堵塞。
  4. 确定细胞的适量的要用于胶囊(都需要良好的每平方厘米102的微胶囊,有大约每胶囊18 500个细胞)。使用将1ml海藻酸钠每2百万个细胞。
  5. 准备一个“成纤维细胞生长培养基含10%小牛血清,和100U / ml青霉素/链霉素中高葡萄糖(4500毫克/升葡萄糖)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)。
    1. 准备一个“分化培养基I'含有10%胎牛血清,10μg/ ml的胰岛素,1μM的地塞米松,0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,和100U / ml青霉素/链霉素的DMEM中。
    2. 准备一个“分化培养基Ⅱ'含有10%胎牛血清,10μg/ ml的胰岛素,并在DMEM 100U / ml青霉素/链霉素。
  6. 制备含有每10ml无线电免疫沉淀测定缓冲液一种蛋白酶抑制剂片剂裂解缓冲液(RIPA缓冲液)。

2.海藻酸钠微珠准备(图1A)

  1. 删除旧的媒体,从细胞培养瓶。冲洗细胞10毫升的PBS。带来的细胞在悬浮液用0.25%胰蛋白酶-EDTA(每一合流T175烧瓶2ml)中。
  2. 计数使用血球细胞的细胞悬浮液。使用10个毫升一份从细胞悬浮液中,并根据制造商的说明计数细胞。离心剩余的细胞在离心培养基中于480×g离心,在室温下放置5分钟。
  3. 暂停在海藻酸钠细胞沉淀步骤1.4中所述。传送海藻酸钠细胞溶液至5毫升注射器。
  4. 除去溶液中的气泡,添加了23号针头和倒置注射器创建1毫升袋的空气。
  5. 放置含144毫升下封装的针管口的100mM的CaCl 2溶液的小烧杯(180毫升)中。附加电极的封装与尖端approximately 2.5厘米的100mM的CaCl 2溶液的表面上方。
  6. 放置紧紧包含在注射器泵的藻酸钠细胞溶液的注射器。连接橡胶管,以在注射器的开口。推动柱塞直到海藻酸钠细胞液通过导管进入一半。调整电压为5.4千伏。设置12.06毫米直径在注射器泵。调整速度至3毫升/小时。启动泵。打开封装并保持电压5.4千伏。
  7. 关闭罩的窗口,并避免任何不必要的振动,直到形成藻酸盐微珠的末端。毕竟溶液通过针,与PLL涂层固化前为另外20分钟的100毫米氯化钙2溶液海藻酸钠球形微珠。

3.微珠涂料与PLL(图1B)

  1. 除去含有藻酸钠单元球状微珠的烧杯中,并转移这些为MicroBEADS到50毫升离心管中。取下微珠颗粒氯化钙溶液。
  2. 通过加入30ml的0.9%NaCl的洗涤藻细胞球状微珠。摇动管轻轻用手。除去的0.9%NaCl,用25毫升吸管后的微珠已经通过重力沉淀。重复两次,总共3次洗涤。
  3. 使用加入10ml 0.05%的PLL溶液每1毫升藻酸钠溶液。添加0.05%PLL和涡旋以每分钟1000转进行10分钟。
    注意:通常情况下,10分钟是足够的PLL涂层。
  4. 后形成PLL大衣,除去PLL解决方案,如在3.2中描述洗胶囊3倍。

4.去除海藻酸钠核心(图1C)

  1. 加入30毫升50mM柠檬酸钠溶液。等待5分钟,或直到所有的藻酸钠溶解。洗涤胶囊的三倍,在步骤3.1.1中描述。
  2. 取出的0.9%NaCl,加入20毫升培养培养基的50ml管中和含有细胞所有胶囊转移到细胞培养瓶。处理标准细胞培养条件下18封装细胞。

5. 体外应用到研究异种移植物和宿主细胞相互作用或代谢流入动力学/流出细胞之间(图2)

  1. 培养宿主细胞的24孔板直到融合的联合培养。使用“成纤维细胞生长培养基”为培养脂肪前体细胞。
  2. 转移到微胶囊24孔含有汇合板的宿主细胞。添加的微胶囊,以实现一个单层(102微胶囊/孔厘米2)。
  3. 诱导前脂肪细胞分化分化培养基I.每48小时,改变媒体到分化培养基Ⅱ6天。裂解细胞,RIPA缓冲液。用50微克蛋白每使用条件印迹分析蛋白的表达。

6. 在体内应用的Treatm肥胖的ENT(图3)

  1. 混合4%异氟烷的氧气麻醉诱导和2%异氟醚与氧为维持麻醉。确认足够的麻醉深度脚趾捏。
    1. 取适量涂抹于眼止痒软膏,以保护角膜干燥。
  2. 使用包封的细胞被永久标记的人工荧光蛋白,如绿色荧光蛋白(GFP)。
  3. 使用3毫升注射器和20号针头注入封装细胞。
    1. 注入0.5×10 6个细胞悬浮于0.2ml PBS中到每个IAB脂肪库将位于一个性腺和肾脏之间腹膜内区域, 如图3,使用PBS中的此量和细胞数为小鼠的平均重量40克。调整中具有不同重量或用于确定剂量依赖性影响小鼠细胞数量和体积。

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Representative Results

图1显示了微珠生产的每一个步骤可以在显微镜下进行控制。 图2A示出了如何共同培养的脂肪细胞与包被细胞的一个单层。 图2B是使用脂肪细胞/微胶囊共培养物的定量研究的代表性示例是在第5裂解液描述采用Western blot脂肪细胞进行了分析。包封细胞没有在该实验分析。初级ATGL和β肌动蛋白抗体被用在1:1000稀释。 ATGL的比值β肌动蛋白示的三个独立实验的平均值±SD。类似共培养的方法可以用于分析mRNA和研究在共培养包封细胞和脂肪细胞的相互作用的影响。数据显示,封装产热ALDH1A1 - / -脂肪细胞诱导显著较高水平ATGL脂肪酶和脂肪分解18的脂肪细胞相比,encapsula特德WT脂肪细胞。

图3显示了GFP的指示位置和胶囊在宿主脂肪组织的完整性。 GFP表达也是细胞活力的指标。

定性评价

封装或封装细胞植入的质量可以通过显微镜检查,MRI检查,并且使用处理过的脂肪组织18的免疫组织化学分析来评价。

定量的方法

定在存活的移植细胞的GFP的独特的表达中,GFP表达水平的测量允许封装细胞将在组织如所述18 .GFP量化,并且可以使用特定的抗GFP抗体在整个脂肪组织的匀浆被检测的其他蛋白质车厂。蛋白在此匀浆的GFP水平提供约可行植入的细胞的数量的信息。


图1:用于微胶囊的生产过程的示意图 。显微镜(20X)下(A)藻酸盐微珠。 (B)和锁相环(20X)涂布后的外层。 (C)溶解海藻酸钠核心(20X)后的最终微囊。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:微胶囊的共培养贴壁细胞系培养物(A)的示意图微囊(圆圈浮在介质)贴壁脂肪细胞的共培养物(下图)。 (B)ATGL从表达的比较3T3-L1脂肪细胞共培养脱细胞,WT,或ALDH1A1 - / -含有脂肪细胞的微胶囊。意义的P值是用曼 - 惠特尼U检验确定。上插入显示了一种代表Western印迹。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:示意腹内(IAB,内脏)脂肪注射封装细胞的注射IAB脂肪垫的照相图像显示封装细胞的移植(三角形)80天后的褪色簇。这些IAB脂肪垫被嵌入到石蜡和分析。苏木精和曙红(H&E)染色显示了簇封装细胞(箭头),植入的微胶囊(C)中 ,包封的细胞(CC),脂肪细胞的主机(A)。在荧光灯下同样的分析图像显示上一轮完整的胶囊内GFP标记的移植细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

各种方法已被用于包封细胞,包括干燥,挤出,和乳液19。在该方法中,藻酸盐珠粒通过针挤出,然后涂上PLL和藻酸盐核心会溶解以完成封装。虽然这种方法已使用多年,形成具有所需尺寸和球状珠是仍然具有挑战性。胶囊的大小是高度依赖于褐藻酸钠溶液中,挤出机直径和针尖端和氯化钙溶液20之间的距离的粘度。针尖和氯化钙溶液的表面之间的距离越短,则较小的珠产生的。所描述的协议导致产生的APL的具有孔(<32 kD的)。孔径可以使用荧光免疫球蛋白(> 32 kD的)和荧光小肽如前所述18进行实验测试。这个S孔的IZE足以支持细胞存活的体外培养2周, 在体内植入脂肪组织为至少80天18之后。微珠的形状是影响包封的细胞的存活的重要因素。破获珠与众多卫星微珠增加细胞21的突出。当低浓度和低粘度的中间-G的藻酸盐溶液加到22,而形成的尾部是由于高-G藻23发生卫星形成。作为剪切力也可有助于裂解珠,我们建议轻柔洗涤程序微珠并提出生产适于在体外共培养和移植到体内组织健壮胶囊的最佳条件。

微胶囊已被证明是一种有效的方法用于植入用于保护生物制品如细胞,细胞因子S,酶,激素,和bioabsorbents从环境和免疫反应24。激素或从封装细胞的细胞因子的受控释放是在各种各样的疾病测试其治疗作用,包括肥胖18,糖尿病5,肝功能衰竭25和贫血26。然而,嫁接包封合成代谢细胞的功效往往减少由于纤维化。在这里,我们描述了用于治疗肥胖和胰岛素抵抗18的产热分解代谢细胞的新的应用程序。 ALDH1A1的封装- / -脂肪细胞,以及可能的其他分解代谢的细胞,具有几个优点相比合成代谢细胞封装ALDH1A1 - / -前脂肪细胞自发坚持APL膜18的内表面和分化中的IAB脂肪的脂肪形成环境防止其过度增生胶囊和胶囊的快速破裂。在additioN,这些细胞已经减少炎症反应和分解代谢特性27。免疫组织化学数据显示,APL的植入封装ALDH1A1 - / -脂肪细胞到80天IAB脂肪并没有伴随着明显的免疫应答和纤维化小鼠18;然而,更多的研究需要在未来以评估潜在抗炎作用进行。首先,缺乏ALDH1A1产热增加UCP1的脂肪细胞中的表达。ALDH1A1缺乏分泌减少生产维甲酸增加视黄醛28水平。该途径影响众多转录通路28,29,这可能是参与生产的内在和旁分泌产热的因素。值得注意的是,封装ALDH1A1 - / -脂肪细胞产生的细胞宿主肥胖野生型小鼠相似的热反应。封装ALDH1A1 - / -脂肪细胞似乎产生旁分泌因子(S)我D.加强在宿主WT脂肪组织18 UCP1阳性细胞的数目。总之,这些产热反应导致优惠减少注入脂肪IAB。 / - -永生ALDH1A1的表型脂肪前体细胞发挥 ​​的许多特性,使这个基因修饰有希望的候选人封装技术减少饮食引起的肥胖。

最近许多其他生物制品,包括细胞因子irisin中,miR-133a的30,meteorin样激素31,甲状旁腺激素相关蛋白32的报道施加皮下白色脂肪组织的产热重塑。需要更多的研究,以确定是否这些因素产热适用于封装技术和疗法对抗肥胖的皮下和/或IAB脂肪。含有分解代谢的细胞微胶囊可以潜在地适合于去除过量的有害代谢物在有毒环境中。例如,患者S可以受益于醇或葡糖醛酮,在糖尿病患者中的第一反应性代谢物的促进分解代谢。然而,还需要进一步的研究,以确定是否这些应用可能具有治疗益处。

总之,这些研究提供了证明的概念,在IAB脂肪的热反应的扩增可以通过包封ALDH1A1的一小部分被启动- / -前脂肪细胞。此外,这些研究已证实组织特异性治疗的可行性与封装的分解代谢产热细胞注射的植入物。

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Acknowledgements

我们要感谢詹妮弗彼得罗西诺和大卫DiSilvestro的编辑帮助。这项研究是由美国蛋包饭和奖多项10040042从诺和诺德制药公司,以及由食品创新中心,办公室国际事务中心高级功能食品的研究,并在创业俄勒冈州立大学以及支持由奖号20020728美国国家科学基金会授予EEC-0914790(LJL)。来自国家研究资源中心说明是由奖号R21OD017244(OZ)和UL1RR025755(OSUCCC)支持的项目,由卫生(OD)的主任,国家机构的办公室医学研究和资助和支持的美国国立卫生研究院路线图NCI P30CA16058。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国家研究资源中心和美国国立卫生研究院的官方意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Encapsulation device (VAR V1) Nisco LIN-0042 None
KD scientific syringe pump KD scientific 780100Y None
Olympus microscope  Olympus Optical IX70-S8F2 None
Sodium alginate Sigma MKBP8122V None
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) Sigma 020M5006V None
Calcium chloride Sigma SLBJ2662V None
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 030M0200 None
Sodium chloride Sigma SLBD2595V None
Mini-PROTEAN TGX Gels Bio-Rad 456-1093 None
ATGL primary antibody (from rabbit) Cell Signaling 2138S None
Secondary anti body (anti rabbit) LI-COR 926-68071 None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer Boston BioProducts D25Y6Z None
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma RNBD2893 None
Trypsin Gibco 25200-056 None
Cortizone 10 anti-itch ointment Cortizone 10 C4029138 None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 None
Newborn calf serum (CS) Sigma N4762 None
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I0516 None
Dexamethasone Sigma D4902 None
Insulin (bovine) Sigma I5879 None
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693159001 None

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References

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