表面拡散と酵母染色体の免疫染色

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Biology

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Grubb, J., Brown, M. S., Bishop, D. K. Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes. J. Vis. Exp. (102), e53081, doi:10.3791/53081 (2015).

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Abstract

Introduction

出芽酵母サッカロマイセス·セレビシエは、染色体の機能を制御するタンパク質の研究を含む、生物学的過程の分子機構の研究のために多くの利点を提供しています。 、遺伝的分子、および生化学的研究のために、出芽酵母のよく知られている利点があるが、細胞の核内のタンパク質の分布の細胞学的研究は、その小さなサイズによって複雑になります。典型的な酵母核は、可視光の約5倍の解像度の限界である1ミクロン未満の直径を有します。したがって、従来の免疫染色から、または緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質タグを使用することによって得ることができる核タンパク質の分布に関する情報の量が限られています。タンパク質の核内分布を特徴付けるに有用なアプローチは、拡散染色体面です。このアプローチは、細胞壁を除去し、細胞膜および核膜を破壊し、Aを含みますllowing核の不溶性内容は顕微鏡スライドの表面に安定します。これらの不溶性成分は、核マトリックスと染色体が含まれます。クロマチン結合タンパク質を検出する能力を高め、可溶性核内容物の除去を可能にすることに加えて、そのような拡散核が約3〜5μmの直径を有すること(二倍体減数分裂核のための)染色体の実質的な減圧でメソッド結果を拡散染色体と二倍体分裂核のために2〜3ミクロン。この減圧は無傷の核に解決することが比較的困難または不可能である核部分構造の検出を可能にします。

染色体拡散に明らかな欠点は、拡散手順が部分的にまたは完全に目的の構造を破壊する可能性です。特に懸念されるのは、特定の染色体に結合したタンパク質は、拡散処理の結果として失われる可能性があるということです。この潜在的な合併症の寿データを解釈する際にLDが念頭に置いておきます。拡散手順に敏感なタンパク質の一例は、β-チューブリンです。いくつかの条件の下では、主にチューブリンから構成されているスピンドルは、3を広げる時に保存されています。スピンドルの可視化は、多くの場合、目的の核をステージに便利です。しかし、チューブリンを可視化することは、高濃度の固定剤を用いた治療を必要とします。スピンドルは、以下に記載される標準的な条件の下で失われます。この例では、以前に特徴付けられていないタンパク質の分布を分析する場合、それは、タンパク質は、そのような変化に敏感であるかを決定するために、固定剤の濃度を変化させることが重要であることを示しています。染色体構造上の拡散条件の影響に関する懸念にもかかわらず、拡散方式の有用性とパワーは、多くの状況で実証されており、有糸分裂と、特に減数分裂のセル4-7の特性に広い有用性を有します。

TWO拡散方法が広く使用されてきました。ドレッサーとジルー8によって開発されたこれらの方法の第一は、洗剤の使用を回避し、DNA特異的色素DAPIについて染色したときに、比較的よく保存された染色体の形態を有するように見えるスプレッドの準備を得ることができます。しかし、この方法は、完全に比較的困難であり、スライドの一方の領域を他の領域と比較されたときにスプレッド核の品質が、劇的に変化します。この問題は、データ収集の偏りを回避するために、1つのスライドから多くの選択されていない核画像化伴う定量的アプローチを複雑にすることができます。 Loidlとクライン1によって開発された方法を、2次拡散染色体は、洗剤溶液によって促進溶解およびクロマチン解凍して、パラホルムアルデヒドによる固定をバランスすることを含みます。適切に実行すると、この方法は、ドレッサーとジルーの方法に比べて少ない地域への領域の変動と非常に再現性のある結果が得られます。このプレゼンテーションでは、modifieに焦点を当てて理由は、その信頼性とシンプルさのLoidlとクラインの方法、のDバージョン。

拡散染色体は複雑で時間のかかるではありません。最大100のスライドを一日で免疫染色のために調製することができます。また、スプレッド製剤は、免疫染色の前に年間の冷凍庫に保存することができ、したがって、ラボでは新たな生物学的疑問が生じたり、新しい染色試薬が利用可能になったときに使用することができる冷凍染色体スプレッドのリポジトリを開発することができます。

染色体拡散方法は、最も一般的に免疫染色し、広視野蛍光顕微鏡法と組み合わせて使用​​されるが、それは、誘導放出の枯渇(STED)顕微鏡法などの超解像光学顕微鏡法のためにスライドを調製することも可能です。

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Protocol

注:以下のプロトコルのいくつかのステップは、クリーンドラフト内での作業が必要です。さらに、この方法は、スフェロプラストを監視するために10X長作動距離対物レンズを装備した酵母四分子解剖顕微鏡を必要とします。顕微鏡は、事前にフード内に設定する必要があります。範囲からマイクロマニピュレータアームとプレートホルダーを外し、作業エリアから離れ、安全な場所にこれらの項目を配置します。

スフェロプラストの調製

  1. 所望の条件下で酵母を成長させます。 OD600 1.4 = 5×10 7細胞/ mlで各試料について、約2×10 8細胞、例えば培養の4ミリリットルを使用してください。試料の即時の処理がある場合には好ましいかもしれないが、ほとんどの用途のために、細胞のアリコートを、処理される前に、8時間まで氷上で保存することができます。
  2. 細胞をペレットに3分間5(2345 RPM / 857.5 XG)の設定で臨床遠心分離機中で15mlの遠心管とスピンに細胞懸濁液を転送します。 ペレットから細胞を失わないように注意しながら培地をデカント。静かに1ミリリットルのZKバッファーで細胞を再懸濁した後、40μlの1 Mジチオスレイトール(DTT)を追加します。穏やかに混合しながら2分間インキュベートします。以前のように細胞をペレット化する(ステップ1.2を参照してください)​​。
  3. 1ミリリットルのZKバッファで再懸濁ペレット。完全に混合されたザイモリアーゼ100Tの新たに調製した溶液5μLを加えます。細胞壁を除去し、スフェロプラストを製造するために、30℃で20〜30分間インキュベートします。
  4. スフェロプラストは、完全であるかどうかを決定するために顕微鏡スライド上の細胞懸濁液の10μlの液滴をアッセイ。カバーガラスなしで解剖顕微鏡下で観察した細胞。細胞が肥大化し、ラウンドではなく、わずかに楕円形に表示されますと、水20μlを添加した後溶解する必要があります。細胞が溶解するために失敗した場合、水誘導される溶解が容易に観察されるまで10分毎に、30℃にサンプルを返し、再分析。以前のように細胞をペレット化する(ステップ1.2を参照してください)​​。
  5. 静かに再懸濁し、細胞ペレットを洗浄Inは2.5ミリリットルの冷MES /ソルビトールバッファ。以前のように細胞をペレット化する(ステップ1.2を参照してください)​​。ゆっくり300-400μlの冷MES /ソルビトール緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。細胞を、数時間、この段階で氷の上に保持することができます。

拡散2.染色体

注:染色体が拡散さのいずれかのスライドやされる際にガラス表面カバースリップは、必要があります事前に用意すること。各スライドまたはカバースリップを水に沈めなければならず、その後エタノールは、その後、乾燥させ、レンズペーパーで研磨。染色体がカバーガラスに分散されます場合は、カバースリップは、スコッチテープやゴムセメントでスライドに貼付する必要があります。特に言及しない限り、プロトコルの残りはスライドまたはカバースリップ上に広げる説明します

  1. きれいなスライドの表面上にP20ピペッター、ピペット細胞懸濁液の20μlのを使用。
  2. P200ピペッターを使用して、3%PFA /スクロース溶液40μlを添加し、穏やかにsolutioを混ぜますシュリーレン線が消えるまで手でスライドを「旋回」されることによりn。顕微鏡下でスライドを置き、細胞が焦点になっていることを確認します。 PFA溶液は、使用日のドラフト内で新たに準備する必要があります。
    注:目的のタンパク質は、以前の方法により検査されていない場合、それは、タンパク質の保持は、固定条件に敏感であるかどうかを決定するために2及び4%PFAを含む溶液を用いて、追加のスライドを用意することが望ましいです。 4%PFA /スクロース溶液は、それが関連付けられたチューブリンの微小管を可視化することが望ましい場合に使用されます。高い固定剤濃度の欠点は、染色体が「underspread、「2%PFAであろうこともまた「underspread」染色体を生じる傾向があります。
  3. P200ピペッターを使用して、できるだけ完全に溶液を混合する前のように旋回、タイマーを開始、1%Lipsolの80μlを添加します。 Lipsolが使用できない場合は、80μlの1%NP40または80μlののdH 2 Oであってもよいです置換された(代表的な結果、図2を参照)。
  4. 慎重に細胞を見て、ゆっくりと15秒毎のスライドを旋回。細胞の約80%が溶解したら、すぐに顕微鏡からスライドを削除し、タイマーを停止PFA /スクロース溶液80μlを添加し、渦が混合する(消えました)。溶解は、タイマーを起動した後30〜90秒から発生する必要があります。
    注:いくつかのスライドがほぼ同時に溶解を示した場合は、1は、最終的には、スライドの残りの微細なモニタリングを省略し、単に慎重lipsolと固定剤の最終アリコートの添加の添加の間の期間を時間を計ることができます。同じサンプルから複数のスライドを調製する場合しかし、この短いカットが唯一の信頼性があります。それは別のスライドを異なる時間に、または異なる培養物から採取した試料から調製されたときに、顕微鏡で各サンプルの溶解を監視するのが最善です。
  5. きれいな平らな面にスライドを置き、全体unfrosted surfac全体に液体を広げます「水たまり」のメニスカスの下にはなく、スライド自体の表面上に保持清潔、使い捨て牧草ピペットの側面を使用して、スライドの電子、 すなわち 。ピペットでスライドの表面を「熊手」はありません。サンプルの汚染を避けるために別のスライドにピペットを再使用しないでください。
  6. ドラフト内で一晩乾燥さスライドにしておきます。不溶性の核成分は、スライド表面上に定着し、それに結合します。大規模な実験のために、乾燥工程のためのスペースの使用を計画することが重要です。
  7. 乾燥した後、最適な結果は、同じ日に免疫染色段階に進行することによって得られます。しかし、乾燥したスクロース溶液は、サンプルの凍結を可能にする「蜂蜜」のスプレッド染色体を埋め込む:スライド、プラスチックスライドボックスに移し、年間-20℃で保存することができます。

3.免疫染色

  1. ディップは、30秒間0.2%のフォトフローにスライドします。蜂蜜を除去しました。上リーンスライドエッジは、エッジはペーパータオルで休んで、残留フォトフローを除去しました。
  2. 5分間の1×TBSでディップスライドを洗浄します。エッジでスライドを傾斜さ、過剰な液体を除去するが、それらが乾燥させてください。
  3. スライドのunfrosted部分全体のスライド上にスライドつや消し面を上にし、ピペット300μlのTBS / BSAを置きます。
  4. 15分間、室温で湿ったチャンバー内でインキュベートします。 (飽和ペーパータオルで有孔金属板やプラスチックスライドボックスの下に水飽和ペーパータオルを敷いた大きなプラスチック容器)。
  5. ペーパータオル上でスライドの短辺休止して(例えば、試験管ラックなど)適切なサポートに対するスライドを傾斜さスライドを排出します。表面が乾燥しないようにしてください。
  6. すぐに一次抗体の適切な希釈を含むTBS / BSA緩衝液80μlのを適用します。抗体が制限されている場合は、40μlの22×22ミリメートルのカバーガラスを使用しています。粗製ウサギ血清の場合、これは、典型的には1/50および1/500希釈の間です。
    注意:新しい抗体調製のための滴定を行います。バックグラウンド以上の高い信号を生成する最も希薄準備が選択されています。前免疫血清で染色されるべきバックグラウンド染色のレベルを制御するために、核は適切な欠失変異株および/または重複したスライドから準備する必要があります。
  7. バブルを回避スライド上の洗練された22×50mmのカバースリップを置きます。一方の短辺に近い位置での長い縁に沿って親指と人差し指の間にカバーガラスを保持することによってこれを行います。それだけで「水たまり」スライドのつや消しの領域に最も近いのエッジの内側にスライド上に載るまでスライドする30度の角度でカバーガラスを保持し、指の短辺最も遠いが低下します。そして、ゆっくりとスライドタッチベンチを保持する指まで滑らかな動きでカバースリップを下げ、その後、離します。それは着地後にカバーガラスの位置を調整しようとしないでください。
    注:染色体スプレッドは上に調製した場合(スライドの表面上に直接ではなく)固定されたカバーガラス、このサンプルカバースリップを染色し、洗浄工程全体にスライドに固定されたままになります。追加のカバーガラスを均一に染色した後、廃棄の際に抗体溶液を分配するために、サンプルカバースリップの上に配置されます。
  8. 密封された湿ったチャンバー内の場所スライド、4℃で一晩インキュベートします。
  9. つや消しのエッジを保持することは、スライドガラスの染色ラックにスライドを転送し、TBSを含む染色ジャーに水没します。
  10. 静かにカバースリップを削除するには、上下にスライドを浸します。これを行うにはあまりにも多くの力を使用しないようにしてください。 TBSに浸漬することによって、スライド2×10分間洗浄します。ラックからスライドを取り外し、ペーパータオルに端をタッチすることで、過剰な液体を排出します。表面を乾燥させないでください。
  11. 直ちに蛍光色素結合二次抗体(または22×22ミリメートルのカバーガラス40μL)の1 /千倍希釈を含む80μlのTBS / BSAを追加し、落ち着いた光の下での作業。広告以前とDのカバースリップと暗闇の中で湿ったチャンバー内で2時間4℃でインキュベートします。
  12. 、以前のようにカバースリップを削除するスライドを排出し、暗所で1〜2時間空気乾燥さ表面を可能にします。以前のようにペーパータオル上リーンスライドします。
    注:拡散がマウントカバースリップ上で実行された場合は、乾燥前のスライドからカバースリップを切り離します。前のステップでのスライドで説明したようにカバーガラスを乾燥されます。
  13. 抑えた光の下での作業、DAPI(310μlの滴)を含む培地を搭載する約30μlを添加した後、慎重にカバースリップを下げます。スプレッドがカバーガラス上にある場合、スライド上に、下に清潔なスライド上に封入剤の液滴を配置し、カバーガラスを下げ、染色体側。
  14. まだ落ち着いた光の下では、明確なマニキュアでカバースリップの端を解決し、密封するためにカバースリップのために2分を待ちます。フラットスライドボックス内にスライドを配置します。
    注:STED顕微鏡の場合は、延長ゴールドでマウントします。延長金の30μLを使用DAPIのない、一晩硬化させます。マニキュアで封止することは不要です。
  15. DAPIが集中するために、適切なフィルターセットを用いて、40または100倍を目的とした広視野落射蛍光顕微鏡による表示スライド。必要に応じて数週間、4℃で暗所でスライドを保存します。凍結しないでください。

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Representative Results

スプレッド核の出現は、批判的に染色体固定およびデコンパクションとの間のバランスに依存します。試薬が適切にバランスしている場合であっても、染色体の脱圧縮の程度の変化および/または別のスライド間の同じスライドの異なる領域で起こり得ます。画像が解釈される前にこのように、スライドの所定の領域に広がるの品質が評価されるべきです。

「overspreading "と" underspreading」の効果は、減数分裂期組換えタンパク質に対する抗体を用いて説明することができます。 図1では、減数分裂核はDAPIを用いたDNAについて染色2真核生物の鎖交換タンパク質のRad51とDMC1とカウンタについて免疫染色の二重です。最適に広がる核の2つの例は、 図1Aに示されている。 図1Bは、underspread核二包む核の図1Cの実施例の一例を示しています。注意Rad51のとDMC1の少ない病巣が正しく核を拡散するために比較を超えるとunderspread核の両方で観察されていること。サンプルが十分に平坦ではないためunderspread核の場合、いくつかの焦点は、焦点から外れています。また、エピトープの接近性は、すべての病巣を検出する故障に寄与することができます。また、スプレッドの小さい直径は密集した構造の解像度を排除することができます。包む核の場合には、タンパク質が不十分なため、固定および/または過剰な界面活性剤処理を失われることがあります。

標準的な方法のバリエーションはLipsolの使用を回避することができます。 Loidlらによって記載された拡散方法のオリジナルバージョン。 Lipsol、可否の実験用ガラス器具の洗浄剤1を使用しています。この界面活性剤は、現在、多くの研究室に広がる染色体のために使用されていますが、オリジナルの処方はもはや市販されておらず、現在その名称で販売されている製品は、再定式化されています。 Furthermore、Lipsolの元の式は、(フランツ·クライン、私信)は使用できません。この問題を克服するために、我々は、商業的に入手可能であり、化学的に定義された界面活性剤NP40をLipsolの代わりに使用した実験を行いました。標準プロトコルのこの修正は、減数分裂核のRad51とZIP1、対合複合体( 図2A)の中央領域の成分のために染色した広がった実験のために満足のいく結果が得られることがわかりました。興味深いことに、のdH 2 Oを同じ体積でLipsol液を交換しても満足のいく結果( 図2B)を得ました。これらの知見は、上述の拡散方法はLipsolなしで首尾よく使用されてもよいことを示しているが、いくつかの前述の結果はLipsolの使用に依存し、NP40またはH 2 Oは、その代わりに使用された場合に再現可能でない可能性があります。拡散方法マイルを学び、個々GHT合理Lipsolの代わりに、NP40および/ ​​またはH 2 Oを使用して開始することを選択しました。困難に遭遇した場合には、研究者は、それが廃止される前に試薬の備蓄を得た研究室からLipsolの一部を請求することができます。 Lipsolは安価であり、一つは注文できた最小量は、スライドの数百万を生成するのに十分でした。

拡散方法は、超解像光学顕微鏡法での使用に適しています。対合複合体は、要素に結合した各ループのベースに、ループ配列のセットに姉妹染色分体の組を組織それぞれが2つの直線軸/横の要素で構成されています。太糸期染色体対合複合体の中央領域を形成するタンパク質によって100nmの間隔で平行に保持された横方向の要素のペアをsynapsedいます。これらの一対の横方向の要素は、従来の広視野落射蛍光顕微鏡によって解決することはできませんが、超resoluすることで解決できますション方法。 図3では、太糸期核はそれは図2の実験に用いZIP1タンパク質について同じ抗体で染色されて示されている。試料はまた、RED1タンパク質、軸方向/横方向の要素の構成要素のために染色しました。結果はZIP1抗体はむしろ結合領域の横方向の要素の間にある細長いαヘリックスコイルドコイルドメインよりZIP1の横要素結合領域を、認識することが明らかになりました。したがって、このZIP1抗体で観察された染色パターンは、対になった横方向の要素の並列経路を明らかにする。横要素に沿っRED1病巣の分布はZIP1病巣に比べて比較的希薄であるが、二重染色法はRED1病巣が一般ZIP1病巣によって定義される線形パスの近くにあることを示しています。これらの知見は、同じ拡散法は、電子顕微鏡による分析のためのサンプルを調製するために使用された以前の研究と一致しています。対合COMPの三者構造lexが広がり手順の間に保持されます。 図3に示す画像は、STED顕微鏡9によって生成されました。

図1
図1:スプレッド核の例 DMC1(緑)、Rad51の(赤)、およびDNAについて染色減数分裂核(DAPI、青)。バー=1μmです。 (A)最適に広がる核の2例。 (B)underspread核の例。 (C)包む核の2つの例。左の例では、上部のみが包むされた核です。

図2
図2:Lipsolを使用せずに調製減数分裂核の段階から減数分裂核を拡散のRad51(赤)について染色した示したように、ZIP1(緑)、DNA(DAPI、青)。 pachynemaへleptonemaからの細胞の転移として発生染色体コンパクションが大きく保存されていることに注意してください。

図3
図3:STED顕微鏡を介して、対合複合体の可視化 ZIP1(緑)、RED1(赤)について染色した太糸期核データは、測定されたSTEDのPSFとリチャードソン-ルーシー·モデルを使用して、100回の反復を実行するには、DeconvolutionLab ImageJのプラグイン10を用いて処理しました。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymolyase US Biological  Z1004 Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol  L.I.P. Ltd  no longer commercially available Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40 USB 19628 Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20 Sigma P2287
Slides Corning 2948-75x25
Standard coverslip Fisher 12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips Fisher 12-542-B
Photo-Flo 200 solution Kodak P-7417 Prepare 0.2% (v/v) solution in water. 
TBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA Sigma A2153 Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit Invitrogen A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI Vector
Laboratories
H-1200
ProLong Gold Invitrogen P36930
Plastic slide box Fisher 03-448-1 Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box Fisher 12-587-10 Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar Fisher 08-816 Use as a wash basin for slides. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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