Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University
Published 6/02/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Xu, L., Shen, Q., Mao, Z., Lee, L. J., Ziouzenkova, O. Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots. J. Vis. Exp. (100), e52806, doi:10.3791/52806 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנקפסולציה התא פותחה כדי ללכוד תאי קיימא בתוך ממברנות חדירות למחצה. Engrafted התאים במארז יכולים להחליף מטבוליטים משקל מולקולריים נמוכים ברקמות של המארח טופל להשיג הישרדות לטווח ארוך. ממברנה חדירה למחצה מאפשרת engrafted תאים במארז, כדי למנוע דחייה על ידי המערכת החיסונית. הליך אנקפסולציה נועד לאפשר שחרור מבוקר של תרכובות ביו, כגון אינסולין, הורמונים אחרים, וציטוקינים. כאן אנו מתארים שיטה לאנקפסולציה של תאי קטבולי, אשר צורכים שומנים לייצור חום ופיזור אנרגיה (thermogenesis) ברקמת השומן תוך-בטני של עכברים שמנים. Encapsulation של תאי קטבולי התרמוגני עשוי להיות פוטנציאל החלים על המניעה וטיפול בהשמנת יתר וסוכרת מסוג 2. יישום אפשרי נוסף של תאי קטבולי עשוי לכלול סילוק רעלים מאלכוהול או מטבוליטים רעילים אחרים ומזהמים סביבתיים.

Introduction

שכיחות גוברת של מחלות כרוניות 1 עוררה מחקרים על השתלה של אוכלוסיות תאים טיפוליות 2. תאי גזע Syngenic או אלוגנאית הם סוגי התאים הנפוצים ביותר עבור יישומים אלה 2. עם זאת, טיפולים אלה אינם מאפשרים שליטה של ​​בידול והגירה של תאי גזע לאחר השתלה ולא יעלו יעיל. השתלה של תאים מהונדסים גנטי עם פונקציות מועילות צופה שיפור הטיפול במחלות רבות. עם זאת, שינויים גנטיים תא מוכרים על ידי המערכת החיסונית של המארח, ולכן, טיפולים אלה מחייבים דיכוי חיסוני 3. Encapsulation של תאים מייצרים אינסולין פותח על ידי ד"ר 4 צ'אנג. הטכניקה מבוססת על אנקפסולציה של תאים בטיפות אלגינט ששקועים בפתרון סידן כלורי. מולקולות אלגינט מורכבות מחומצת mannuronic (M) וguluronic (G) ויכולות להיות מחוברות על ידי Ca 2 +. לאחר gelation, חרוזים מושעים פתרון פולי-L ליזין (PLL). במהלך שלב זה, PLL נקשר לG ו- M במולקולות אלגינט הקובעת קרום של הכמוסה. הנקבוביות של הקרום של הכמוסה יכולה להיות מווסת על ידי שינוי ריכוזי M וPLL, זמן הדגירה, וטמפרטורה. המחייב של PLL גם תלוי בסוג והריכוז של אלגינט. מטריצות אלגינט crosslinked עם Ca 2 + יונים, אינן יציבים בסביבה הפיזיולוגית או בפתרונות חיץ משותפים עם ריכוז גבוה של פוספט ויונים ציטראט. מאגרים אלה יכולים לחלץ Ca 2 + מאלגינט ונוזל הליבה. עיבוי של ליבת אלגינט מספק מרחב בתוך קפסולות לתנועה וצמיחה תאיות. תאים במארז באלגינט polyanionic עם פולי-L ליזין polycationic (APL) הם בלתי חדירים לנוגדנים אבל יש לי זרם של חומרים מזינים וזרימה של רעלים. המאפיינים של APL אלה מאפשרים לטווח הארוך survival של תאים במארז לאחר השתלה למארחים שונים מבחינה גנטית. אליוט et al. דיווח ההישרדות של תפקוד תאי לבלב חזירי במארז במטופל אנושי תשע שנים לאחר ההשתלה 5.

טכניקות Encapsulation ניתן לסווג למיקרואנקפסולציה (3-800 מיקרומטר) וmacroencapsulation (גדול יותר מ -1,000 מיקרומטר). Microcapsules עמיד יותר מאשר macrocapsules 6. מאז גילויו על ידי ד"ר צ'אנג ועמיתים בשינה 1964, מיקרואנקפסולציה כבר בשימוש נרחב לאנקפסולציה של תאים אנבוליים ייצור אינסולין, הורמונים אחרים, ומולקולות ביו 7. טיפולים אלה בפני מספר אתגרים ברקמת המארח כולל סיסטיק ותגובה חיסונית 8. בתחילה, תופעות לוואים הקשורות לאיכות biopolymers נפתרו. עם זאת, השתלה של תאים אנבוליים עדיין יוזמת תופעות לוואי, כגון סיסטיק, כתוצאה מההורמון overproduction מחוץ לבלוטה מיוחדת.

בעשורים האחרונים, השמנת יתר וסוכרת מהסוג 2 הגיעה לממדי מגיפה 9. יותר מ -30% מאנשים בוגרים בעולם סובלים מעודף משקל והשמנת יתר 10. היווצרות מוגברת תוך-בטני (IAB) שומן מגבירה שכיחות של דלקת כרונית ומקדמת סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם, סוגי סרטן מסוימים, ותחלואות אחרות 11-13. כמה שורות של ראיות מצביעים על כך פתוגנזה הקשורים שומן IAB ניתן נמנעה על ידי תאי שומן ספציפיים. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השתלה של תאי שומן תת עורי לאזור IAB יכול לשפר את חילוף חומרים וירידת התנגדות השמנה ואינסולין במכרסמים בvivo 14. הפחתה אפקטיבית של התנגדות השמנה והאינסולין נקשרה עם adipocytes התרמוגני מסוגלים מתפוגג אנרגיה בצורה של חום 15,16. שינוי התרמוגני של adipocytes יכול להיות מושגת על ידי transfection היציבשל גנים המשתתפים בשחרר פרוטון המיטוכונדריה, כגון החלבון שחרר 1 (Ucp1) או של גנים המסדירים ביטוי של Ucp1 וגנים התרמוגני אחרים 15,16. המחקרים האחרונים שלנו הראו כי המחסור בA1 אלדהיד דהידרוגנז 1 (Aldh1a1) מוביל לשיפוץ התרמוגני של שומן IAB שמפחית השמנת יתר ועמידות לאינסולין בעכברים אלה 17,18. יש לציין, אנקפסולציה של התרמוגני Aldh1a1 הלקוי (Aldh1a1 - / -) preadipocytes מתווכת אותו אפקט טיפולי בשומן IAB בעכברים שמנים מסוג בר, מציעה הזדמנויות טיפוליות חדשות לטיפול בשומן IAB 18. בהגדרות ניסוי, תאים במארז מאפשרים לחוקרים ללמוד השפעות של אוכלוסיות תאים ספציפיות בעלות אופן יעיל 19. כאן אנו דנים בשיטה של ​​אנקפסולציה של שורת תאי קטבולי התרמוגני והמעבדה שלו ויישום טיפולי במודל עכבר של השמנת יתר. הפרוטוקול מתאר tשלבי HREE לייצור microcapsule (איור 1): ההיווצרות של microbeads אלגינט (איור 1 א), ההיווצרות של פולי-L ליזין polycationic (PLL) קרומים על פני השטח של microbeads (איור 1), והסרת ליבות אלגינט (איור 1 ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת מדינת אוהיו. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי פרוטוקול IACUC. כל הנהלים בוצעו תחת ממשלת רמת הבטיחות הביולוגית 2 עם זרימה למינרית. עקבנו אחרי כל דרישות הבטיחות סטנדרטית ונהלים. טכניקת מיקרואנקפסולציה להכנת microcapsules שבוצעה כמתואר 17, 18.

1. תכשירים מחומרים

  1. הכן 10 מיליליטר של 2% פתרון אלגינט נתרן במלח autoclaved פיסיולוגי (0.9% NaCl במים). הכן 0.05% פתרון PLL במלח פיסיולוגי. הכן את הפתרונות הללו ביום שלפני ומערבבים הלילה. סנן את הפתרונות עם 0.22 מיקרומטר סינון לפני השימוש.
  2. הכן נתרן ציטרט 50 מ"מ ו- 100 מ"מ CaCl 2 בפתרונות NaCl 0.9% וחיטוים.
  3. החיטוי כל הפתרונות, מחטים, אלקטרודות, וכוסות. ביסודיות מחטים נקיות עם חוטים כדי למנוע סתימה.
  4. לקבוע את הכמות המתאימה של תאים לשימוש עבור הכמוסות (102 microcapsules נחוץ לכל 2 סנטימטר של כן ויש כ -500 תאים לכל כמוסה 18). השתמש 1 מיליליטר של אלגינט נתרן לשני מיליון תאים.
  5. הכן 'פיברובלסטים צמיחה בינוני "עגל בסרום המכיל 10%, ו- 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בסוכר גבוה (גלוקוז 4,500 מ"ג / ליטר) הבינוני של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM).
    1. הכן "בידול בינוני אני 'המכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, dexamethasone 1 מיקרומטר, 0.5 xanthine 3-isobutyl-1-מתיל מ"מ, ו 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בDMEM.
    2. הכן 10% בסרום 'בידול בינוני השני' מכיל שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, ו 100 U / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין בDMEM.
  6. הכן מאגר תמוגה המכיל לוח מעכבי פרוטאז אחד לכל 10 מיליליטר חיץ Assay הרדיו-Immunoprecipitation (RIמאגר הרשות הפלסטינית).

2. אלגינט microbeads הכנה (איור 1 א)

  1. הסר בינוני ישנה מבקבוק תרבית תאים. יש לשטוף את תאים עם 10 מיליליטר של PBS. להביא תאים בתרחיף עם 0.25% טריפסין EDTA (2 מ"ל לכל בקבוק T175 מחוברות אחת).
  2. ספירת תאים בתרחיף תאים באמצעות hemocytometer. השתמש 10 מיליליטר aliquot מהשעית התא ולספור תאים על פי הוראות יצרן. צנטריפוגה התאים שנותרו במדיום צנטריפוגה ב 480 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  3. להשעות את התא גלולה באלגינט נתרן כמתואר בשלב 1.4. מעבירים את פתרון אלגינט תאי נתרן למזרק 5 מיליליטר.
  4. הסר בועות אוויר בפתרון, להוסיף מחט 23-מד ולהפוך את המזרק כדי ליצור כיס 1 מיליליטר של אוויר.
  5. מניחים כוס קטנה (180 מיליליטר) מכילה 144 מיליליטר של 100 מ"מ CaCl 2 פתרון מתחת לזרבובית המחט של הנרתיק-. צרף את האלקטרודה לנרתיק-עם approxim הקצהately 2.5 סנטימטרים מעל פני השטח של פתרון 100 מ"מ CaCl 2.
  6. מניחים בחוזקה את המזרק המכיל את פתרון אלגינט תאי נתרן במשאבת המזרק. צרף את צינור הגומי לפתיחה של המזרק. לדחוף את הבוכנה עד פתרון אלגינט תאי נתרן נכנס באמצע הצינור. התאם את המתח 5.4 וולט. הגדר את קוטר 12.06 מ"מ על משאבת המזרק. התאם את המהירות עד 3 מיליליטר / שעה. התחל המשאבה. הפעל את הנרתיק-ולשמור על המתח של 5.4 וולט.
  7. סגור את החלון של מכסה המנוע ולהימנע מכל רעידות מיותרות עד סוף היווצרות microbeads אלגינט. אחרי הכל הפתרון עובר דרך המחט, לחזק microbeads הכדור בצורה אלגינט בפתרון 2 100 מ"מ CaCl במשך 20 דקות נוספות לפני הציפוי עם PLL.

3. microbeads ציפוי עם PLL (איור 1)

  1. הסר את הכוס המכילה microbeads הכדור בצורה אלגינט תאי נתרן ולהעביר microb אלהEADS לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הסר CaCl 2 פתרון מגלולת microbead.
  2. שטוף את microbeads הכדור בצורה אלגינט התאים על ידי הוספת 30 מיליליטר של 0.9% NaCl. נער את הצינור ביד בעדינות. הסר 0.9% NaCl עם 25 מיליליטר פיפטה לאחר microbeads שזרז על ידי כוח הכבידה. חזור על שתי פעמים יותר עבור הסכום כולל של 3 שוטף.
  3. השתמש 10 מיליליטר של 0.05% פתרון PLL לכל 1 מיליליטר של תמיסת נתרן אלגינט. הוסף את PLL 0.05% ומערבולת ב1,000 סיבובים לדקים 'במשך 10 דקות.
    הערה: בדרך כלל, 10 דקות מספיקות לציפוי PLL.
  4. לאחר מעיל PLL נוצר, להסיר את פתרון PLL ולשטוף את הכמוסות 3 פעמים כמתואר ב3.2.

4. ההסרה של אלגינט Core (איור 1 ג)

  1. להוסיף 30 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטרט 50 מ"מ. חכה 5 דקות או עד שכל אלגינט נתרן נמס. לשטוף כמוסות שלוש פעמים כמתואר בשלב 3.1.1.
  2. הסר את 0.9% NaCl, להוסיף 20 מיליליטר של מדיום התרבות לשפופרת 50 מיליליטרולהעביר את כל הכמוסות המכילות את התאים לבקבוק תרבית תאים. לטפל בתאים במארז בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים 18.

5. ביישומים חוץ גופית לחקר אינטראקציות xenograft ותא מארח או קינטיקה של פליטת המטבוליט / זרימה בין תאים (איור 2)

  1. תאי מארח תרבות ב -24 בצלחת גם עד ומחוברות לשיתוף תרבויות. השתמש ב'פיברובלסטים הצמיחה בינוני "לpreadipocytes culturing.
  2. ההעברה microcapsules ל -24 תאי מארח מחוברות צלחת המכילה גם. להוסיף microcapsules להשיג monolayer (102 microcapsules / 2 סנטימטר של היטב).
  3. לגרום לבידול מראש adipocyte עם הבידול בינוני I. כל שעה 48, מדיה שינוי לבידול בינוני השני במשך שישה ימים. תאי Lyse חיץ Ripa. השתמש 50 מיקרוגרם לכל חלבון מצב לנתח ביטוי חלבון באמצעות כתם מערבי.

6. בVivo הבקשה לtreatmאף אוזן גרון של השמנת יתר (איור 3)

  1. מערבבים isoflurane% 4 עם חמצן לאינדוקציה של ההרדמה isoflurane ו -2% עם חמצן לתחזוקה של הרדמה. לאשר עומק הרדמה נאות על ידי צביטת הבוהן.
    1. החל משחה אנטי גירוד בעיניים כדי להגן על הקרניות מהתייבשות.
  2. להשתמש בתאים במארז שמתויגים באופן קבוע עם חלבון הקרינה מלאכותי, כגון חלבון ירוק הקרינה (GFP).
  3. השתמש במזרק 3 מיליליטר ומחט 20 מד להזריק תאים במארז.
    1. להזריק 0.5 x 10 6 תאים תלויים ב0.2 מיליליטר של PBS לכל תחנת שומן IAB שממוקמת באזור intraperitoneal בין בלוטת מין וכליות, כפי שמוצג באיור 3. השתמשו בכרך זה של PBS ומספר תא לעכברים עם משקל ממוצע של 40 גרם. התאם את מספר נייד ונפח בעכברים שיש לי משקל שונה או לקביעת השפעות תלוית מינון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מראה כי בכל שלב של ייצור microbeads יכול להיות נשלט מתחת למיקרוסקופ. איור 2A מראה כיצד התרבות משותפת adipocytes עם monolayer של תאים במארז. איור 2 היא דוגמא מייצגת של מחקר כמותי באמצעות adipocyte / שיתוף תרבויות microcapsules ש תוארו בסעיף 5. Lysates של adipocytes נותחו באמצעות כתם מערבי. תאים במארז לא נותחו בניסוי זה. ATGL הראשוני ונוגדני β-אקטין שמשו בדילול 1: 1,000. היחס של ATGL ל- β אקטין מוצג SD ממוצע כשלושה ניסויים בלתי תלויים. גישות שיתוף תרבות דומה יכולות לשמש כדי לנתח mRNA וללמוד אפקטים של אינטראקציות תא וadipocyte הגלומים בשיתוף תרבויות. מציג נתונים שגלומים Aldh1a1 התרמוגני - / - adipocytes לגרום לרמות גבוהות יותר באופן משמעותי של lipase ATGL ויפוליזה 18 בadipocytes לעומת encapsula adipocytes טד WT.

איור 3 מראה כי ה- GFP מציין מיקום ואת השלמות של כמוסות ברקמת שומן מארח. הביטוי של ה- GFP הוא גם אינדיקציה לכדאיויות תא.

הערכה איכותית

האיכות של אנקפסולציה או השתלה של תאים במארז יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופ, MRI, ובאמצעות ניתוח immunohistochemical של רקמות שומן טופלו 18.

גישה כמותית

בהתחשב בביטוי הייחודי של ה- GFP בשרד תאים מושתלים, המדידה של רמות הביטוי של GFP מאפשרת כמוסות תאים ללכמת ברקמות כמתואר 18 .GFP וניתן לאתר חלבונים אחרים באמצעות נוגדנים אנטי-GFP ספציפיים בhomogenate של רקמת שומן כל דיפו. רמות ה- GFP של חלבון בhomogenate זה לספק מידע על מספר התאים מושתלים ברי-קיימא.

s = "jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1: סכמטי של ההליך לייצור microcapsule. microbeads אלגינט () תחת מיקרוסקופ (20X). (ב) השכבה החיצונית לאחר ציפוי עם PLL (20X). microcapsule הסופי לאחר המסת ליבת אלגינט (20X) (ג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: שיתוף תרבויות microcapsule עם תרבויות שורת תאים חסיד () סכמטי (פנל תחתון) של תרבות משותפת של microcapsules (עיגולים צפים בתקשורת) עם adipocytes חסיד.. השוואה בין הביטוי של ATGL מ( ב)שיתוף תרבותי 3T3-L1 adipocytes עם acellular, WT, או Aldh1a1 - / - microcapsules adipocyte מכיל. ערך P משמעות נקבע באמצעות בדיקת Mann-Whitney U. מוסיף עליון תערוכות כתם מערבי נציג אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. סכמטי של התוך-בטני (IAB, קרביים) הזרקת שומן עם תאים במארז הדימוי הצילומי של כרית השומן המוזרקת IAB תערוכות אשכולות דהויים של תאים במארז 80 ימים לאחר ההשתלה (המשולש). כרית תחביב IAB אלה מוטבע פרפין ונותחה. Hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים תערוכות אשכולות של תאים במארז (חיצים), microcapsules המושתל (C), במארזתאים (CC), adipocytes מארח (). אותה תמונה ניתחה תחת אור ניאון תערוכות תאים מושתלים שכותרת GFP בצד הפנימי של כמוסות בשלמות עגולות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות שונות שימשו כדי לתמצת תאים, כולל ייבוש, חול, ותחליב 19. בשיטה זו, נמתחים חרוזים אלגינט באמצעות מחט, אז מצופים PLL וליבת אלגינט תפורק כדי להשלים את אנקפסולציה. למרות ששיטה זו הייתה בשימוש כבר שנים, היווצרות של חרוזים עם הגודל הרצוי וצורה כדורית היא עדיין מאתגרת. הגודל של הכמוסות תלוי מאוד בצמיגות של פתרון אלגינט נתרן, קוטר מכבש ואת המרחק בין קצה המחט ופתרון CaCl 2 20. הקצר יותר את המרחק בין קצה המחט ואת פני השטח של CaCl פתרון 2, חרוזים הקטנים מיוצרים. הפרוטוקול המתואר מוביל לייצור של APL עם נקבוביות (<32 KD). הגודל הנקבובית יכול להיבדק בניסוי באמצעות נוגדנים ניאון (> 32 KD) ופפטידים קטנים ניאון כפי שתואר קודם לכן 18. זה זהize של הנקבובית מספיק כדי לתמוך בהישרדות של תאים במבחנה בתרבויות במשך 2 שבועות ולאחר השתלת in vivo לרקמת שומן לפחות 80 ימים 18. צורת microbead היא גורם חשוב המשפיע על הישרדותם של תאים במארז. חרוזים סדוקים עם microbeads לווין רב להגדיל בליטה של תאים 21. התרחשה היווצרות לווין כאשר ריכוז ופתרונות אלגינט צמיגות נמוכה ביניים-G נמוכים מיושמים 22, ואילו היווצרות הזנב נובעת אלגינט הגבוה G 23. ככוח הגז גם עשויה לתרום לחרוזים סדוקים, אנו ממליצים הליך כביסה עדין לmicrobeads ולהציע תנאים מותאמים לייצור קפסולות חזקות מתאימות במבחנה שיתוף תרבויות וengrafting לרקמות בגוף חי.

Microcapsulation הוכח להיות שיטה יעילה להשתלה להגנה ביולוגית כגון תאים, ציטוקיניםים, אנזימים, הורמונים, וbioabsorbents מהסביבה והתגובה חיסונית 24. השחרור המבוקר של הורמונים או ציטוקינים מהתאים במארז נבדק ההשפעות הטיפוליות שלה במגוון רחב של מחלות, כולל השמנת יתר 18, סוכרת 5, אי ספיקת כבד 25 ואנמיה 26. עם זאת, היעילות של תאי engrafted אנבוליים במארז לעתים קרובות פחתה עקב פיברוזיס. כאן אנו מתארים את היישום החדש של תאי קטבולי התרמוגני לטיפול בהשמנת יתר ואינסולין התנגדות 18. Encapsulation של Aldh1a1 - / - adipocytes, ותאי קטבולי אולי אחרים, יש מספר יתרונות בהשוואה לאנקפסולציה של תאים אנבוליים Aldh1a1 -. / - Preadipocytes ספונטני לדבוק במשטח הפנימי של קרום APL 18 ולהבדיל בסביבת adipogenic שומן IAB ש מונע ההתרבות המוגזמת שלהם בכמוסות וקרע מהיר של כמוסות. בaddition, תאים אלה הצטמצמו תגובות דלקתיות ומאפייני קטבולי 27. נתוני immunohistochemical מראה כי ההשתלה של APL במארז Aldh1a1 - / - adipocytes לשומן IAB עבור 80 ימים לא לוותה בתגובה חיסונית בולטת וסיסטיק בעכברים 18; עם זאת, מחקרים נוספים צריכים להתבצע בעתיד להערכת תופעות דלקתיות פוטנציאליות. בעיקר, חוסר Aldh1a1 מגביר ביטוי של Ucp1 התרמוגני בadipocytes. מחסור Aldh1a1 מפחית ייצור autocrine של חומצה הרטינואית הגדלת רמות של retinaldehyde 28. מסלול זה משפיע מסלולים רבים תעתיק 28,29, אשר יכול להיות מעורב בייצור של גורמים פנימיים והתרמוגני אוטוקריני. יש לציין, במארז Aldh1a1 - / - תאי adipocytes לייצר תגובה התרמוגני דומה בעכברים שמנים WT מארח. מארז Aldh1a1 - / - adipocytes מופיעה לייצר גורם אוטוקריני (ים) אניncreasing מספר תאי -positive Ucp1 ברקמת שומן WT המארח 18. יחד, תגובות התרמוגני אלה הביאו לירידה מועדפת של שומן IAB מוזרק. הפנוטיפ של Aldh1a1 הונצח - / - preadipocytes מפעיל תכונות רבות ההופכות שינוי גנטי זה מועמד מבטיח לטכנולוגית אנקפסולציה הפחתת השמנה נגרמת דיאטה.

לאחרונה רב ביולוגי אחרים, כולל irisin ציטוקינים, miR-133a 30, meteorin כמו הורמון 31, חלבון יותרת התריס-הקשורים להורמונים 32 דווחו להפעיל שיפוץ התרמוגני של רקמת שומן תת עורי לבנה. נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אם גורמים התרמוגני אלה מתאימים לטכנולוגיות אנקפסולציה וטיפולים נגד השמנת יתר בשומן תת עורי ו / או IAB. Microcapsules המכיל תאי קטבולי יכול להיות פוטנציאל מתאים כדי להסיר עודפים של מטבוליטים מזיקים בסביבה רעילה. לדוגמא, חולהים עשוי להפיק תועלת מפירוק הקל של אלכוהול או deoxyglucosone, המטבוליט תגובה ראשון בחולים עם סוכרת. עם זאת, יש צורך במחקרים עתידיים כדי לקבוע אם יש יישומים אלה יכולים להיות יתרונות טיפוליים.

לסיכום, מחקרים אלה מספקים הוכחה של קונספט שההגברה של התגובה התרמוגני בשומן IAB יכולה להיות שיזמה קבוצה קטנה של Aldh1a1 כמוס - / - preadipocytes. יתר על כן, מחקרים אלה הוכיחו היתכנות של טיפול רקמות ספציפיות עם שתלים שהוחדרו לתאים התרמוגני קטבולי במארז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לג'ניפר Petrosino ודוד DiSilvestro למערכת עזרה. מחקר זה נתמך על ידי מספר פרס 20020728 מהאמריקנית ביצת המועצה ומספר פרס 10040042 מתרופות נובו נורדיסק, כמו גם על ידי מרכז מזון החדשנות, משרד לעניינים בינלאומיים, המרכז לחקר מזון פונקציונלי מתקדם, ויזמות באוניברסיטת אוהיו, כמו גם קרן הלאומית למדע להעניק EEC-0914790 (LJL). הפרויקט המתואר נתמכה על ידי מספר פרס R21OD017244 (OZ) וUL1RR025755 (OSUCCC) מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, שמומן על ידי המשרד, מנהל המכון הלאומי לבריאות (OD) ונתמך על ידי מפת הדרכים NIH למחקר ולרפואה NCI P30CA16058. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המרכז הלאומי למשאבי מחקר או המכון הלאומי לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Encapsulation device (VAR V1) Nisco LIN-0042 None
KD scientific syringe pump KD scientific 780100Y None
Olympus microscope  Olympus Optical IX70-S8F2 None
Sodium alginate Sigma MKBP8122V None
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) Sigma 020M5006V None
Calcium chloride Sigma SLBJ2662V None
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 030M0200 None
Sodium chloride Sigma SLBD2595V None
Mini-PROTEAN TGX Gels Bio-Rad 456-1093 None
ATGL primary antibody (from rabbit) Cell Signaling 2138S None
Secondary anti body (anti rabbit) LI-COR 926-68071 None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer Boston BioProducts D25Y6Z None
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma RNBD2893 None
Trypsin Gibco 25200-056 None
Cortizone 10 anti-itch ointment Cortizone 10 C4029138 None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 None
Newborn calf serum (CS) Sigma N4762 None
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I0516 None
Dexamethasone Sigma D4902 None
Insulin (bovine) Sigma I5879 None
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693159001 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogeli, C., et al. Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs. Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).
  2. Vija, L., et al. Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes. Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).
  3. Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M. Therapeutic applications of encapsulated cells. Methods in molecular biology. 1051, 349-364 (2013).
  4. Chang, T. M. Semipermeable Microcapsules. Science. 146, 524-525 (1964).
  5. Elliott, R. B., et al. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).
  6. Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210, 908-910 (1980).
  7. Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. Treatment of diabetes with encapsulated islets. Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).
  8. Cotton, C. K. Engineering challenges in cell-encapsulation technology. Trends in biotechnology. 14, 158-162 (1996).
  9. Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nature medicine. 12, 62-66 (2006).
  10. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  11. Kissebah, A. H., et al. Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).
  12. Bray, G. A., et al. Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program. The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).
  13. Klein, J., et al. What are subcutaneous adipocytes really good for. Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).
  14. Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism. Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).
  15. Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men. Genes & development. 23, 788-797 (2009).
  16. Kozak, L. P. Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies. Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).
  17. Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies. Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).
  18. Yang, F., et al. The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine. Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).
  19. Chang, T. M. Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology. Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).
  20. Chang, T. M. Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells. ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).
  21. Koo, J., Chang, T. M. Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).
  22. Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt. Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).
  23. Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).
  24. Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads. Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).
  25. Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method. Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).
  26. Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells. Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).
  27. Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner. Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).
  28. Ziouzenkova, O., et al. Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity. Nature. 13, 695-702 (2007).
  29. Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots. Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).
  30. Liu, W., et al. miR-133a regulates adipocyte browning in vivo. PLoS genetics. 9, e1003626 (2013).
  31. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157, 1279-1291 (2014).
  32. Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513, 100-104 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats