RAFT 중합 제어를 통해 트라이 구성 요소 형광 Glycopolymers의 손쉬운 및 효율적인 준비

1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri
Chemistry
 

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Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

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Abstract

합성 glycopolymers 다양한 생화학 및 생물 의학 연구 분야에서 사용되는 악기와 다양한 도구입니다. 가역성 부가 단편화 사슬 전달을 이용하여 잘 제어 된 형광 통계적 glycopolymers의 손쉬운 효율적인 합성 예 (RAFT) 기반 중합을 입증한다. (2- 아미노 에틸) 메타 크릴 (AEMA) - 합성은 lactobionolactone 및 N의 반응에 의해 얻어지는 β - 갈락토스 함유 glycomonomer 2 lactobionamidoethyl의 메타 크릴의 준비를 시작한다. 2 Gluconamidoethyl의 메타 크릴 (개마)는 단말기 β - 갈 락토가없는 구조 아날로그로 사용됩니다. (2- 히드 록시 에틸) 아크릴 아미드 등의 스페이서, AEMA 상기 형광 표지 용 대상으로 한 glycomonomers - N : 다음 RAFT 매개 공중합 반응은 세 가지 상이한 단량체를 포함한다. 수계 관대, 반응에 사용 RAFT 화제 (4- 시아 노펜 산 벤질) 디티 오이다.낮은 dispersities (≤1.32), 예측 공중 합체 조성물 및 중합의 재현성이 높은 제품 중 관찰되었다. 형광 중합체 AEMA에 차 아민 관능기를 타겟팅 카르복시 숙신 이미 딜 에스테르 glycopolymers을 수정하여 얻어진다. 결과 glycopolymers의 렉틴 결합 특이성은 특정 glycoepitope 인식 렉틴으로 코팅 해당 아가로 오스 비즈 시험에 의해 확인된다. 원하는 때문에 합성의 용이성, 제품 및 조성물의 엄격한 제어하고, 반응의 재현성이 프로토콜은, 특정 구조 및 조성이 다른 RAFT 기반 glycopolymers의 제조 향해 번역 될 수있다.

Introduction

지난 20 년 동안, 합성 glycopolymers와 조사는 인식을 렉틴 것은 1-3 처리에 초점을 맞추고 연구를 포함 감염 메커니즘을 조사에 상당한 잠재력을 보여주는, 느리지 만 지속적인 발전을 겪었다. 다가 당 잔기를 갖는 합성 glycopolymers 훨씬 높은 렉틴 - 결합 효능을 발휘하기 때문에 가의 탄수화물에 비해, 이들은 glycobiology 필드 3에서 큰 수요이다. 임상 연구에서 특히 관심 인간 호흡기 세포 표면 당 단백질 및 점액 볼 탄수화물 결합 렉틴 매개 세균을 특성화 형광 glycopolymers 사용하는 것이다. 초기 시험 관내 연구에서 박테리아의 결합 시험에서 시판되는 폴리 아크릴 아미드 계 glycopolymers을 채용. 이 프로브의 여러 결과를 약속했다,하지만 모두 POL에서, obtainability 및 로트 차이에 대한 우려를 제기ymer 분자량 glycoepitope 내용. 경제적 인 실험실 프로토콜 구조의 내용, 크기 및 세균 렉틴을 대상으로 합성 glycopolymers의 순도 만족스러운 제어를 제공 할 수있는 개발되었다.

glycopolymers에 적합한 합성 방법에 대한 검색에서, 상대적으로 새로운 중합 기술은 가역 부가 조각화 체인 전송 (뗏목) 제 4를 사용 제어 라디칼 중합의 종류를 사용하여 테스트 하였다. 이러한 뗏목 시약은 최근 몇 glycopolymer 준비 5-7에서 사용되어왔다. 다른 glycopolymer 준비 프로토콜과 비교했을 때, RAFT 매개 중합은 단량체 구조 및 반응 조건, 수용액 잠재적 호환성 및 원하는 중합체 제품 8,9 낮은 크기, 분산도의 다양한 내성 등 여러 장점을 보여준다. 주목할만한 관심 뗏목 바의 준비를위한 프로토콜은별개의 기능을 가질 수있다 (10-13) 각각은 다른 모노머의 조성의 제어를 허용 SED 트라이 성분 glycopolymers. 그러나, 이전의 연구 노력 중 대부분은 아노 머 펜던트 탄수화물 10 부족하거나 채용 종종 공중합 통계적 중합체보다 다른 목적을 제공 공유 결합 호모 폴리머로 구성 트리 블록 공중 합체에서 얻어진 중합은 단차하는 단량체의 시퀀스 잔류 물은 통계적 규칙 9-13을 따릅니다.

최근 thiocarbonylthio RAFT 화합물을 이용하는 (4- 시아 노펜 탄산) 등의 수용성 환경에서 -4- 디티의 집단의 제조를 특정 펜던트 당 및 그들의 애플리케이션을 포함하는 선형 삼 성분 통계적 glycopolymers를 RAFT는 계 렉틴 매개 결합 세균 시험은 14을보고 하였다. 시각적 방식이 제시하는 방법의 전체 목표는, 트리 성분을 제조하는 공정이다RAFT 제어 공중합을 통해 통계 형광 glycopolymers. 때문에 일 단계 중합 프로토콜의 용이성, 중합체 길이 및 조성, 반응의 재현성 위에 미세 제어는,이 프로토콜은 쉽게 원하는 구조와 glycopolymers 다른 RAFT 계 합성에 적용 할 수있다.

Protocol

Glycomonomer 1. 합성 2 Lactobionamidoethyl 메타 크릴

  1. 이 솔루션은 단지 흐린 될 때까지 한 방울 현명한 방식으로 무수 에탄올을 추가 천천히 무수 메탄올 3.0 ㎖에 락토 산 2g을 용해하고, 다음 rotoevaporation를 통해 용매를 제거합니다.
  2. 3.0 ml의 무수 메탄올과 다시 한번 천천히 다음, 그냥 흐린까지 무수 에탄올을 추가 rotoevaporation를 통해 용매를 증발 단계 1.1에서, 잔류 물을 용해. lactobiono -1,5- 락톤 (1.94 g, 수율 98 %)을 획득하기 위해이 공정을 3 회 반복한다. 이 제품은 다음 반응에 사용하기에 충분한 순도이다.
  3. N의 메탄올 3.0 ㎖에 lactobionolactone 1.0 g을 추가 - (2- 아미노 에틸) 메타 크릴 아미드 (AEMA, 0.58 g) 및 히드로퀴논 모노 메틸 에테르 (MEHQ, 1.0 ㎎)을, 자기 중합 억제제, 2.0 ml의 메탄올이 따랐다 트리 에틸 아민 1.0 ml로. 48 시간 동안 RT에서 교반 하였다.
  4. 탈 H 2 O 20 ㎖ (DH 2 추가
  5. MEHQ 1.0 ㎎을 함유 수신을 비커에 넣고, - (형태, 10mm X 20mm OH) DH 2 O 20㎖를 다음 음이온 교환 컬럼을 통해 수용액을 통과 추가 나머지 락토 산을 제거한다.
  6. rotoevaporation를 통해 건조 될 때까지 증발시켜, 단계 1.5에서 생산되는 트리 에틸 아민을 제거합니다.
  7. DH 2 O의 20 ML을 추가하고 천천히 반응 물질이 검출되어 더 닌히 드린까지 양이온 교환 수지 (H + 형태)의 1 mg의 분취 량을 추가하여 미 반응 AEMA를 제거합니다. 에탄올 용액에 2 % 닌히 드린과 플레이트 살포 박층 크로마토 판에 적용, 각 첨가 후 수지 액 1 ㎕를 분취 액을 취함으로써 제거를 모니터한다. 더 깊은 청색 판은 1 분 동안 90 ° C까지 가열 할 때에 개발이 관찰되지 않은 경우, 종료점에 도달했다.
  8. 냉간 무수 아세톤을 추가의 메탄올 (~ 0.5 ㎖)의 최소량 동결 건조 물질을 용해시킴으로써 샘플로부터 제거 MEHQ (-20 C, 15 mL의 °) 생성물을 침전. 다음 회백색 분말 (0.94 g, 수율 68 %) 2- lactobionamidoethyl 메타 크릴 아미드 (LAEMA)을 얻었다 진공하에 데시 케이 터 내에서 침전물을 건조, 프릿 유리 깔대기를 사용하여 여과에 의해 침전물을 수집. 이 제품은 다음 반응에 사용하기에 충분한 순도이다.

모노머의 합성 2. 2 Gluconamidoethyl 메타 크릴

참고 : 펜던트 설탕을 소유하지 않는 2 gluconamidoethyl의 메타 크릴 아미드의 제조 (개마)는, 게시 방법 (15)에서 적응했다.

  1. 용액에 메탄올 10 ㎖에 용해 AEMA 2.0 g 추가교반하면서 메탄올 30 ㎖에 D-글루 코노 락톤 (1.6 g) 및,의, 천천히 트리 에틸 아민 1.6 ml를 추가합니다.
  2. 24 시간 동안 실온에서 반응을 저어.
  3. 건조 후, 아세톤 10 mL로 세척, 프릿 유리 깔대기를 사용하여 침전 된 생성물을 여과하고 침전물을 이소프로판올 10 mL 씩 3 회 헹군다. 진공 데시 케이 터에 침전 된 제품을 건조시킵니다.

3. R​​AFT Glycopolymer 합성

  1. 상업적 N에 존재 MEHQ 억제제 제거 - (2- 히드 록시 에틸) 아크릴 아미드 (HEAA)을 산화 알루미늄 나노 입자 0.5 g을 첨가 한 다음 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 1 ㎖ HEAA를 추가한다. 30 초 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 다음 반응에 상부층 HEAA를 사용한다.
  2. 조심스럽게 LAEMA의 32.8 mg의 (70.0 μmol), AEMA 1.7 mg의 (10.5 μmol)과 HEAA (270 μmol)의 27.5 μl를 추가, 모든 따라서, 잘 정리 1 ml의 쉬 렌크 튜브에, DH 2 O의 0.4 ㎖에 녹이고 monom을 가진3 : 77 (20)의 어 몰비.
  3. 병렬 반응에서, 단계 3.2 LAEMA를 사용하는 대신 어느 펜던트 설탕을 소유하지 않는 제어 중합체를 생성 반응에서 개마 21.4 mg의 (70.0 μmol)를 대체하기 위해.
  4. 각각의 슈 렝크 튜브 (즉, 3.2 또는 3.3)에 순차적으로 DMF 중 250 μg의 함유 (4- 시아 노펜 산 벤질) 디티 오 벤조 에이트 (1.9 μmol, RAFT 제) 0.53 ㎎, 및 DMF의 50 μl를 함유 한 50 μL를 추가 4,4'- 아조 비스 (4- 시아 노 발레르 산) (0.9 μmol, 개시제). 부드럽게 손가락을 눌러 섞는다.
  5. 쉬 렌크 관에 함유 내용 드라이 아이스를 이용한 동결 : 에탄올 욕 (100 ㎖ 에탄올 75g 드라이 아이스), 10 ~ 50 mTorr의 내부에 진공을 적용하고 슈렌 밸브를 닫고 실온까지 서서히 해동 용액을 허용 . 두 번 더이 동결 피난 - 해동 사이클을 반복합니다. 모든 시약은 지난 해동 후 용해되어 있는지 확인합니다.
  6. 밀봉 플라스틱 바로 쉬 렌크 튜브를 배치g는 백 탈기 한 다음 밀봉. 70 ° C로 예열 수욕으로 슐 렌크 튜브를 함유하는 백을 전송하고 24 시간 동안 배양한다.
  7. 조심스럽게 준비된 투석 백 (= 3,500 MWCO)에 쉬 렌크 관에서 솔루션을 전송하고, 처음 8 시간 동안 DH 2 O 매 시간마다 변경, 24 시간 동안 DH 2 O (10 × 2 L)에 대해 투석. 투석 후, 시험관 투석 튜브에서 샘플을 전송 -80 ° C에서 샘플을 동결 한 다음 동결 건조.

주 : 얻어진 통계 폴리 메타 크릴 아미드 / 아크릴 아미드 (PMA) 펜던트를하거나 (단계 3.3) D-글루 콘 (단계 3.2) -4- O의 -β-D-갈 락토-D-글루 콘 (lactobionamide)를 함유하는 공중 합체는 각각 아르 획득. 논의의 편의를 위해,이 두 glycopolymers 각각 PMA-LAEMA 및 PMA-개마로 축약된다.

형광 발색단과 Glycopolymers 4. 수정 후

  • 각각 인산 완충 식염수 (PBS, 0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M 염화나트륨, pH를 7.5) 0.9 ㎖에 차 아민 관능기 ~ 0.9 μmole 함유 glycopolymer PMA-LAEMA 또는 PMA-개마 5.0 ㎎을 녹인다.
  • 천천히 빠른 교반 솔루션 DMF 100 ㎕에 카르복시 숙신 이미 딜 에스테르의 0.6 mg을 추가합니다. 부드럽게 실온에서 어둠 속에서 16 시간 동안 반응을 저어.
  • 빛으로부터 보호하면서, 제조 투석 튜빙 (MWCO = 3,500)에 샘플을 로딩하고 상기 제 8 시간 동안 투석액 매시간 변화 16 시간 동안 DH 2 O (2 L)에 대해 투석. 투석 후, 시험관 투석 튜브에서 샘플을 전송 -80 ° C에서 샘플을 동결 한 다음 동결 건조.
  • 참고 : 동결 건조 후, 형광 glycopolymers PMA-LAEMA - 플루 오레와 PMA-개마 - 플루 오레는 각각 얻을 수있다.

    의 Gly 5. 특성공중 합체

    1. 수 평균 분자량 (Mn), 중량 평균 분자량 (M w) 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC) 소프트웨어, GPC 구비 상업적 HPLC 시스템 glycopolymers의 분산도 (M w / M n을)를 결정 0.6 ㎖ / 분 (14)의 유속으로 용 리제로서 0.1 M 트리스 / 0.1 M 염화나트륨 완충액 (pH 7)를 사용하여 관심의 분자량 및 굴절률 검출기, 적합한 열. (: 200-1,200,000 g / 몰 MW) 기준 분자량 폴리에틸렌 글리콜 표준을 사용한다.
    2. glycopolymers (16) 내에서 주 아민 작용기의 실제 농도를 정량화. 게시 된 방법 (17)에 따라 합성 glycopolymers의 총 탄수화물 함량을 분석 할 수 있습니다.
    3. , 개마 및 glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-개마는 NMR 분광법 (14)에 의해 D 2 O에 구조 조성 및 glycomonomers의 LAEMA의 순도 시험을 수행.

    와 합성 Glycopolymers 6. 바인딩 테스트 아가로 오스 비즈 렉틴은 코팅

    1. 1 분 300 XG에하는 Erythrina crista - 갈리 렉틴 (ECL) 코팅 된 아가로 오스 비즈 정지, 원심 분리기의 50 μL에 PBS 1.5 mL를 넣고 조심스럽게 제거하고 뜨는 폐기하십시오. 두 번이 단계를 반복 한 다음 PBS 0.5 ㎖에 구슬을 재현 탁.
    2. 1 시간 동안 실온에서, 어둠 속에서, 추가 3 PMA-LAEMA - 형광 또는 구슬 서스펜션에 PBS의 6 μL에서 PMA-개마 - 형광 (대조군)의 μg의, 및 이들의 혼합물을 품어.
    3. PBS 0.2 ml의 PBS로 세 번에 resuspend 구슬의 1.5 ml의 혼합물을 씻으십시오. (여기 파장을, (테프론 코팅 된) 면역 형광 현미경 슬라이드에 잘로 분취 량 (4 μL)을로드 커버 슬립으로 덮고, 및 FITC 필터를 사용하여 형광 현미경으로 관찰 : 467-498 nm의 발광 파장을 : 513-을 566 ㎚) 및 10X 대물 렌즈는 t의 결합을 검사그는 구슬 (14) glycopolymers 형광등.

    Representative Results

    glycomonomer의 합성

    락토 산 glycomonomers의 제조 예로서 본원에 사용 하였다. LAEMA (11)의 합성에 초기 보고서의 방법을 사용하여, 만족스럽지 못한 순도와 제조에 다양한 금리가 관찰되었다. 양이온 및 음이온 교환 수지를 사용하여 변형 된 정제 방법은 1 H, 13 C NMR 스펙트럼 (도 1)에 의해 확인되어 안정적인 생산 수율 및 고순도로 제공되는 미 반응 출발 물질을 제거한다.

    뗏목 glycopolymer 합성과 형광과 glycopolymers의 수정 후

    단차 RAFT 중합을 통해 제조 된 블록 glycopolymers 대조적으로,이 단계의 공중합 프로토콜은 중합체 골격에 걸쳐 균일 glycomonomer 분포를 제공한다. 여기에 도시 glycopolymers GL은 20 몰 %를 포함ycomonomer, 스페이서로서 HEAA 77 몰 %, 및 후 변형 (도 2 참조). 하나 H-, 13 C-NMR 스펙트럼의 대상으로 AEMA 3 몰 % PMA-LAEMA 및 PMA-개마의 구조를 확인 (도 3 및도 4). 도 5에 도시 된 바와 같이, RAFT없이 합성 glycopolymer의 GPC 용출 프로파일에 대해 도시 할 때, PMA-LAEMA 및 PMA-개마 모두 RAFT 접근법의 효능을 증명하는, 낮은 dispersities있다. 예상대로, PMA-개마 인해 펜던트 설탕의 PMA-개마의 부족으로 PMA-LAEMA의 n보다 작은 M이 있습니다. 탄수화물과 RAFT의 glycopolymers 함량 차 아민 작용기의 분석은 제품 glycopolymers의 단량체의 비율은 RAFT 매개 중합 반응 (표 1)에 사용되는 단량체를 개시 화학 양론 비와 일치하는 것으로 나타났다. 이것은 모노머 compositio의 엄격한 제어를 의미NS 합성 glycopolymers에, 설계된대로.

    활성화 된 형광체와 차 아민 작용기의 반응은 단백질 표지에 널리 사용되는 기술이다. 이 기술은 카복시와 정제 glycopolymers 레이블을 여기에 사용 하였다. 수정 후 따라, 형광 고분자 (그림 6)를 얻었다. 반응에서 형광 표지 된 중합체의 어떠한 분해는 GPC 분석에 의해 검출되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).

    렉틴 코팅 아가로 오스 비즈 합성 glycopolymers의 테스트를 바인딩

    실험에 사용 된 합성 glycopolymers의 렉틴 결합 특이성을 평가하기 위해, 알려진 탄수화물 결합 특이성을 가진 렉틴 코팅 된 아가 로스 비드를 사용 하였다.하는 Erythrina crista - 갈리 렉틴 (ECL)는, β-D-갈 락토 대한 결합 특이성을 가지고있다. 그림 7a는 명확하게 PMA-LAEMA - 플로리다를 보여줍니다펜던트 탄수화물 등의 β-D-갈 락토을 포함 uorescein은 ECL 렉틴 바인딩 강한 나타냈다. 대조적으로, 펜던트 설탕을 가지지 않는다 glycopolymer PMA-개마 - 플루 오레의 ECL 결합 음극은,도 7b에 도시되어있다. 이 결과는 합성 형광 glycopolymer의 결합 친화도 및 효율성을 예시한다.

    그림 1
    할당 그림 1. 1 H-(a)와 LAEMA 13 C-NMR (B) 스펙트럼 (D 2 O). (이 수치는 왕에서 수정되었습니다 등. 14) 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.

    <유지-together.within 페이지를 = "항상"> : FO P 클래스 = "jove_content" 그림 2
    그림 2. 펜던트 설탕 β - 갈 락토를 포함하는 형광 glycopolymer PMA-LAEMA의 합성의 도식 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    1 H-(A)와 (13) C-NMR PMA-LAEMA의 glycopolymer (나) 스펙트럼 (D 2 O)이. (이 그림은 왕에서 수정되었습니다 등. 14) 할당 된 그림 3. 항변SE는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    할당 된 그림 4. 1 H-(A)와 (13) C-NMR PMA-개마 (나) 스펙트럼 (D 2 O). (이 수치는 왕에서 수정되었습니다 등. 14) 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.

    그림 5
    RAFT 기반 PMA-개마 및 PMA-LAEMA도 5의 겔 투과 크로마토 그래피 트레이스와 RAFT 제를 사용하지 않고 제조. RAFT 에이전트 (청색)없이 제조 PMA-LAEMA, RAFT- 달리 기반 PMA-LAEMA (녹색) (M, M의 N / W) 훨씬 낮은 분산을 갖는다. RAFT 기반 PMA-개마 (적색) 및 PMA-LAEMA 비슷한 GPC 프로필을 가지고 있지만, 전자는 인한 펜던트 설탕의 부재에 작은 M의 N이있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 6
    이전과 형광으로 수정 후 후 그림 6. PMA-LAEMA. (A) 화이트 비 표지 glycopolymer (왼쪽 튜브)와 비교는, 형광 표지 PMA-LAEMA 강한 노란색 (오른쪽 튜브)를 보여줍니다. UV, 비 표지 된 PMA-LAEMA (PBS에서 왼쪽 튜브, 1 ㎎ / ㎖)에서 (B)의 형광 표지 된 PMA-LAEMA 반면 (PBS에서 오른쪽 튜브, 1 ㎎ / ㎖), 쇼 어둡고 형광으로 제시 강한 녹색 형광.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 7
    그림 7.하는 Erythrina crista - 갈리 렉틴 (ECL) 코팅 된 아가로 오스 비즈 glycopolymers를 포함하는 β-D-갈 락토를 결합, 그리고 펜던트 설탕을 소유되지 않은. (A) PMA-LAEMA - 형광 (3 μg의가) ECL과 결합 강한 입증 더 펜던트 β-D-갈 락토 잔류 물을 보유하지 (B) PMA-개마 - 플루 오레 신, 반면에, 더 렉틴 코팅 구슬 결합 없었다. 스케일 바 = 100 μm의.

    표 1. 타겟팅 합성 매개 변수와 glycopolymers의 실제 작곡 값.) 값을 대상으로, 값이제품의 요구되는; b) DP, 중합도는; C) NA는 사용할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    민주당 B 분산 glycomonomers의 실제 내용
    몰 %
    일차 아민의 실제 콘텐츠
    몰 %
    값을 타겟팅 (100) <1.3 (20) 3
    PMA-LAEMA (99) 1.26 (19) 3.2
    PMA-GAEMA 89 1.32 NA C 2.7

    Discussion

    손쉬운하고 효율적인와 펜던트 탄수화물없이 RAFT 기반 트라이 구성 요소 형광 glycopolymers을위한 프로토콜 및 렉틴 결합 테스트에서의 사용은이 보고서에서 설명된다. 이 프로토콜은 glycomonomers의 LAEMA과 개마의 준비를 시작한다. 한 단계 뗏목 제어 공중합을 통해 재현 수율 예측 성 단량체 조성물과 낮은 분산과 glycopolymers는 얻을 수있다. 카르복시 숙신 이미 딜 에스테르와 glycopolymers의 수정 후 다음, 그 결과 각각의 형광 표지 glycopolymer의 결합은 렉틴 결합 특이성을 위해 쉽게 테스트 할 수 있습니다.

    후속 glycopolymer의 합성에 이용하여야한다 glycomonomers의 초기 예비 단계에서 쉽게 구할 락토 산 및 글루 코노 락톤이 사용되었다. 이론적으로, 복잡한 올리고당 단당류 관심있는 탄수화물, 하에서 변환 할 수있다글루코스 C6에 차 하이드 록 실기에 상기 타겟 당 공역에 의한 glycomonomers D. 환원 글루코스 잔기의 산화, 및 락톤과의 후속 탈수 후, 생성물을 용이하게 할 수있다 대응 glycomonomer을 형성 AEMA에 일차 아민과 반응시켰다. 이 경로의 추가의 예는 최근 보고서 (14)에서 볼 수있다. 그것은 모든 중합 공정을 개시하기 전에, MEHQ, 강력한 중합 억제제가 사용하기 직전에 모든 단량체 및 glycomonomer 제제로부터 제거되어야한다는 점에 유의해야한다. 이것은 용이 MEHQ 후 즉시 고 수율 억제제없는 생성물을 침전 -20 ℃에서 아세톤으로 취급 보유 glycomonomer을 용해 메탄올의 최소량을 사용하여 달성된다.

    어떤 라디칼 중합 방식에 필수, 세부 사항 및 모노머 순도에주의를 강조하고 있습니다. RAFT 중합 시스템의 전형적인 바와 같이, 그것은 이루어져래디컬 소스, 뗏목 시약, 단량체 및 용매. 이 시각 프레젠테이션에서 단일 단계 RAFT 중합 시스템은 수용액에 세 가지 상이한 단량체를 갖는 반응 혼합물로부터 생성 된 통계적인 공중 합체의 생산에 초점을 맞춘 것으로 설명된다. 두 개의 별도 RAFT 매개 반응이 하나의 펜던트 보유 glycomonomer를 이용한다되는 제시없이 결합 탄수화물 잔기와 폴리올을 가진 탄수화물 말단 (즉, β-D-갈락토스), 및 다른 비 환원성. 두 RAFT 매개 반응 공통 스페이서 분자로서 기능 단수 수산기를 갖는 단량체는이었으며, 또 다른 아미노 - 반응성 형광체와 수정 후 용 유리 아민을 갖는.

    반응 혼합물과 환경에서 산소의 존재 때문에 매개 RAFT 중합에 해로운, 레벨을 추적의 제거를 용이하게 여러 동결 EVA를 통해 달성된다cuate - 해동 사이클은 고 진공하에 쉬 렌크 관 반응기를 유지하면서.

    이는 필요에 따라 반응이 다른 단량체의 몰비가 조절 될 수 있음에 유의해야한다. 또한, 사용 RAFT 화제의 양을 변화시킴으로써, 생성 된 중합체의 길이가 18를 제어 할 수있다. 그러나, 개시제 RAFT 제의 몰비는 항상 제품의 낮은 분산을 보장하기 위해 두보다 커야한다. 이러한 조건 하에서, 공중합의 진화는 정상이고, 반응의 재현성이 매우 높다. 즉, 하나는 그들의 다른 중합 속도로, 통계적 공중 합체 내의 모든 참가 단량체 완전히 균일 한 분포를 얻는 것이 어렵다, 상기된다. 중합체 내의 상이한 단량체의 분포를 특성화하는 것은 여전히​​ 매우 도전적이다.

    수정 후 방법은 여기에 제시된 양보다 간단하고있다 amenabl라벨 glycopolymers 2,11인가 다른 프로토콜에 비해 형광 라벨의 넓은 선택의 특정 사용 예. 이들은, 수용성 아민 반응성 형광 많은 양자점 biotins 등을 포함한다. 합성, 표시 glycopolymers의 결합 특이성은 쉽게 검증 알려진 결합 친 화성을 가진 렉틴을 사용하고 있습니다. 더 펜던트 설탕을 소유하지 PMA-개마 적절한 음성 대조군이다. 이 경로를 통해 제조 된 다른 형광 라벨 Glycopolymers 성공적 렉틴 매개 세균 14 바인딩의 조사에 사용되어왔다. 제시된 통계 형광 glycopolymers이 손쉬운하고 효율적인 준비 glycobiological 연구의 다양한에 큰 잠재력을 제공해야한다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

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    References

    1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9, (8), 757-764 (1999).
    2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33, (28), 6889-6897 (2012).
    3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
    4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49, (5), 1079-1131 (2007).
    5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45, (11), 2059-2072 (2007).
    6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7, (1), 232-238 (2006).
    7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
    8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
    9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
    10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20, (5), 994-1001 (2009).
    11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42, (17), 6393-6405 (2009).
    12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1503-1512 (2011).
    13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213, (17), 1768-1782 (2012).
    14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31, (2), 133-143 (2014).
    15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47, (2), 614-627 (2009).
    16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1690-1699 (2011).
    17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. CRC Press. 87-170 (1989).
    18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37, (24), 8941-8950 (2004).

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