Facile og effektiv forberedelse af Tri-komponent fluorescerende Glycopolymers via RAFT-kontrolleret polymerisation

1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri
Chemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Syntetiske glycopolymers er instrumentale og alsidige værktøjer, der anvendes i forskellige biokemiske og biomedicinske forskningsområder. Et eksempel på en let og effektiv syntese af velkontrollerede fluorescerende statistiske glycopolymers igennem reversibel tilsætning-fragmentering kæde-overførsel (RAFT) -baseret polymerisation påvises. Syntesen begynder med fremstillingen af β-galactose-holdige glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamid fremstillet ved reaktion mellem lactobionolactone og N - (2-aminoethyl) methacrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl methacrylamid (GAEMA) anvendes som en strukturel analog mangler en terminal β-galactosid. Følgende RAFT-medieret copolymerisationsreaktion omfatter tre forskellige monomerer: N - (2-hydroxyethyl) acrylamid som afstandsstykke, AEMA som mål for yderligere mærkning fluorescens, og glycomonomers. Tolerant over vandige systemer, raft middel anvendt i reaktionen, er (4-cyanpentansyre) -4-dithiobenzoate.Lave dispersities (≤1.32), forudsigelige copolymersammensætninger og høj reproducerbarhed af polymerisationerne blev observeret blandt de produkter. Fluorescerende polymerer opnås ved at modificere glycopolymers med carboxyfluorescein succinimidylester målretning den primære amin funktionelle grupper på AEMA. Lectin-bindende særlige forhold de resulterende glycopolymers verificeres ved at teste med tilsvarende agaroseperler belagt med specifikke glycoepitope genkende lektiner. På grund af den lette syntesen, den stramme kontrol af produktets sammensætninger og den gode reproducerbarhed af reaktionen denne protokol kan oversættes hen imod fremstilling af andre raft-baserede glycopolymers med specifikke strukturer og sammensætninger, som ønsket.

Introduction

I de seneste to årtier har undersøgelser med syntetiske glycopolymers gennemgået langsom men konstant udvikling, hvilket viser et betydeligt potentiale i at undersøge smitsomme mekanismer, der omfatter forskning, der fokuserer på lectin anerkendelse processer 1-3. Eftersom syntetiske glycopolymers besidder multivalente sukkergrupper udviser meget højere lectin-bindende effektiviteter sammenlignet med monovalente kulhydrater, er de af stor efterspørgsel i glycobiology felt 3. Af særlig interesse i den kliniske forskning er brugen af ​​fluorescerende glycopolymers at karakterisere lectin-medierede bakteriel binding med kulhydrater rådighed på humane respiratoriske celleoverflader og slim glycoprotein. Tidligt i vitro studier beskæftiget kommercielt tilgængelige polyacrylamid-baserede glycopolymers i bakterielle bindende tests. Flere af disse prober viste lovende resultater, men udtrykt bekymring med hensyn til, anskaffe, og meget-til-masse afvigelser i både polYmer molekylvægt og glycoepitope indhold. En økonomisk in-laboratoriet protokol blev udviklet som vil give en tilfredsstillende styring af indhold struktur, størrelse og renhed af syntetiske glycopolymers målrettet bakterielle lektiner.

På jagt efter en egnet syntetisk tilgang til glycopolymers blev en forholdsvis ny polymerisationsteknik testet ved hjælp af en form for kontrolleret radikalpolymerisation der ansat reversibel tilføjelse-fragmentering kæde-transfer (Raft) agenter 4. Sådanne raft reagenser er for nylig blevet anvendt i et par glycopolymer præparater 5-7. Sammenlignet med andre glycopolymer forberedelse protokoller, raft-medierede polymerisationer påvise adskillige fordele, herunder tolerance over for en række forskellige monomere strukturer og reaktionsbetingelser, potentiel kompatibilitet med vandige opløsninger, og lav størrelse dispersitet de ønskede polymere produkter 8,9. Af bemærkelsesværdige interesse er protokoller for udarbejdelse af RAFT-baSED tri-komponent glycopolymers, hvilket tillader kontrol af sammensætninger af forskellige monomerer, som hver især kan have særskilte funktioner 10-13. Men de fleste af de tidligere forskning bestræbelser enten manglede anomere vedhæng carbohydrater 10 eller ansat forskydninger polymerisationer resulterede i tri-blokcopolymerer, der består af kovalent bundne homopolymerer, som ofte tjener forskellige formål end statistiske polymerer, som er copolymerer, hvori sekvensen af monomer rester følge en statistisk regel 9-13.

Nylig, anvendelse af den thiocarbonylthio RAFT forbindelse (4-cyanpentansyre) -4-dithiobenzoate i et vandigt miljø, fremstilling af en gruppe af RAFT-baserede lineære tri-komponent statistiske glycopolymers indeholdende specifikke vedhæng sukkerarter og deres anvendelse i lectin-medieret bakteriel binding tests blev rapporteret 14. Det overordnede mål med denne metode, præsenteres på en visuel måde, er at forberede tri-komponentstatistiske fluorescerende glycopolymers via RAFT-kontrollerede copolymerisation. Grund af den lethed af en-trins polymerisation protokollen, fin kontrol over polymerlængde og sammensætninger, og den høje reproducerbarhed af reaktionen denne protokol kan let anvendes på andre raft-baserede synteser af glycopolymers med ønskede strukturer.

Protocol

1. Syntese af Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl methacrylamid

  1. 2 g lactobionsyre opløses i 3,0 ml vandfri methanol og tilsæt langsomt absolut ethanol i en dråbevis måde, indtil opløsningen netop bliver grumset, derefter fjerne opløsningsmidlerne via rotationsfordampning.
  2. Opløs remanensen fra trin 1.1, i 3,0 ml vandfri methanol og endnu en gang, tilsæt langsomt absolut ethanol indtil lige overskyet, derefter fordampe opløsningsmidlerne via rotationsfordampning. Gentag dette trin 3 gange for at opnå lactobiono-1,5-lacton (1,94 g, 98% udbytte). Dette produkt er af tilstrækkelig renhed til at blive anvendt i de følgende reaktioner.
  3. Tilsæt 1,0 g lactobionolactone i 3,0 ml methanol til N - (2-aminoethyl) methacrylamid (AEMA, 0,58 g) og hydroquinonmonomethylether (MEHQ, 1,0 mg), en inhibitor af selv-polymerisering, i 2,0 ml methanol efterfulgt med 1,0 ml triethylamin. Der omrøres ved stuetemperatur i 48 timer.
  4. Tilsættes 20 ml deioniseret H2O (DH 2
  5. For at fjerne eventuelt resterende lactobionsyre, tilsættes 20 ml dH2O, derefter sende den vandige opløsning gennem en anionbyttersøjle (OH - form 10 mm x 20 mm) ind i en modtagende bægerglas indeholdende 1,0 mg MEHQ.
  6. Fjerne triethylamin, fremstillet i trin 1.5, ved inddampning til tørhed via rotationsfordampning.
  7. Der tilsættes 20 ml dH2O og fjerne uomsat AEMA ved langsomt at tilsætte 1 mg alikvoter af kationbytterharpiks (H + form), indtil der ikke ninhydrin reaktive materialer er påviselige. Overvåge fjernelsen ved at tage 1 pi alikvoter af opløsningen efter hver harpiks desuden anvende den på en tyndtlagschromatografi plade, derefter sprøjte pladen med en 2% ninhydrin i ethanol opløsning. Når der ikke observeres dybblå farve for at udvikle sig, når pladen opvarmes til 90 ° C i 1 minut, er nået slutpunktet.
  8. Fjern MEHQ fra prøven ved at opløse det frysetørrede materiale i en minimal mængde methanol (~ 0,5 ml), tilsæt derefter kold vandfri acetone (-20 ° C, 15 ml) til udfældning af produktet. Bundfaldet filtrering under anvendelse af en frittet glastragt og derefter tørre bundfaldet i en ekssikkator under vakuum til opnåelse af 2-lactobionamidoethyl methacrylamid (LAEMA) som et off-white pulver (0,94 g, 68% udbytte). Dette produkt er af tilstrækkelig renhed til at blive anvendt i de følgende reaktioner.

2. Syntese af monomer 2-Gluconamidoethyl methacrylamid

Bemærk: fremstilling af 2-gluconamidoethyl -methacrylamid (GAEMA), som ikke besidder en pendant sukker, blev tilpasset fra en offentliggjort metode 15.

  1. Tilsæt 2,0 g AEMA opløst i 10 ml methanol til en opløsningaf D-gluconolacton (1,6 g) i 30 ml methanol og under omrøring tilsættes langsomt 1,6 ml triethylamin.
  2. Reaktionen ved stuetemperatur i 24 timer Omrør.
  3. Filtrere det udfældede produkt ved anvendelse af en frittet glastragt og skyl bundfaldet tre gange med 10 ml af hver af isopropanol, vask derefter med 10 ml tør acetone. Tør udfældede produkt i en ekssikkator under vakuum.

3. RAFT Glycopolymer Synthesis

  1. For at fjerne hæmmeren MEHQ stede i kommerciel N - (2-hydroxyethyl) acrylamid (HEAA), tilsættes 1 ml af HEAA til et 2 ml mikrocentrifugerør, efterfulgt af tilsætning af 0,5 g aluminiumoxid nanopartikler. Centrifugeres røret ved 300 xg i 30 sek, og bruge det øverste lag HEAA i den følgende reaktion.
  2. Derefter tilsættes forsigtigt 32,8 mg LAEMA (70,0 pmol), 1,7 mg AEMA (10,5 pmol) og 27,5 pi HEAA (270 pmol), alle opløst i 0,4 ml dH2O, til en grundigt rengjort 1 ml Schlenk-rør, således har en monomis molforhold på 20: 3: 77.
  3. I en parallel reaktion, for at producere kontrol- polymerer, som ikke har nogen vedhæng sukker, i stedet for at bruge LAEMA i trin 3.2, erstatte 21,4 mg GAEMA (70,0 pmol) i reaktionen.
  4. Til de respektive Schlenk-rør (dvs. 3,2 eller 3,3), sekventielt tilsættes 50 pi DMF indeholdende 0,53 mg af (4-cyanpentansyre) -4-dithiobenzoate (1,9 pmol, FLÅDE agent), og 50 pi DMF indeholdende 250 ug 4,4'-azobis (4-cyanovalerianesyre) (0,9 pmol, initiator). Bland forsigtigt ved finger aflytning.
  5. Fryse indholdet er indeholdt i Schlenk-rør under anvendelse af et tøris: ethanol-bad (75 g tøris i 100 ml ethanol), anvende et vakuum til inden for 10-50 mTorr, luk derefter Schlenk ventilen og tillade opløsningen langsomt tø til RT . Gentag denne fryse-evakuere-tø cyklus to gange mere. Sørg for, at alle reagenser opløses efter den sidste optøning.
  6. Placer Schlenk-rør i en forseglelig plast bag, evakuere posen luft, og derefter forsegle den. Overføre posen med Schlenk-rør til et vandbad forvarmet ved 70 ° C og inkuberes i 24 timer.
  7. Overføre omhyggeligt opløsningen i Schlenk-rør til en forberedt dialysepose (MWCO = 3.500), og dialyseres mod dH2O (10 x 2 I) i 24 timer, hvilket ændrer dH2O hver time i de første 8 timer. Efter dialyse overføre prøven fra dialyserøret til et reagensglas, frys prøven ved -80 ° C, og derefter lyofiliseres den.

Bemærk: Det resulterende statistiske poly-methacrylamid / acrylamid (PMA) copolymerer indeholdende vedhæng 4-O -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (fra trin 3.2) eller D-gluconamide (fra trin 3.3) er de respektive opnået. For bekvemmelighed diskussion, er disse to glycopolymers forkortet PMA-LAEMA og PMA-GAEMA hhv.

4. Post-modifikation af Glycopolymers med Fluoroforer

  • Opløs 5,0 mg glycopolymer PMA-LAEMA eller PMA-GAEMA indeholdende ~ 0,9 pmol af primær aminfunktionelle grupper i 0,9 ml phosphatbufret saltvand (PBS, 0,1 M natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,5), henholdsvis.
  • Tilsættes langsomt 0,6 mg carboxyfluorescein succinimidylester i 100 pi DMF til løsninger med hurtig omrøring. Røre forsigtigt reaktioner for 16 timer i mørke ved stuetemperatur.
  • Mens beskyttet mod lys, indlæse prøven i en forberedt dialyseslanger (MWCO = 3.500), og dialyseres mod dH2O (2 L) i 16 timer, ændre dialyseopløsningen hver time for de første 8 timer. Efter dialyse overføre prøven fra dialyserøret til et reagensglas, frys prøven ved -80 ° C, og derefter lyofiliseres den.
  • Bemærk: Efter lyofilisering, fluorescerende glycopolymers PMA-LAEMA-fluorescein og PMA-GAEMA-Fluorescein henholdsvis opnås.

    5. Karakterisering af Glycopolymerer

    1. Bestemme antallet gennemsnitlig molekylvægt (Mn), den vægtgennemsnitlige molekylvægt (Mw) og dispersitet (Mw / Mn) af de glycopolymers på et kommercielt HPLC-system udstyret med gelpermeationskromatografi (GPC) software, en GPC kolonne egnet til molekylvægten af interesse og et brydningsindeks-detektor, anvendelse af 0,1 M Tris / 0,1 M natriumchlorid (pH 7) som eluent ved en strømningshastighed på 0,6 ml / min 14. Anvende polyethylenglycol standarder som molekylvægtstandarder (MW: 200-1,200,000 g / mol).
    2. Kvantificere de faktiske koncentrationer af primær amin funktionelle grupper inden for de glycopolymers 16. Analysere det totale indhold af de syntetiserede glycopolymers kulhydrat efter en offentliggjort fremgangsmåde 17.
    3. Udfør test af strukturelle sammensætning og renhed glycomonomers LAEMA, GAEMA og glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA i D2O ved NMR spektroskopi 14.

    6. Bindende Tests af de syntetiske Glycopolymers med Lectin-belagte agaroseperler

    1. Tilføj 1,5 ml PBS til 50 pi suspension af Erythrina crista-galli lektin (ECL) overtrukne agaroseperler, centrifuger ved 300 xg i 1 min, og fjern og bortskaffe supernatanten omhyggeligt. Gentag dette trin to gange og derefter resuspenderes perlerne i 0,5 ml PBS.
    2. Tilsæt 3 ug PMA-LAEMA-fluorescein eller PMA-GAEMA-fluorescein (negativ kontrol) i 6 pi PBS til perlerne suspension, og inkuberes blandingerne, i mørke, ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Vask blandingerne med 1,5 ml PBS tre gange, og resuspender perler i 0,2 ml PBS. Indlæse en portion (4 pi) i en brønd på en immunfluorescens mikroskopobjektglas (teflonbelagt), dække med en dækglas, og observere ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et FITC-filter (excitationsbølgelængde: 467-498 nm, emissionsbølgelængde: 513- 566 nm) og en 10X målsætning om at undersøge bindingen af ​​than fluorescerende glycopolymers med perlerne 14.

    Representative Results

    Syntese af glycomonomer

    Lactobionsyre blev anvendt heri som et eksempel til fremstilling af glycomonomers. Ved hjælp af metoder i den første rapport om syntesen af LAEMA 11 blev varieret udbytter i præparatet med utilfredsstillende renhed overholdes. Den modificerede oprensningsmetode ved anvendelse kation- og anionbytterharpikser at fjerne uomsat udgangsmateriale tilbydes stabilt produkt udbytte og med høj renhed, hvilket bekræftes ved 1H og 13C NMR spektroskopi (figur 1).

    RAFT glycopolymer syntese og post-modifikation af glycopolymers med fluoroforer

    I modsætning til blok-glycopolymers fremstillet gennem en øget raft polymerisationer, denne ene-trins copolymerisation protokol giver en ensartet glycomonomer fordeling i hele polymerskelettet. De viste glycopolymers indeholder 20 mol% af glycomonomer, 77 mol% HEAA som afstandsstykke, og 3 mol% AEMA som et mål for post-ændringer (se figur 2). 1 H- og 13C-NMR-spektroskopi bekræftede strukturerne af PMA-LAEMA og PMA-GAEMA (figur 3 og 4). Som vist i figur 5, når den afbildes mod GPC elueringsprofiler af glycopolymer syntetiseret uden FLÅDE, både PMA-LAEMA og PMA-GAEMA har lave dispersities, beviser effektiviteten af raft tilgang. Som forventet PMA-GAEMA har en Mn mindre end PMA-LAEMA grund PMA-GAEMA mangel af en vedhængende sukker. Analyse af kulhydrater og primær amin-funktionelle grupper indhold af raft glycopolymers afslørede, at forholdet mellem monomerer i produktet glycopolymers er i overensstemmelse med det støkiometriske forhold mellem udgangsmonomerer beskæftigede i RAFT-medieret polymerisationsreaktion (tabel 1). Dette betyder en stram styring af monomeren Sammensætningns i de syntetiserede glycopolymers, som designet.

    Reaktion af primær amin funktionelle grupper med aktiverede fluoroforer er en udbredt teknik i protein mærkning. Denne teknik blev anvendt her til at mærke oprensede glycopolymers med carboxyfluorescein. Efter post-modifikation, blev fluorescerende polymerer opnået (figur 6). Ingen nedbrydning af fluoresceinmærkede polymerer i reaktionen blev detekteret ved GPC-analyse (data ikke vist).

    Bindende test af de syntetiske glycopolymers med lectin-overtrukne agaroseperler

    For at vurdere lectin-bindingsspecificiteten af de syntetiserede glycopolymers blev lectin-belagte agaroseperler med kendt kulhydrat bindingsspecificitet anvendes. Erythrina crista-galli lectin (ECL), anvendes i forsøgene, har en bindende specificitet mod β-D-galactosid. Figur 7A viser tydeligt, at PMA-LAEMA-Fluorescein, som indeholder β-D-galactosid som et vedhæng kulhydrat, udviste stærk binding med ECL lectin. I modsætning hertil negative binding til ECL af glycopolymer PMA-GAEMA-fluorescein, som ikke besidder et vedhæng sukker, er vist i figur 7B. Dette resultat eksemplificerer bindende effektivitet og affinitet af det syntetiserede fluorescerende glycopolymer.

    Figur 1
    Figur 1. Tildelt 1 H- (a) og 13 C-NMR (b) spektre (D2O) for LAEMA. (Dette tal er blevet ændret fra Wang et al. 14) Klik her for at se en større version af dette figur.

    <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid"> Figur 2
    Figur 2. Skematisk illustration af syntesen af fluorescerende glycopolymer PMA-LAEMA indeholder β-galactosid som pendant sukker. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. Tildelt 1 H- (A) og 13 C-NMR (B) spektre (D2O) for PMA-LAEMA glycopolymer. (Dette tal er blevet ændret fra Wang et al. 14) Anbringendetse klik her for en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Tildelt 1 H- (A) og 13 C-NMR (B) spektre (D2O) for PMA-GAEMA. (Dette tal er blevet ændret fra Wang et al. 14) Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5. gelpermeationschromatografi spor af RAFT-baserede PMA-GAEMA og PMA-LAEMA fremstillet med og uden brug FLÅDE agent. I modsætning til PMA-LAEMA fremstillet uden FLÅDE middel (blå), RAFT- baserede PMA-LAEMA (grøn) har en meget lavere dispersitet (Mw / Mn). RAFT-baserede PMA-GAEMA (rød) og PMA-LAEMA har lignende GPC profiler, men den tidligere har en mindre M n på grund af mangel af vedhæng sukker. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6. PMA-LAEMA før og efter post-modifikation med fluoroforen. (A) I forhold til hvid ikke-mærkede glycopolymer (venstre rør), fluorescein-mærket PMA-LAEMA viser en stærk gul farve (højre rør). (B) under UV, ikke-mærket PMA-LAEMA (venstre rør, 1 mg / ml i PBS) er mørke og præsenterer med ingen fluorescens, hvorimod fluoresceinmærket PMA-LAEMA (højre rør, 1 mg / ml i PBS) shows stærk grøn fluorescens.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 7
    Figur 7. Erythrina crista-galli lectin (ECL) overtrukne agaroseperler binder β-D-galactosid indeholdende glycopolymers, og ikke dem, der ikke besidder en pendant sukker. (A) PMA-LAEMA-fluorescein (3 ug) viste stærk binding med ECL , hvorimod i (B) PMA-GAEMA-fluorescein, som besidder ingen vedhængende β-D-galactosid-rest, viste ingen binding med de lectin-coatede perler. Målestok = 100 um.

    Tabel 1. målretningsværdier en af syntetiske parametre og faktiske sammensætninger af de glycopolymers. A) Målretning værdier, værdier, derønskes af produkterne; b) DP, polymerisationsgrad; c) NA, ikke tilgængelig. Klik her for at se en større version af dette tal.

    DP b Dispersitet Selve indholdet af glycomonomers
    mol-%
    Faktiske indhold af primær amin
    mol-%
    Målretning værdier 100 <1,3 20 3
    PMA-LAEMA 99 1.26 19 3.2
    PMA-GAEMA 89 1,32 NA c 2.7

    Discussion

    En letkøbt og effektiv protokol for RAFT-baserede tri-komponent fluorescerende glycopolymers, med og uden et vedhæng kulhydrat, og deres anvendelse i en lektin-bindende test, er påvist i denne rapport. Protokollen starter med udarbejdelse af glycomonomers LAEMA og GAEMA. Gennem en ettrins RAFT-kontrollerede copolymerisation, glycopolymers med reproducerbar udbytte forudsigelig monomersammensætning og lav dispersitet, opnås. Efter post-modifikation af glycopolymers med carboxyfluorescein succinimidylester, bindingen af ​​den resulterende respektive fluorescensmærket glycopolymer er let testes for sin lectin-bindingsspecificitet.

    I de indledende fremstillingstrin for glycomonomers, der skal anvendes i de efterfølgende glycopolymer synteser blev let tilgængelige lactobionsyre og gluconolacton udnyttet. I teorien, nogen kulhydrater af interesse, fra monosaccharider til komplekse oligosaccharider, kan være converted til glycomonomers ved konjugering målet sukker på den primære hydroxylgruppe på C6 af glucose. Efter oxidation af den reducerende glucose-rest, og den efterfølgende dehydratisering til en lacton, kan produktet derefter let omsættes med den primære amin på AEMA at danne den tilsvarende glycomonomer. Kan ses Yderligere eksempler på denne rute i en nylig rapport 14. Det skal bemærkes, at inden nogen polymerisationstrin, MEHQ, en potent polymerisationsinhibitor, skal fjernes fra alle monomere og glycomonomer præparater lige før brug. Dette opnås let ved anvendelse af den minimale mængde methanol for at opløse glycomonomer der besidder MEHQ derefter straks behandle det med acetone ved -20 ° C til udfældning af inhibitor-frie produkt i højt udbytte.

    Afgørende i enhver radikalpolymerisering ordning, er opmærksomhed på detaljer og monomere renheder fremhæves. Som det er typisk i et kompleks polymerisationssystemet, den består afen radikal kilde, en bunke reagens, en monomer og opløsningsmiddel. I denne visualiseret præsentation, er et enkelt trin RAFT polymerisation beskrevne system, der fokuserer på udarbejdelse af statistiske copolymerer frembragt fra en reaktionsblanding besidder tre forskellige monomerer i en vandig opløsning. To separate raft-medierede reaktioner præsenteres i hvilken man anvender en glycomonomer der besidder en pendant, ikke-reducerende carbohydrat terminus (dvs. β-D-galactose), og det andet, der besidder en polyol uden bundne carbohydratrest. Fælles for begge raft-medierede reaktioner var monomerer besidder en enestående hydroxylgruppe, der fungerer som en spacer-molekyle, og en anden besidder en fri amin for post-modificering med en amino-reaktiv fluorophor.

    Idet tilstedeværelsen af ​​oxygen i reaktionsblandingen og miljø er skadelig for RAFT-medieret polymerisation, er dens fjernelse at spore niveauer let opnås via adskillige fryse-evaCuate-tø cykler mens Schlenk-rør reaktionsbeholder under højvakuum opretholdelse.

    Det skal bemærkes, at det molære forhold mellem forskellige monomerer i reaktionen kan justeres efter behov. Også ved at variere mængden af FLÅDE middel, længden af de resulterende polymerer kan reguleres 18. Imidlertid bør det molære forhold af raft middel og initiator altid være større end to for at sikre den lave dispersitet af produktet. Under disse betingelser, udviklingen i copolymerisationen er stabil, og reproducerbarheden af ​​reaktionen er meget høj. Det er sagt, er det usandsynligt, at man opnår en fuldstændig ensartet fordeling af alle deltagende monomerer inden for en statistisk copolymer, grundet deres forskellige polymerisationsprocesser hastigheder. Karakterisering fordelingen af ​​forskellige monomerer i polymeren er stadig meget udfordrende.

    Den post-modifikation metode, præsenteres her, er både enklere og mere amenable til anvendelsen af et bredere udvalg af fluorescerende mærker, sammenlignet med andre protokoller, der anvendes til mærkning glycopolymers 2,11. Disse vil omfatte mange af de vandopløselige aminreaktive fluoroforer, quantum dots, biotiner, og andre. Bindingsspecificiteterne af syntetiserede, mærkede glycopolymers let kontrollerbar bruger lektiner med kendte bindingsaffiniteter. PMA-GAEMA besidder ingen pendant sukker er en passende negativ kontrol. Glycopolymers med forskellige fluorescerende markører fremstillet via denne rute er blevet anvendt med succes i undersøgelser af lektin-medieret bakteriel binding 14. Som præsenteret, bør letkøbt og effektiv forberedelse af statistiske fluorescerende glycopolymers giver stort potentiale for en bred vifte af glycobiological forskning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9, (8), 757-764 (1999).
    2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33, (28), 6889-6897 (2012).
    3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
    4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49, (5), 1079-1131 (2007).
    5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45, (11), 2059-2072 (2007).
    6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7, (1), 232-238 (2006).
    7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
    8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
    9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
    10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20, (5), 994-1001 (2009).
    11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42, (17), 6393-6405 (2009).
    12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1503-1512 (2011).
    13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213, (17), 1768-1782 (2012).
    14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31, (2), 133-143 (2014).
    15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47, (2), 614-627 (2009).
    16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1690-1699 (2011).
    17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. CRC Press. 87-170 (1989).
    18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37, (24), 8941-8950 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics