Facile och effektiv framställning av Tri-komponent fluorescerande Glycopolymers via RAFT styrda Polymerisation

Chemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Syntetiska glycopolymers är instrumentella och mångsidiga verktyg som används i olika biokemiska och biomedicinska forskningsområden. Ett exempel på en enkel och effektiv syntes av välkontrollerade fluorescerande statistiska glycopolymers med omvändbar tillsats-fragmente kedje-överföring (RAFT) -baserad polymerisation demonstreras. Syntesen börjar med framställningen av β-galaktos-innehållande glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrylamid framställd genom reaktion mellan lactobionolactone och N - (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metakrylamid (GAEMA) används som en strukturell analog som saknar en terminal β-galaktosid. Följande RAFT medierad sampolymerisationsreaktion omfattar tre olika monomerer: N - (2-hydroxietyl) akrylamid som distans, AEMA som mål för ytterligare fluorescensmärkning, och glycomonomers. Tolerant mot vattenhaltiga system, Flotten medlet som används i reaktionen är (4-cyanopentansyra) -4-dithiobenzoate.Låga dispersiteter (≤1.32), förutsägbara sampolymerkompositioner och hög reproducerbarhet av polymerisationerna observerades bland de produkter. Fluorescerande polymerer erhålls genom att modifiera glycopolymers med karboxifluorescein succinimidylester inriktning på de primära aminfunktionella grupper på AEMA. Lektin-bindande särdrag hos de resulterande glycopolymers verifieras genom att testa med motsvarande agaroskulor belagda med specifika glycoepitope erkänner lektiner. På grund av den enkla syntesen, den snäva kontrollen av produktkompositionerna och god reproducerbarhet av reaktionen, detta protokoll kan översättas till framställning av andra RAFT baserade glycopolymers med specifika strukturer och kompositioner, såsom önskas.

Introduction

Under de senaste två decennierna, har undersökningar med syntetiska glycopolymers genomgått långsam men kontinuerlig utveckling, visar en betydande potential i att undersöka smitt mekanismer som inkluderar forskning som fokuserar på lektin erkännande processer 1-3. Eftersom syntetiska glycopolymers besitter multivalenta sockergrupper uppvisar mycket högre lektin-bindande effektiviteter, jämfört med monovalenta kolhydrater, de är av stor efterfrågan i glykobiologi fält 3. Av särskilt intresse i klinisk forskning är användningen av fluorescerande glycopolymers att karakterisera lektin-medierad bakteriell bindning med kolhydrater som finns på mänskliga andningscellytor och slemhinnor glykoprotein. Tidigt in vitro-studier som används kommersiellt tillgängliga polyakrylamid-baserade glycopolymers i bakteriebindningstester. Flera av dessa sönder visade lovande resultat, men uttryckt farhågor om, obtainability, och mycket mot många variationer i både polYmer molekylvikt och glycoepitope innehåll. Ett ekonomiskt i laboratoriet protokoll har utvecklats som skulle ge en tillfredsställande kontroll över strukturen innehåll, storlek och renhet av syntetiska glycopolymers riktar bakteriella lektiner.

I sökandet efter en lämplig syntetisk metod för glycopolymers, var en relativt ny polymerisationsteknik testats med hjälp av en typ av kontrollerad radikalpolymerisation som användes reversibla additions fragmentering kedje-överföring (flotte) medel 4. Sådana RAFT reagens har nyligen använts i ett fåtal glycopolymer beredningar 5-7. Jämfört med andra protokoll glycopolymer beredning, raft medierad polymerisationer visar flera fördelar, bland annat tolerans mot en mängd monomer strukturer och reaktionsbetingelser, potentiell kompatibilitet med vattenhaltiga lösningar, och låg storlek dispersitet av de önskade polymerprodukter 8,9. Av betydande intresse är protokoll för framställning av RAFT-based tri-komponent glycopolymers, vilket möjliggör kontroll av kompositioner av olika monomerer, som var och en kan ha distinkta funktioner 10-13. Dock saknade de flesta av de tidigare forsknings strävanden antingen anomera vidhängande kolhydrater 10 eller användes steg polymerisationer resulterar i tri-segmentsampolymerer, som består av kovalent länkade homopolymerer, som ofta har olika syften än statistiska polymerer, som är sampolymerer i vilka sekvensen av monomer rester följer en statistisk regel 9-13.

Nyligen, som utnyttjar den thiocarbonylthio RAFT föreningen (4-cyanopentansyra) -4-dithiobenzoate i en vattenhaltig miljö, framställningen av en grupp av RAFT-baserade linjära tri-komponent statistiska glycopolymers innehåller specifika vidhängande sockerarter och deras tillämpning i lektin-förmedlad bakteriell bindning tester rapporterades 14. Det övergripande målet med denna metod, som presenteras i en visuell sätt, är att förbereda tri-komponentstatistiska fluorescerande glycopolymers via RAFT kontrollerade sampolymerisation. På grund av lättheten av en-stegs-polymerisation protokoll, den fina kontroll över polymerlängd och kompositioner, samt hög reproducerbarhet av reaktionen, detta protokoll kan lätt tillämpas på andra RAFT baserade synteser av glycopolymers med önskade strukturer.

Protocol

1. Syntes av Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl metakrylamid

  1. Lös 2 g laktobionsyra i 3,0 ml vattenfri metanol och tillsätt långsamt absolut etanol i en droppvis sätt till dess att lösningen blir bara grumlig, sedan avlägsna lösningsmedlen genom rotationsindunstning.
  2. Lös återstoden, från steg 1,1, i 3,0 ml vattenfri metanol och, återigen, långsamt absolut etanol tills bara grumlig, indunsta sedan lösningsmedlen genom rotationsindunstning. Upprepa detta steg tre gånger för att erhålla lactobiono-1,5-lakton (1,94 g, 98% utbyte). Denna produkt har tillräcklig renhet för att användas i följande reaktioner.
  3. Lägg 1,0 g lactobionolactone i 3,0 ml metanol till N - (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA, 0,58 g) och hydrokinonmonometyleter (MEHQ, 1,0 mg), en inhibitor av själv-polymerisation, i 2,0 ml metanol, följt med 1,0 ml trietylamin. Rör om vid RT under 48 h.
  4. Tillsätt 20 ml avjoniserat H2O (dH 2
  5. För att ta bort eventuell kvarvarande laktobionsyra, tillsätt 20 ml dH 2 O, sedan passera vattenlösningen genom en anjonbytarkolonn (OH - form 10 mm x 20 mm) till en mottagande bägare innehållande 1,0 mg MEHQ.
  6. Ta trietylamin, framställd i Steg 1.5, genom förångning till torrhet via rotationsindunstning.
  7. Lägg 20 ml dH 2 O och avlägsna oreagerad AEMA genom långsam tillsats av 1 mg alikvoter av katjonbytarharts (H + -form) tills ingen ninhydrin reaktiva material är detekterbara. Övervaka avlägsnandet genom att ta en il alikvoter av lösningen efter varje harts dessutom tillämpa den på en tunnskiktsplatta och sedan sprayning av plattan med en 2% ninhydrin i etanol-lösning. När ingen djup blå färg observeras att utvecklas när plattan upphettas till 90 ° C under 1 minut, har slutpunkten nåtts.
  8. Ta MEHQ från provet genom att lösa det frystorkade materialet i en minimal mängd metanol (~ 0,5 ml), tillsätt sedan kall vattenfri aceton (-20 ° C, 15 ml) för att fälla ut produkten. Samla upp fällningen genom filtrering med användning av en frittad glastratt och torka fällningen i en torkapparat under vakuum för att erhålla 2-lactobionamidoethyl metakrylamid (LAEMA) som ett benvitt pulver (0,94 g, 68% utbyte). Denna produkt har tillräcklig renhet för att användas i följande reaktioner.

2. Syntes av monomer 2-Gluconamidoethyl metakrylamid

Obs: Framställningen av 2-gluconamidoethyl metakrylamid (GAEMA), som inte har en vidhängande socker, anpassades från en publicerad metod 15.

  1. Lägg 2,0 g AEMA upplöst i 10 ml metanol till en lösningav D-glukonolakton (1,6 g) i 30 ml metanol och under omröring, tillsätt långsamt 1,6 ml trietylamin.
  2. Rör om reaktionsblandningen vid RT under 24 h.
  3. Filtrera den utfällda produkten med användning av en frittad glastratt och skölj fällningen tre gånger med 10 ml vardera av isopropanol, tvätta sedan med 10 ml torr aceton. Torka den utfällda produkten i en desickator under vakuum.

3. FLOTTE Glycopolymer Syntes

  1. För att avlägsna inhibitorn MEHQ närvarande i kommersiell N - (2-hydroxietyl) akrylamid (HEAA), tillsätt 1 ml HEAA till en 2 ml mikrocentrifugrör, följt av tillsats av 0,5 g aluminiumoxidnanopartiklar. Centrifugera röret vid 300 xg under 30 sek, och använda det översta lagret HEAA i följande reaktion.
  2. Sätt försiktigt 32,8 mg LAEMA (70,0 jimol), 1,7 mg AEMA (10,5 | imol) och 27,5 ^ il av HEAA (270 ^ mol), allt upplöst i 0,4 ml dH 2 O, till en väl rengjord ett ml Schlenk-rör, vilket således som har en monomER molförhållande av 20: 3: 77.
  3. I en parallell reaktion, för att producera kontroll polymerer som inte besitter någon hängande socker, i stället för att använda LAEMA i steg 3.2, ersätta 21,4 mg GAEMA (70,0 nmol) i reaktionen.
  4. Till respektive Schlenk-rör (dvs., 3,2 eller 3,3), sekventiellt lägga 50 ul DMF innehållande 0,53 mg (4-cyanopentansyra) -4-dithiobenzoate (1,9 pmol, RAFT medel), och 50 pl av DMF innehållande 250 | j, g av 4,4-azobis- (4-cyanovaleriansyra) (0,9 pmol, initiator). Blanda försiktigt genom finger avlyssning.
  5. Frys innehållet ingår i Schlenk-rör som utnyttjar en torr is: etanol bad (75 g torris i 100 ml etanol), applicera ett vakuum inom 10-50 mTorr, stäng sedan Schlenk ventilen och tillåta lösningen att långsamt tina till RT . Upprepa detta frys evakuera-upptiningscykel två gånger. Se till att alla reagenser upplöses efter den sista upptining.
  6. Placera Schlenkrör i en förslutningsbar plast bag, evakuera påsen luft, och sedan försegla den. Överför påsen med Schlenk-rör till ett vattenbad som förvärmts vid 70 ° C och inkubera i 24 h.
  7. Försiktigt överföra lösningen i Schlenk-rör till en preparerad dialyspåse (MWCO = 3,500), och dialysera mot dH 2 O (10 x 2 L) under 24 timmar, ändra dH 2 O varje timme för de första 8 tim. Efter dialys, överföra provet från dialysslangen till ett provrör, frysa provet vid -80 ° C, och sedan lyofilisera det.

Obs: Den erhållna statistiska poly-metakrylamid / akrylamid (PMA) sampolymerer innehållande vidhängande 4- O -β-D-galaktopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (från steg 3,2) eller D-gluconamide (från steg 3,3), respektive, är erhölls. För att underlätta diskussionen, är dessa två glycopolymers förkortat PMA-LAEMA och PMA-GAEMA, respektive.

4. Post-modifiering av Glycopolymers med Fluoroforer

  • Lös 5,0 mg glycopolymer PMA-LAEMA eller PMA-GAEMA innehållande ~ 0,9 umol primär aminfunktionella grupper i 0,9 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,5), respektive.
  • Tillsätt långsamt 0,6 mg karboxifluorescein succinimidylester i 100 ul DMF till lösningarna med snabb omrörning. Försiktigt rör reaktionerna under 16 timmar i mörker vid RT.
  • Medan skyddas från ljus, ladda provet i ett förberett dialysrör (MWCO = 3,500) och dialysera mot dH 2 O (2 L) under 16 timmar, ändra dialyslösningen varje timme för de första 8 tim. Efter dialys, överföra provet från dialysslangen till ett provrör, frysa provet vid -80 ° C, och sedan lyofilisera det.
  • Obs: Efter frystorkning, fluorescerande glycopolymers PMA-LAEMA-fluorescein och PMA-GAEMA-Fluorescein respektive erhålls.

    5. Karakterisering av Glysampolymerer

    1. Bestäm talmedelmolekylvikt (Mn), viktmedelmolekylvikt (Mw) och dispersitet (Mw / Mn) av glycopolymers på kommersiell HPLC-system utrustat med gelpermeationskromatografi (GPC) programvara, en GPC- kolonn som lämpar sig för molekylvikten av intresse, och en brytningsindexdetektor med användning av 0,1 M Tris / 0,1 M natriumkloridbuffert (pH 7) som elueringsmedel vid en flödeshastighet av 0,6 ml / minut 14. Använd polyetylenglykol standarder som molekylviktstandarder (MW: 200-1,200,000 g / mol).
    2. Kvantifiera verkliga koncentrationerna av primära aminfunktionella grupper inom glycopolymers 16. Analysera det totala kolhydratinnehållet i de syntetiserade glycopolymers enligt en publicerad metod 17.
    3. Utför tester av strukturella sammansättning och renhet hos glycomonomers LAEMA, GAEMA och glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA i D2O genom NMR-spektroskopi 14.

    6. Tvingande Tester av Syntetiska Glycopolymers med lektin-belagda agarospärlor

    1. Tillsätt 1,5 ml PBS till 50 il suspension av Erythrina Crista-Galli lektin (ECL) -belagda agaroskulor, centrifugera vid 300 xg under 1 minut, och försiktigt bort och kassera supernatanten. Upprepa detta steg två gånger, och sedan resuspendera pärlorna i 0,5 ml PBS.
    2. Lägg 3 ug av PMA-LAEMA-fluorescein eller PMA-GAEMA-fluorescein (negativ kontroll) i 6 pl PBS till pärlorna suspensionen och inkubera blandningarna, i mörker, vid RT under 1 timme.
    3. Tvätta blandningarna med 1,5 ml PBS tre gånger, och återsuspendera pärlorna i 0,2 ml PBS. Ladda en delmängd (4 pl) i en brunn på en immunofluorescens objektglas (teflonbelagd), täck med ett täckglas, och observera genom fluorescensmikroskopi med hjälp av en FITC-filter (excitationsvåglängd: 467-498 nm, emissionsvåglängd: 513- 566 nm) och en 10X mål att undersöka bindningen av than fluorescerande glycopolymers med pärlorna 14.

    Representative Results

    Syntes av glycomonomer

    Laktobionsyra användes häri som ett exempel för framställning av glycomonomers. Använda metoder i den första rapporten om syntesen av LAEMA 11, var varierande utbyten vid framställning med otillfredsställande renhet observeras. Den modifierade reningsmetod med användning av katjon- och anjonbytarhartser för att avlägsna oreagerat utgångsmaterial erbjuds stabil produkt utbyte och hög renhet, vilket bekräftas av ett H och 13 C-NMR-spektroskopi (fig 1).

    RAFT glycopolymer syntes och efter-modifiering av glycopolymers med fluoroforer

    I motsats till de block glycopolymers framställda genom stegade RAFT polymerisationer, ger detta en-stegs sampolymerisation protokoll en likformig glycomonomer fördelning i hela polymerskelettet. De glycopolymers visas här innehåller 20 mol% av glycomonomer bekräftade 77 mol-% av HEAA som ett distansorgan, och 3 mol-% av AEMA som ett mål för post-modifieringar (se figur 2). 1 H- och 13 C-NMR-spektroskopi strukturerna för PMA-LAEMA och PMA-GAEMA (figurerna 3 och 4). Såsom visas i fig 5, när de plottas mot de GPC elueringsprofilerna för den glycopolymer syntetiserade utan RAFT, både PMA-LAEMA och PMA-GAEMA har låga dispersiteter, bevisar effektiviteten av FLOTTE tillvägagångssätt. Som förväntat har PMA-GAEMA a Mn mindre än den hos PMA-LAEMA grund av PMA-GAEMA brist på en vidhängande socker. Analys av kolhydraterna och primära aminfunktionella grupper innehåll hos flotten glycopolymers avslöjade att förhållandet av monomerer i produkt glycopolymers är förenlig med det stökiometriska förhållandet mellan utgångs monomerer som användes i flotte-medierad polymerisationsreaktion (tabell 1). Detta innebär en noggrann kontroll av monomeren compositions i de syntetiserade glycopolymers, som avsett.

    Reaktion av primära aminfunktionella grupper med aktiverade fluoroforer är en allmänt använd teknik i proteinmärkning. Denna teknik användes för att märka renade glycopolymers med karboxifluorescein. Efter post-modifiering, har fluorescerande polymerer erhölls (figur 6). Ingen nedbrytning av de fluorescein-märkta polymerer i reaktionen detekterades genom GPC-analys (data ej visade).

    Bindande tester av de syntetiska glycopolymers med lektin belagda agarospärlor

    För att bedöma den lektin-bindningsspecificiteten för de syntetiserade glycopolymers ades lektin-belagda agarospärlor med känd kolhydratbindande specificitet används. Erythrina crista-galli lektin (ECL), som användes i experimenten, har en bindningsspecificitet mot β-D-galaktosid. Figur 7A visar tydligt att PMA-LAEMA-Fluorescein, som innehåller β-D-galaktosid som ett hänge kolhydrat, uppvisade stark bindning med ECL lektin. I motsats, den negativa bindning till ECL av glycopolymer PMA-GAEMA-fluorescein, som inte har en vidhängande socker, visas i figur 7B. Detta resultat exemplifierar bindningen effektivitet och affiniteten hos den syntetiserade fluorescerande glycopolymer.

    Figur 1
    Figur 1. Tilldelad 1 H- (a) och 13 C-NMR (b) spektra (D2O) för LAEMA. (Denna siffra har ändrats från Wang et al. 14) Klicka här för att se en större version av denna figur.

    <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 2
    Figur 2. Schematisk illustration av syntesen av fluorescerande glycopolymer PMA-LAEMA innehåller β-galaktosid som hängande socker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. Tilldelad 1 H- (A) och 13 C-NMR (B) spektra (D2O) för PMA-LAEMA glycopolymer. (Denna siffra har ändrats från Wang 14 et al.) GrundenSE klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 4
    Figur 4. Tilldelad 1 H- (A) och 13 C-NMR (B) spektra (D2O) för PMA-GAEMA. (Denna siffra har ändrats från Wang et al. 14) Klicka här för att se en större version av denna figur.

    Figur 5
    Figur 5. Gelpermeationskromatografi spår av RAFT-baserade PMA-GAEMA och PMA-LAEMA framställd med och utan användning av RAFT medel. I motsats till den PMA-LAEMA framställd utan RAFT medel (blå), RAFT- baserade PMA-LAEMA (grön) har en mycket lägre dispersitet (Mw / Mn). RAFT-baserade PMA-GAEMA (röd) och PMA-LAEMA har liknande GPC profiler, men den förra har en mindre M n på grund av avsaknad av hängande socker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 6
    Figur 6. PMA-LAEMA före och efter efter modifiering med fluoroforen. (A) Jämfört med vita icke-märkt glycopolymer (vänster rör), visar fluoresceinmärkt PMA-LAEMA en stark gul färg (höger rör). (B) Under UV, omärkta PMA-LAEMA (vänster rör, 1 mg / ml i PBS) är mörk och uppvisar ingen fluorescens, medan fluoresceinmärkt PMA-LAEMA (höger rör, 1 mg / ml i PBS) visar stark grön fluorescens.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 7
    Figur 7. Erythrina crista-galli lektin (ECL) -belagda agaroskulor binder β-D-galaktosid innehåller glycopolymers, och inte dem som inte har en hängande socker. (A) PMA-LAEMA-Fluorescein (3 mikrogram) visade stark bindning med ECL , medan det i (B) PMA-GAEMA-fluorescein, som uppvisar ingen vidhängande β-D-galaktosid-rest, visade ingen bindning med lektin-belagda pärlor. Skalstreck = 100 | am.

    Tabell 1. inriktningsvärden en av syntetiska parametrar och faktiska kompositioner av glycopolymers. A) Targeting värden, värden somönskas av produkterna; b) DP, grad av polymerisation; c) NA ej tillgänglig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    DP B Dispersitet Faktiska innehållet i glycomonomers
    mol-%
    Faktiska innehållet i primär amin
    mol-%
    Inriktning värden 100 <1,3 20 3
    PMA-LAEMA 99 1,26 19 3,2
    PMA-GAEMA 89 1,32 NA c 2,7

    Discussion

    En enkel och effektiv protokoll för RAFT-baserade tri-komponent fluorescerande glycopolymers, med och utan hänge kolhydrater, och deras användning i en lektin-bindande test, demonstreras i den här rapporten. Protokollet börjar med framställning av glycomonomers LAEMA och GAEMA. Genom ett en-stegs RAFT kontrollerade sampolymerisation, glycopolymers med reproducerbar utbyte, förutsägbar monomerkomposition och låg dispersitet, erhålles. Efter efter modifiering av glycopolymers med karboxifluorescein succinimidylester, bindningen av den resulterande respektive fluorescensmärkt glycopolymer lätt testbar för dess lektin-bindningsspecificitet.

    I den inledande preparativa stegen i glycomonomers som skall användas i de efterföljande glycopolymer synteser var lättillgängliga laktobionsyra och glukonolakton utnyttjas. I teorin, alla kolhydrater av intresse, från monosackarider till komplexa oligosackarider kan vara converted till glycomonomers genom att konjugera målet socker på den primära hydroxylgruppen på C6 av glukos. Efter oxidation av den reducerande glukosrest, och dess efterföljande dehydratisering till en lakton, kan produkten sedan lätt reageras med den primära aminen på AEMA att bilda motsvarande glycomonomer. Ytterligare exempel på denna väg kan ses i en färsk rapport 14. Det bör noteras att innan någon polymerisationssteget, MEHQ, en potent polymerisationsinhibitor, måste avlägsnas från alla monomerer och glycomonomer preparat strax före användning. Detta åstadkommes lätt genom att använda den minsta mängd metanol för att upplösa glycomonomer som besitter MEHQ sedan omedelbart behandla det med aceton vid -20 ° C för att fälla den inhibitorfria produkt i högt utbyte.

    Essential i varje radikalpolymerisation system, uppmärksamhet på detaljer och monomerer renhet betonas. Som är typiskt för en flotte polymerisationssystem, består aven radikalkälla, en flotte reagens, en monomer och lösningsmedel. I detta synlig presentation, är ett enda steg RAFT polymerisationssystem beskrivs som fokuserar på produktion av statistiska sampolymerer som genereras från en reaktionsblandning som har tre olika monomerer i en vattenlösning. Två separata RAFT-medierade reaktioner presenteras i vilka en utnyttjar en glycomonomer som besitter en vidhängande, icke-reducerande kolhydrat terminalen (dvs., β-D-galaktos), och den andra, som har en polyol utan bunden kolhydratrest. Gemensamt för båda flotte-medierade reaktioner var monomerer med en singulär hydroxylgrupp som fungerar som en spacermolekyl, och en annan som har en fri amin för post-modifiering med en aminreaktiv fluorofor.

    Eftersom närvaron av syre i reaktionsblandningen och miljö är skadlig för RAFT-medierad polymerisation, är dess avlägsnande för att spåra nivåer lätt åstadkommas genom flera frysnings-evacuate nings-upptiningscykler under bibehållande av Schlenk-rör reaktionskärl under högt vakuum.

    Det skall noteras att molförhållandet av olika monomerer i reaktions kan justeras efter behov. Också, genom att variera mängden av RAFT medel som används, längden av de erhållna polymererna kan kontrolleras 18. Emellertid bör det molära förhållandet av RAFT medlet till initiator alltid vara större än två för att säkerställa låg dispersitet av produkten. Under dessa betingelser, är utvecklingen av sampolymerisationen stadig, och reproducerbarheten av reaktionen är mycket hög. Med detta sagt, är det osannolikt att man erhåller en helt jämn fördelning av alla deltagande monomerer inom en statistisk sampolymer, på grund av deras olika polymerisationsprocesser hastigheter. Characterizing fördelningen av olika monomerer i polymeren är fortfarande mycket utmanande.

    Efter modifiering metod, som presenteras här, är både enklare och mer amenable till användningen av ett bredare urval av fluorescerande markörer, jämfört med andra protokoll som tillämpas på etikett glycopolymers 2,11. Dessa skulle omfatta många av de vattenlösliga aminreaktiva fluoroforer, kvantprickar, biotiner, och andra. Bindnings särdragen hos de syntetiserade, märkta glycopolymers lätt verifierbara använder lektiner med kända bindningsaffiniteter. PMA-GAEMA besitter ingen hängande socker är en lämplig negativ kontroll. Glycopolymers med olika fluorescerande märkningar framställda via denna väg har med framgång använts i undersökningar av lektin-medierad bakteriell bindning 14. Som framgår, bör detta enkel och effektiv framställning av statistiska fluorescerande glycopolymers ger stora möjligheter till ett brett utbud av glycobiological forskning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9, (8), 757-764 (1999).
    2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33, (28), 6889-6897 (2012).
    3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
    4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49, (5), 1079-1131 (2007).
    5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45, (11), 2059-2072 (2007).
    6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7, (1), 232-238 (2006).
    7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
    8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
    9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
    10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20, (5), 994-1001 (2009).
    11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42, (17), 6393-6405 (2009).
    12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1503-1512 (2011).
    13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213, (17), 1768-1782 (2012).
    14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31, (2), 133-143 (2014).
    15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47, (2), 614-627 (2009).
    16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1690-1699 (2011).
    17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. CRC Press. 87-170 (1989).
    18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37, (24), 8941-8950 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics