Baffo-segnalato Eyeblink condizionamento classico nei topi Head-fisso

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Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice. J. Vis. Exp. (109), e53310, doi:10.3791/53310 (2016).

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Abstract

Introduction

condizionata Eyeblink è una forma di condizionamento pavloviano e un sistema modello per studiare i meccanismi neurali di apprendimento associativo e della memoria. E 'stata studiata in varie specie, compreso l'uomo, conigli, gatti, ratti e topi. Il paradigma prevede la presentazione di due stimoli appaiati: un neutrale stimolo condizionato (CS, ad esempio, un tono, un lampo di luce, o la stimolazione baffo), e uno stimolo incondizionato saliente (USA, ad esempio, un soffio d'aria per l'occhio, o scossa periorbitale). Gli Stati Uniti suscita un incondizionato, riflessiva risposta eyeblink (vale a dire, UR). Alla fine, dopo varie presentazioni del abbinato CS-USA, il soggetto impara ad associare il CS con gli Stati Uniti. Questo apprendimento si manifesta sotto forma di una risposta condizionata (CR), un eyeblink suscitato dalla sola CS che precede la presentazione degli USA.

condizionata Eyeblink sotto forma di traccia include un intervallo libero da stimoli di pochi hmillisecondi undred che separa il CS e gli Stati Uniti (Figura 1). Trace condizionata è una forma di apprendimento dichiarativa in quanto richiede la consapevolezza delle contingenze stimolo 1. Il divario temporale richiede l'animale a mantenere un neurale 'traccia' del CS in regioni del cervello anteriore, come l'ippocampo in modo che gli Stati Uniti ed il CS di diventare associato 1-6. Insieme con le regioni prosencefalo, tracce di condizionamento dipende anche il cervelletto 7.

condizionata Eyeblink è, quindi, un paradigma utile per la ricerca dei molteplici aspetti di memoria, compresi l'acquisizione, il consolidamento e recupero. Durante condizionata eyeblink, un gruppo di controllo di animali è presentato con stimoli spaiati in ordine casuale per verificare pseudoconditioning o sensibilizzati risposte al CS che possono essere causati dalla presentazione Stati Uniti da soli, piuttosto che una associazione CS-US imparato.

Un appara comunemente usatoTus per l'indagine di condizionamento eyeblink nei roditori è una camera in cui i roditori sono autorizzati a muoversi liberamente durante il processo di formazione 8-10. Con questo tipo di apparecchiatura, un tether è normalmente collegato a un casco che è apposto cranio del roditore. Il tether consente l'erogazione degli Stati Uniti (e talvolta CS) e per trasmettere la risposta dell'animale a tali stimoli (cioè, la risposta eyeblink) 10. Il tether stesso può essere modificato in base al tipo di stimoli consegnato e come viene registrata la risposta eyeblink.

La ragione per usare "liberamente in movimento" topi legati per un condizionamento eyeblink è che i topi lotta contro la moderazione. Anche se altre specie possono essere più suscettibili di moderazione, il principale vantaggio di utilizzare topi negli esperimenti di condizionamento eyeblink è che la maggior parte dei disponibili ceppi mutanti geneticamente modificati sono ceppi di topi. Oltre alla lotta, res completiTraint di topi si traduce in difficoltà acuta. Una preparazione topo testa fissa che minimizza lo stress aumenterebbe le informazioni fisiologiche che possono essere ottenute durante il condizionamento eyeblink. Ad esempio, questo sistema permetterebbe di imaging di neuroni corticali con 2-photon microscopia a 11.

Preparati Testa-fisso sono stati utilizzati in precedenti esperimenti di imaging ottico della corteccia attraverso protesi craniche rimovibili, in vivo registrazioni elettrofisiologiche del cervello dei roditori con array tetrodo, Calcio Imaging a due fotoni, e anche come piattaforma per il condizionamento eyeblink nei topi 11 -16.

Nel sistema testa fissa, stimolazione affidabile e registrazioni sono assicurati senza completa ritegno del mouse (Figura 2). Un casco come quello utilizzato nel sistema liberamente mobile viene apposto cranio del mouse. Durante l'allenamento, la testata viene apposto un connettore che è collegato a barre suun tapis roulant cilindrica per stabilizzare la testa del roditore (Figura 2A). Il tapis roulant cilindrica permette il mouse per riposare comodamente, ma se il mouse lo desidera, permette anche l'esecuzione o camminare. Con l'uso di questo sistema, i topi possono essere formati con una vibrazione baffo come CS ed una scossa elettrica periorbitale mite come gli Stati Uniti (Figura 1). Gli Stati Uniti è espresso attraverso i fili chirurgicamente posizionati sotto la pelle laterali per l'occhio. Il CS è espresso tramite un pettine che è collegato a un 2-layer rettangolare flessione attuatore (Figura 2B). Il pettine e attuatore piegatura vengono poi attaccati ad una base magnetica che viene spostato nella posizione corretta durante la formazione ed è regolata per la consegna ottimale per ogni singolo animale. Il pettine è posizionato a cavalcare i baffi selezionati. Durante l'erogazione del CS, un segnale viene inviato all'attuatore flessione che sposta il pettine e porta alla vibrazione delle basette 17.

16,18,19. La stimolazione baffo motivo è stato scelto per il CS in questo paradigma sperimentale è la dipendenza degli animali murini sul loro vibrisse per l'input informazioni somatosensoriali durante l'esplorazione. Stimolazione baffo ha dimostrato di essere un affidabile ed efficace CS 20. Inoltre, dato il substrato ben consolidata e organizzato corticale del sistema vibrisse (vale a dire, la corteccia barile), la stimolazione baffo come il CS fornisce uno strumento elegante per mappare i cambiamenti corticali e la plasticità connessi con l'apprendimento eyeblink condizionata 20,21. Un sistema di testa fissa consente la precisa stimolazione di baffi selezionati per confrontare le risposte tra i neuroni e neuroni ricevono input da baffi non-stimolata stimolati. Infine, molti ceppi di topi mostrano perdita dell'udito legata all'età come relativamente giovani adulti 16). stimolazione baffo non è influenzata da una di queste complicazioni.

Presentato qui sono modifiche uniche e importanti su altri preparati testa-fisso per eyeblink condizionata, compresi i metodi di CS e US consegna, e l'acquisizione della risposta eyeblink. L'affidabilità di questo apparecchio e il paradigma di formazione nel condizionamento eyeblink è dimostrato imparando curve da topi condizionata e una curva di apprendimento relativamente piatta da animali di controllo pseudoconditioned (Figura 7a).

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dalla Institutional Animal Care della Northwestern University e del Comitato Usa sulla base di linee guida emanate dal National Institute of Health.

1. Il cilindro (Figura 2A)

  1. Costruire il cilindro come descritto da Chettih et al. E Heiney et al. Da un cilindro lungo di schiuma 14-15. Tagliare una lunghezza di 10 cm di cilindro e praticare un foro attraverso il centro per adattare l'assale, un metallo asta di 12,7 mm (0,5 in.) Di diametro. Montare il cilindro con il suo asse su una basetta ottico metallo come descritto da Heiney et al., O un altro supporto (ad esempio, plexiglas) 15.
  2. Eretti due aste metalliche verticali di 12,7 mm di diametro su entrambi i lati del cilindro.
  3. Fissare due supporti ad angolo retto sulle aste di metallo.
  4. Fissare altre due aste (lunghi 5 cm, 12,7 mm di diametro) attraverso i supporti ad angolo retto. Bevel °e termina di queste canne e il livello delle loro estremità sopra il centro del cilindro (figura 2G).
  5. Forare e toccare un foro attraverso le estremità rivolte delle aste per adattarsi due 4-40 viti di macchina che conterrà le ali del connettore in posizione (Figura 2G).

2. Assemblaggio del sistema di stimolazione Baffo (Figura 2B)

  1. Tagliare un segmento di 10 denti di pettine da un normale pettine.
  2. Tagliare una fessura circa 2-3 mm di larghezza e circa 5 mm di profondità nella parte superiore del pettine per accettare un attuatore flessione rettangolare 2 strati.
  3. Saldare un filo ad ogni superficie dell'attuatore piegatura. Utilizzare la saldatura e flusso fornito dal produttore. Coprire l'attuatore e saldatura con nastro isolante per proteggere il mouse e utente dalla corrente elettrica.
  4. Infilare la striscia attuatore nella fessura tagliata a pettine in modo che la striscia attuatore piegatura siede perpendicolare al piano del pettine. Angle il pettine in modo che sia inclinato di 45 ° e più naturale segue la curva del viso del mouse.
  5. Fissare l'estremità della striscia attuatore all'inizio del pettine con rapida impostazione epossidica.
    Nota: I fili saldati alla striscia attuatore flessione devono essere collegati a un reostato che fornisce 40 volt a dell'attuatore. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che 40 volt è efficace per il condizionamento, ma non evoca tutte le risposte spavento.
  6. Posizionare l'attuatore piegatura e il pettine su un monte mobile. Un supporto pipetta attaccato ad una base magnetica come normalmente utilizzati per impianti di perforazione in vitro elettrofisiologia funziona bene.

3. Montaggio del connettore che monta a Canne al di sopra del cilindro (Figura 2C, 2E)

Nota: Il connettore è un 3-D stampato striscia 7 buche modellata dalla striscia di nylon serie 221 Amphenol utilizzato per la cavezza da Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.

  1. Toccare il primo foro nella striscia di 0-80 x-1"Vite di macchina. Questo servirà come una vite di bloccaggio per fissare il casco al connettore. Applicare un 0-80 dado alla testa della vite di bloccaggio con colla cianoacrilato per facilitare ruotando la vite a mano.
  2. Lascia un buco vuoto dopo il foro filettato (per lasciare spazio per il dado 0-80 della macchina) e spingere cinque basi relia-tac placcati in oro attraverso i restanti cinque fori.
  3. Striscia il rivestimento off cinque fili lunghi (fili ottenuti da un cavo Ethernet) e saldare le estremità delle prese.
    Nota: le prime due fili saranno utilizzati per registrare i segnali elettromiografici (EMG) che rileverà una risposta eyeblink seguente filtraggio del segnale e l'amplificazione da un amplificatore. La seconda di due consegnerà il segnale scossa da un isolatore stimolo. L'ultimo cavo servirà come collegamento a terra. Questi fili saranno collegati ai sistemi utilizzati per la consegna temporizzato CS-US.
  4. Garantire la connettività elettrica tra i cavi e le prese con una multImeter. Mettere il multimetro l'impostazione continuità e tenere una delle sonde per il perno e l'altra sonda alle estremità spellata del filo. I perni ed i fili sono collegati elettricamente quando la resistenza è bassa e il multimetro emette un tono.
    1. In alternativa, se il multimetro non ha un'impostazione di continuità, misurare la resistenza tra i pin e cavi. C'è continuità elettrica se c'è poca resistenza misurata.
  5. Preparare le ali del connettore dal transistor stile due TO-220. Tagliare i cavi di emettitore, di base e di collettore del transistore e livellare la superficie in modo che possa essere fissata al connettore.
  6. Tagliare il bordo della linguetta di montaggio a violare il foro per la scheda può scivolare sotto la testa della vite.
  7. Epossidico transistori al connettore. Il foro nella linguetta di montaggio verrà utilizzato per fissare il connettore alle aste sopra il cilindro.
  8. Applicare epossidica alla base dei fili protruding dalle prese e consentire la resina epossidica ad asciugare. La resina epossidica isolerà e proteggere le connessioni.

4. Preparare il copricapo (Figura 2D, 2E)

Nota: La striscia testata è un 3-D stampato striscia 7 buche modellata dalla striscia di nylon serie Amphenol 221 utilizzato per la testata da Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.. Questo pezzo non viene più prodotta commercialmente. Il file stampante può essere scaricato dal sito web di questo giornale.

  1. Toccare il primo foro nella striscia per una vite 0-80 x 1 "e lasciare un buco vuoto dopo il primo buco.
  2. Premere cinque perni dorati attraverso il fondo dei restanti cinque fori (attraverso le estremità più strette). Utilizzare una morsa per facilitare spingere i perni nella striscia in modo uniforme.
  3. Utilizzando un estrattore termico, rimuovere circa 0,5 cm di rivestimento in poliimmide l'estremità di un filo di acciaio inossidabile (0,005 in. Diametro), saldare l'estremità nuda del wire all'apertura di uno dei perni e tagliare il filo di 0,6-0,7 cm.
  4. Striscia circa 0,2 cm dall'estremità del filo per permettere il passaggio di corrente per l'animale.
  5. Ripetere i passaggi 4,3-4,4 per i restanti tre fili.
    Nota: le prime due fili registra le risposte EMG mentre il secondo di due servirà ad erogare uno shock per l'animale.
  6. Come l'ultimo (quinta) filo servirà come un filo di terra, taglio di circa 5 cm di filo non rivestito di acciaio inossidabile (0.005 in. Di diametro), e saldare al pin rimanenti.
  7. Garantire la continuità tra i fili e per i perni con un multimetro. (Nel caso del filo di terra, che è rivestito, la sonda multimetro può essere posizionato in qualsiasi punto lungo il filo.)

5. Preparazione chirurgica (Figura 2F)

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, compresa la testata. Sterilizzare il casco immergendola in alcool e poi risciacquo con soluzione salina sterile.
  2. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 3-4% vaporized isoflurano mescolato con una portata di 1-2 L di ossigeno al minuto.
  3. Accertare che l'animale è completamente anestetizzato con un pizzico punta. Il mouse è completamente anestetizzato quando non risponde di riflesso per il pizzico punta.
  4. Una volta che l'animale è stato completamente anestetizzato, iniettare una dose di buprenorfina cloridrato come analgesico (0,05-2 mg / kg, sc), radere parte superiore della testa dell'animale, posizionarlo su una piastra elettrica coperta sulla base del telaio stereotassico , accertare che l'animale è completamente anestetizzato, e fissare la testa al telaio. Mantenere flusso di isoflurano vaporizzato all'animale, commutazione al 2% ad una portata di 1-2 L di ossigeno al minuto. Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica alle cornee.
  5. Disinfettare il cuoio capelluto con povidone-iodio e alcol tre volte ciascuna, alternando tra i due.
  6. Con una lama numero 10 o 15 bisturi, fare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto, esponendo il cranio dalla parte anteriore della tha gli occhi di oltre l'osso interparietale (~ 1,5-2 cm).
  7. Trattenere i lembi della pelle con micro clip. Inserire una clip sopra l'occhio, uno lungo il centro dell'asse rostrale-caudale, ed una sul retro del cranio bilateralmente (cioè, utilizzare sei clip in tutto). Per evitare casco avulsione, esporre tanto del cranio possibile, compresi i lati e sul retro. Ciò aumenterà la superficie di applicazione del cemento cementazione adesiva.
  8. Usando il bisturi, raschiare lungo la parte superiore del cranio per rimuovere il periostio e garantire una superficie di lavoro pulita e asciutta. Pulire la parte superiore del cranio con perossido di idrogeno al 3% per tre volte.
  9. Praticare due fori nel cranio con una dimensione di 34 invertito Burr cono o una fresa 1,6 millimetri incisione punta da trapano di accettare 00-90 viti (0,0625 in. Lunga). Le viti forniranno il collegamento elettrico a terra. Inserire un foro davanti Bregma, e l'altra di fronte Lambda, a sinistra della linea mediana quando condizionamento del right occhio. Mettere una vite in ogni buco. Abbassare la vite 0,28 millimetri nel cranio per ogni giro completo; due giri completi è sufficiente.
  10. Creare diverse piccole zolle di circa 0,75 mm di diametro sul cranio al fine di aumentare la superficie e la forza di presa per il cemento.
  11. Prendere la testata completato e avvolgere il cavo di terra in una configurazione a forma di otto intorno alle due viti. Consentire un certo allentamento (~ 1,5 cm tra la testata e la vite) nel cavo di terra in modo che il casco può essere posizionato correttamente in seguito.
    Nota: La figura otto norma assicura un buon collegamento elettrico tra il filo e le viti di terra. Il filo può essere saldato alla vite per assicurare un collegamento elettrico.
  12. Applicare il cemento cementazione adesiva. Seguire le istruzioni del produttore per la miscelazione del cemento cementazione adesiva o miscelare 4 cucchiai di mix L-polvere, 8 gocce di base, e 2 gocce di catalizzatore in un piatto di miscelazione in ceramica a freddo (garantire la striscia di temperatura on il piatto di miscelazione è completamente nero.) La temperatura fredda estende il tempo di lavoro del cemento.
    1. Rivestire il cranio e le viti liberalmente con il cemento composito e consentire il cemento si asciughi. Questo dovrebbe prendere solo pochi minuti.
  13. Dopo il cemento è asciugata, posizionare la testata verticale, con i perni in piedi, sopra il cranio. Tenere il casco in posizione con un supporto simile al connettore
    Nota: vedere "3. Montaggio del connettore" -Il titolare deve essere solo una striscia di cinque fori con prese placcati in oro al fine di ricevere i perni della testata. Il supporto è attaccato ad un braccio sul telaio stereotassico. L'utilizzo del supporto e del braccio facilita il posizionamento della testata ei fili.
  14. Dopo la testata è stata posizionata, sbucciare indietro la pelle intorno alla zona periorbitale e posizionare i due fili d'urto per permettere ai 0,2 cm fine spogliato di riposare sotto la pelle e di circa 2-4 mm direttamente caudale al eye. Evitare che le estremità dei due cavi si tocchino. Posizionare i due fili EMG sulla muscolare orbicolare al di sopra della cavità oculare.
    1. Se necessario, tagliare le estremità dei fili se sono troppo lunghi e sembrano come se possono direttamente graffiare l'orbita e causare infezioni. Se tagliare le estremità del filo, assicurarsi che ci sia abbastanza filo nudo esposto. In alternativa, se i fili sembrano troppo lungo, piegare il filo indietro alla base, dove si estendono fuori dal casco.
    2. Cemento base dei fili (cioè, l'estremità vicino alla testata) in posizione sul cranio con una piccola diffusione del cemento composito adesivo e lasciare asciugare (uso la metà della porzione descritta in precedenza).
  15. Rimuovere le micro clip e piegare delicatamente i lembi di pelle indietro sopra il cemento. Lasciare la pelle di stabilirsi naturalmente a prevenire tensioni su qualsiasi parte della pelle per evitare distorsioni della palpebra, la prevenzione della risposta eyeblink,e disagi all'animale.
  16. Sigillare la zona esposta con cemento dentale, che copre tutto dalla pelle incisa al bordo della parte superiore della testata con cemento. Prestare particolare attenzione per evitare di gocciolare cemento sugli occhi o dei perni della testata. Parzialmente cemento indurito può essere lisciata e manipolato con un batuffolo di cotone che viene inumidito con solvente cemento dentale. Lasciare che il cemento si asciughi completamente prima di rimuovere il supporto testata.
  17. Lasciare che l'animale per recuperare da anestesia su una superficie riscaldata prima di sostituire l'animale torna nella sua gabbia. Somministrare Metacam (1 mg / kg, SQ) e poi posto l'animale torna nella sua gabbia.
  18. Permettere all'animale 5-7 giorni di recupero prima del test o di formazione. Mantenere cure post-operatorie standard per l'animale secondo le direttive del vostro istituto. L'animale deve essere controllato almeno una volta al giorno dopo che ha recuperato da un intervento chirurgico. Attenzione ai segni di scarsa mangiare e / o bere e il comportamento svogliato. Se il doloresi sospetta, fornire Metacam ogni 24 ore (stessa dose alla fine del post-chirurgico) fino alleviato. La lidocaina può essere applicato localmente sulla ferita se l'animale si gratta o mostra segni di disagio.

6. posizionando il mouse sul cilindro e la formazione (Figura 2G)

  1. Per posizionare il mouse sul cilindro, frenare il mouse con una mano brevemente tenendola per la coda con una mano e poi afferrare il mouse dietro le spalle con indice e pollice con l'altra. Avvolgere le altre dita intorno addome e il tronco del mouse.
  2. Con la mano non frenare il mouse, collegare il connettore al casco sulla testa del mouse e ruotare la vite di bloccaggio.
  3. Posizionare il mouse delicatamente sul cilindro e tenerlo in posizione mentre si collega il connettore al telaio. Utilizzare le due viti per fissare il connettore al bar sopra il cilindro.
  4. Una volta che il connettore è stato fissato al telaio del cilindro, release la presa sul mouse. Dare il mouse un giorno due sessioni di assuefazione al cilindro. Consentire ogni sessione assuefazione la stessa durata di ogni sessione di condizionamento.
    1. Record velocità di intermittenza spontanea durante assuefazione e pre-esporre i topi alla vibrazione baffo CS per minimizzare il verificarsi di risposte trasalimento. Applicare il CS come durante una sessione attuale di, ma senza la scossa elettrica degli Stati Uniti.
    2. Applicare la stimolazione baffo CS posizionando sistema Piezo stretta (circa 0,5 cm) al lato condizionata (lato destro) del mouse, mentre scivolare i denti del pettine sopra individuali baffi. Assicurarsi che le stesse basette vengono stimolati giorno per giorno posizionando il sistema Piezo nella stessa posizione da un giorno all'altro.
  5. Iniziare la formazione con il mouse sul condizionamento classico. Consegnare due sessioni di allenamento al giorno per cinque giorni. Lasciare circa due ore tra una sessione di allenamento.
    1. Per il gruppo condizionata, deliver trenta prove per sessione di un lungo 250 msec vibrazioni whisker CS (60 Hz) accoppiato con una lunghezza di 100 msec impulso elettrico US (0,3 mA - 3 mA, forniti da un WPI A385R stimolo sezionatore). Separare il CS e gli Stati Uniti con un msec lungo intervallo di traccia 250 priva di stimoli per rendere il compito dipende l'ippocampo (Figura 1) 23.
    2. Regolare l'intensità dello shock elettrico per ogni animale in modo che un battito viene evocata. prove separate con un intervallo tra le prove casuale di 30-60 secondi (media di 45 secondi, la durata complessiva di 30 minuti per sessione.)
    3. Invia trenta spaiato CS solo e noi soli sperimentazioni ciascuno (per un totale di sessanta studi) al gruppo pseudoconditioned, utilizzando gli stessi parametri di stimolo come indicato per il gruppo condizionata. Assicurarsi che il CS da solo e degli Stati Uniti prove da soli sono pseudorandomized in modo tale che nessuno stimolo è presentato più di due volte di fila. Separare ogni prova con un intervallo medio tra le prove di 22,5 sec.
  6. defegato rumore di fondo a 65 dB in tutto assuefazione e di formazione, al fine di mascherare qualsiasi rumore della vibrazione generata dal stimolatore soffio.

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Representative Results

8-10 settimane di età topi maschi C57Bl6 / J sono stati formati sulla traccia eyeblink condizionata sull'apparato tapis roulant cilindrica testa fissa. 8 topi sono stati addestrati con le presentazioni appaiate CS-Stati Uniti (gruppo condizionata) e 9 topi sono stati addestrati con le presentazioni spaiati CS e statunitensi (gruppo pseudoconditioned).

Esempio EMG registrazioni di una risposta condizionata da un mouse condizionata sono illustrati nelle figure 3 e 4. Registrazioni EMG per ogni prova sono stati rettificati e integrati con una costante msec di tempo 10. La Figura 5 mostra la raddrizzata e integrati EMG tracce di risposta media in tutti i processi per ciascuna delle 10 sedute sia per una condizionata (A) e un mouse pseudoconditioned (B). L'evoluzione di risposte condizionate può essere visto in Figura 5A, con risposte sempre più grandi avvicina alla comparsa degli USA. Questa evoluzione non si vede in il risposte in Figura 5B pseudoconditioned.

L'evoluzione della ben scaduta, e le risposte quindi ben apprese condizionata può essere visto in Figura 6. La Figura 6 mostra gli istogrammi del tempo al picco della risposta seguente CS insorgenza. C'è un picco iniziale nel grafico tra 0 - 150 msec dopo CS esordio. Questo picco iniziale può essere visto come già nel sessione 1. Con allenamenti più, vi è lo sviluppo di un secondo picco nel grafico tra 400-500 msec tra gli animali condizionati, indicando lo sviluppo di risposte meglio cronometrati condizionata.

La figura 7A mostra i adattative condizionata risposte cento medi registrati da topi condizionati e pseudoconditioned. risposte di adattamento condizionata sono considerati avere una significativa attività che è presente almeno il 20 msec BEFinsorgenza ore US (vale a dire almeno 4 SD superiore all'attività medio presenti 250 msec prima CS insorgenza). Nel corso degli allenamenti, i topi hanno mostrato condizionata apprendimento graduale del condizionamento paradigma esibendo risposte adattative più condizionata, ogni sessione di allenamento in modo che i topi esposti condizionato significativamente più adattabile condizionata risposte rispetto a topi pseudoconditioned (gruppi, F (1,15) = 20.62, p <.0005; sessioni, F (1,9) = 9,987, p <.0001; gruppi * sessioni, F (1,9) = 5,977, p <0,0001). Si noti che il gruppo pseudoconditioned tipicamente esposto pseudo CR con meno del 20% delle prove.

La Figura 7B mostra la media dell'area risposta condizionata (l'area sotto la curva della risposta EMG rettificato e integrato) sia per topi condizionati e pseudoconditioned oltre gli allenamenti dieci. confronti previste al ripetute misure ANOVA sul last quattro sessioni (ad esempio, le sessioni di 7-10, una volta che il gruppo condizionata aveva raggiunto un criterio di apprendimento del 60% CR) mostrano un significativo effetto principale del gruppo, che indica che l'area CR era più grande nel gruppo condizionata che nell'apprendimento Post Group pseudoconditioned criterio (gruppi, F (1,14) = 5.733, p <.05; sessione, F (1,3) = 0,486, ns; gruppi * sessione, F (1,3) = 0,432, ns).

La figura 7C mostra le risposte (spavento) in media per cento alfa registrati da topi condizionati e pseudoconditioned. Alpha risposte sono attività entro 50 ms di CS insorgenza che erano almeno 4SD sopra l'attività media al basale. Nel corso degli allenamenti, condizionata e pseudoconditioned topi esposti tipicamente risposte alfa in meno del 25% delle prove, senza differenze significative tra i topi condizionati e pseudoconditioned (gruppi, 1,15 F () = 2.502, ns). the misure ripetute ANOVA hanno, tuttavia, rivelano una significativa interazione di gruppi e sessioni a causa della diminuzione delle risposte pseudoconditioned e la manutenzione di risposte alfa a circa il 25% per i topi condizionati (gruppi * sessioni, F (1,9) = 2.074, p <.05). L'aumento delle risposte alfa durante la sessione di 10 è probabilmente a causa della breve latenza di insorgenza del CR ben sviluppato.

Figura 7D mostra la media percentuale di risposta breve latenza registrati da entrambi i gruppi di topi. risposte a breve latenza riflette l'attività tra 50-70 ms dopo CS dall'inizio che era 4SD sopra l'attività media al basale. A ripetute misure ANOVA ha rivelato che gli animali esposti condizionati risposte latenza più brevi rispetto agli animali pseudoconditioned nel corso delle sessioni di allenamento dieci (gruppi, F (1,15) = 5,377, p <.05; sessione, F (1,9) = 3.920, p <.0005; gruppi * sessione, F (1,9) = 3.158, p <.005). Tla sua può riflettere un tempo esordio più precoce della CR, come il gruppo condizionata esposto CR di grosse dimensioni con ogni sessione di allenamento.

Figura 1
Figura 1:. La traccia Eyeblink condizionata paradigma Nella traccia eyeblink condizionata, un innocuo stimolo condizionato (CS) è accoppiato con uno stimolo incondizionato leggermente nocivi (US) destinata ad indurre una risposta batter d'occhio. Il CS e gli Stati Uniti sono separati da un gap temporale senza stimolo, rendendo il paradigma ippocampo-dipendente 23. Nel paradigma qui descritto, un 250 msec lungo baffo vibrazioni CS è accoppiato con un 100 msec lungo periorbitale urti degli Stati Uniti. Il CS e gli Stati Uniti sono separati da un lungo 250 msec gap temporale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 2:. Il capo-fisso Preparazione A, il set-up testa fissa per il condizionamento eyeblink con il cilindro, lo stimolatore baffo, e il connettore indicato B, lo stimolatore baffo con la flessione attuatore a due strati e pettine indicato.. C, il connettore con le singole parti indicato: vite di bloccaggio, la striscia di 7 buche, i fili saldati alle prese e resina epossidica per mantenere i fili, le ali convertiti da un TO-220 transistor stile D, la testata con l'individuo. parti indicate: la striscia 7 buche, i perni, ei fili saldati nei perni, compreso il cavo di terra in acciaio inossidabile non rivestito, e lo shock individuale e fili di acciaio inox EMG, con 0,2 cm di rivestimento in poliimmide spogliato fuori alla fine e. , la configurazione per ogni foro della striscia 7 fori per connettore e lacopricapo. F, un mouse con un copricapo impiantato chirurgicamente. G, Un mouse è posizionato sul cilindro, pronto per essere addestrati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Esempio EMG registrazione Le linee blu delineano la presentazione CS (lunga 250 msec). Le linee rosse delineano la presentazione degli Stati Uniti, che mostra il manufatto che viene dalla scossa elettrica (100 msec). Il CS e gli Stati Uniti sono separati da una 250 msec intervallo libero da stimolo. All'interno di questo intervallo libero da stimolo è l'attività EMG maggiore ampiezza (rispetto al basale), che delinea un CR. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ A>

Figura 4
Figura 4:. Esempio EMG e le registrazioni di riflessione infrarossi ottici corrispondenti La registrazione EMG è solo accurato come il sensore ottico a infrarossi riflessione nel rilevare l'insorgenza condizionato risposta (linea blu), la latenza di picco di risposta (linea rossa), e incondizionato eyeblink risposta insorgenza ( linea rosa). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Averaged Tracce eyeblink di media rettificati e tracce integrati della risposta eyeblink per un mouse condizionata (A) ed un mouse pseudoconditioned (B). Ogni traccia rappresenta la mediarisposta del mouse per tutte le prove su una singola sessione. La sezione blu rappresenta la risposta durante il baffo vibrazioni presentazione CS. La sezione rossa rappresenta la risposta durante l'intervallo di traccia senza stimolo. In A, lo shock ci ha indotto un artefatto che è presente durante l'area grigio scuro dopo l'intervallo di traccia. B mostra le risposte alla vibrazione baffo CS solo. Presentazione di sola CS e statunitensi prove solo era pseudorandomized in pseudoconditioning. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
. Figura 6: istogrammi della risposta di picco Tempi istogrammi del tempo al picco di risposta per tutte condizionato (n = 8; barre blu) e 8 pseudoconditioned (barre rosse) animali per tutti trIALS in tutte le sessioni (i dati da un topo pseudoconditioned è stato escluso per permettere un confronto diretto tra il numero di risposte tra i gruppi). barre viola indicano dove gli animali condizionati e pseudoconditioned sovrappongono. Le ore di punta di risposta sono calcolati come il tempo della grande vetta della registrazione EMG rettificato e integrato tra CS e US esordio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: Curve di risposta di animali condizionata (n = 8; curve blu) e gli animali pseudoconditioned (n = 9; curve rosse). A, percentuale Averaged risposte adattative condizionata (± SEM) per gli animali condizionati e pseudoconditioned oltre 10 sessioni di formazione. B, zona medi (± SEM) della CR per condizionatae gli animali pseudoconditioned oltre 10 sessioni di formazione. C, percentuale Averaged Alpha Response (± SEM) per gli animali condizionati e pseudoconditioned più di 10 sessioni di formazione. D percentuale Averaged risposte a breve latenza (± SEM) per condizionata e pseudoconditioned più di 10 sessioni. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Classical eyeblink condizionata è una forma di apprendimento associativo che è uno strumento utile per comprendere i substrati neurali alla base dell'apprendimento e della memoria. I metodi precedenti utilizzati per il condizionamento eyeblink in roditori come topi coinvolti una camera che ha permesso per l'animale di muoversi liberamente. Una preparazione testa fissa per il condizionamento eyeblink nei topi, con l'apparecchiatura descritta da Chettih et al. E Heiney et al. E più recentemente utilizzato in tracce eyeblink condizionata luce evocata in Siegel et al. Offre diversi vantaggi, come consentendo certa procedure ed esperimenti da eseguire durante il condizionamento eyeblink che non era stato possibile o era stata limitata in passato (ad esempio, in vivo calcium imaging a due fotoni) 14-16. Questo tipo di preparazione facilita anche l'uso di altre tecniche come elettrofisiologia in vivo con array tetrodo. Come i topi sembrano diventare Distressed da ritenuta, questa preparazione testa fisso è stato sviluppato per mantenere teste sicuro e riducendo la quantità di ritenuta necessaria. Mentre questa preparazione consente topi per deambulare su un tapis roulant cilindrica, altri hanno anche raccolto con successo i dati comportamentali da topi testa-fisso su una piattaforma stabile 24.

Vi sono, tuttavia, alcuni problemi che sorgono con l'utilizzo del sistema di testata-fisso. Una preoccupazione è che quando si pone inizialmente un mouse non addestrato sul cilindro, potrebbe essere necessario un po 'di tempo per imparare a riposare, camminare, correre o sull'apparato romanzo. La maggior parte dei topi imparano rapidamente a riposare, camminare, o correre sul cilindro comodamente. Due sessioni di assuefazione aiutano per abituare i topi al cilindro e entro la metà della seconda sessione, la maggior parte dei topi sono confortevoli sul cilindro. Un'altra preoccupazione che si pone è testata avulsion. C'è stato qualche problema con questo in passato durante le sessioni multiple formazione giorno, ma l'uso della cementazione adesiva cement ha alleviato i problemi con copricapo avulsione. L'uso del cemento cementazione adesiva ha portato a 0 avulsioni% copricapo da più di 50 interventi chirurgici in quanto con questa tecnica. Con l'uso corretto e la diffusione sufficiente del cemento sul cranio, i ricercatori dovrebbero incontrare alcun problema con il casco avulsion. Infine, presentando il CS durante le sessioni di assuefazione, ci può essere qualche preoccupazione per l'inibizione latente. È chiaro, tuttavia, che i topi sono stati condizionati correttamente (vedi Figura 7). Si noti che l'intensità della vibrazione basette può essere modificato cambiando la quantità di tensione essendo passato per il reostato. Se i topi sono in grado di conoscere, la tensione può essere aumentata per supportare condizionata successo minimizzando al contempo startle risposte. I ricercatori possono anche cambiare il tipo di scossa elettrica degli Stati Uniti che viene consegnato per l'animale. La scossa elettrica degli Stati Uniti può essere un singolo impulso elettrico della durata di 100 msec, come riportato qui. In alternativa, come the stimolo isolatore utilizzato in questo protocollo è in grado di trasmettere impulsi bifasici, i ricercatori possono anche impiegare 120 Hz 6 paia impulso bifasico a 1 msec per impulso per una scossa elettrica efficace degli Stati Uniti pure.

Boele et al. Ha indicato la probabilità che certe "condizionata risposte" possono derivare da trasalimento (alfa) risposte al CS o risposte a breve latenza (SLR) 25. risposte Alpha sono considerati chiusure palpebra rapidi all'interno di una latenza di 50 ms dopo CS esordio. Topi spesso tenere gli occhi chiusi per la durata del processo, seguendo questa risposta alpha. Reflex, d'altra parte, hanno una latenza di 50-70 msec da CS insorgenza e si presentano in genere dopo pochi abbinamenti CS-americani. La breve latenza d'esordio di entrambi alfa e reflex e il fatto che le reflex possono sorgere dopo pochi abbinamenti CS-Stati Uniti indicano che essi sono probabilmente non guidati dai circuiti dell'ippocampo-cerebellare. Queste osservazioni recensiti da Boele et al. Therefore mendicare la questione se i CR registrati qui sono apprese le risposte. Come mostra la Figura 7C e 7D spettacolo, né risposte alfa né reflex rappresentano la maggioranza dei CR registrati, il che suggerisce che i CR adattive sono mediate dal cervello anteriore e del cervelletto. Gli istogrammi in figura 6 che mostrano la latenza al picco della risposta eyeblink seguente CS insorgenza indica anche che, mentre alcuni studi possono includere un alfa insorgenza precoce o una risposta a breve latenza, con più prove di formazione, il picco della risposta eyeblink verifica effettivamente più tardi e più vicino alla comparsa degli Stati Uniti, che indica lo sviluppo di risposte tempestive condizionati. Come accennato in precedenza, la stimolazione baffo e l'intensità d'urto sono stati attenuati ad un livello che non era sorprendente o eccessivamente repulsivo, ma rimane efficace nel produrre adattative condizionata risposte. Infine, come mostra la Figura 7B, la dimensione del CR (misurata come l'area sotto laCurva nella risposta rettificato e integrato, come in Figura 5) è maggiore nel gruppo condizionata che nel gruppo pseudoconditioned volta il gruppo condizionata raggiunto un criterio apprendimento del 60%, indicando che queste risposte richiedono diverse sedute per imparare, a differenza reflex e alpha risposte.

Boele et al. Ha anche sottolineato che le misurazioni EMG, mentre un metodo accurato di rilevazione lampeggiare in animali più grandi, come i conigli, non sono pratico in piccoli roditori come topi 25. Si consiglia l'uso della tecnica di misurazione della distanza magnetica (MDMT) per evitare il rilevamento di segnali falsi positivi che la registrazione EMG può indicare. La tecnica MDMT, mentre impressionante nella sua sensibilità e la qualità della rilevazione lampeggiare, presenta anche l'inconveniente di dover anestetizzare l'animale ogni giorno di formazione per fissare il chip 26. Questo di per sé potrebbe confondere i tassi di apprendimento. Troviamo che i segnali EMGregistrato con le procedure descritte qui sono facilmente reperibili, di alta risoluzione temporale, affidabile e relativamente facile da misurare e analizzare.

La figura 4 mostra un segnale rappresentativo EMG rilevamento lampeggia con un corrispondente segnale da un sensore ottico riflettente infrarossi posizionato vicino all'occhio del mouse durante la formazione. C'è una chiara correlazione nella rilevazione lampeggiare tra il segnale EMG e il sensore ottico, che denota la precisione del rilevamento batter utilizzando registrazioni EMG. Un vantaggio di registrazioni EMG è che permette il massimo risoluzione temporale. Anche se la risoluzione è degradata integrando su una costante di tempo msec 10, si può anche analizzare i dati EMG grezzi per rilevare l'attività batter occhio. Conteggio Spike è un parametro che può essere utilizzato per rilevare CR 18. Uno svantaggio con le registrazioni EMG è che i segnali saranno senza dubbio essere contaminati da l'artefatto elettrica proveniente dalla scossa elettrica degli Stati Uniti (vedi condizionata, cioè quelle che si verificano prima della comparsa degli Stati Uniti. Un altro svantaggio nell'impiego registrazioni EMG è che, con l'attuale criterio di rilevazione CR, una linea di base rumorosa può nascondere quello che potrebbe altrimenti sarebbe stato rilevato come CR.

La preparazione testa fissa qui descritto è simile a quello presentato da Heiney et al. 15 Vi sono, tuttavia, alcune differenze notevoli dal loro sistema elegante. Ad esempio, il metodo descritto qui per registrare le risposte Eyeblink sono cavi posati subdermally sopra l'occhio per registrare l'attività EMG. Questa tecnica permette di registrazioni affidabili e stabili di attività palpebra e quindi, della risposta eyeblink. Il corretto posizionamento e fissaggio di questi fili garantisce registrazioni di qualità che durano per almeno due settimane, la durata dell'esperimento. Un vantaggio di utilizzare cavi EMG piuttosto che un elevatofotocamera -speed come quello usato dal Heiney et al. è che le registrazioni EMG sono estremamente elevata risoluzione temporale, e non richiedono il posizionamento quotidiano e la calibrazione che una fotocamera richiede 15. La fotocamera, tuttavia, offrono la determinazione visiva diretta di chiusura delle palpebre.

Un'altra differenza tra i due sistemi è il metodo per la consegna CS. Questo particolare la preparazione del mouse testa fissa utilizza la stimolazione baffo come stimolo condizionato. I risultati dimostrano che i topi possono essere condizionati in modo efficace con la stimolazione baffo come il CS, proprio come conigli testa-determinato possono essere condizionati con baffo vibrazioni 27. Heiney et al. Hanno dimostrato stimolazione del pad baffo come efficace CS dirigendo un soffio debole di aria al pad basette 15. Anche se entrambe le tecniche dimostrano condizionata efficace, mettendo un pettine sopra baffi selezionati e vibrare il pettine permette la capacità di stimolare Whiske individualer righe o anche singoli baffi. Questa tecnica è stata utilizzata in studi precedenti per consentire agli animali di servire come loro controllo (cioè, la riga baffo stimolata è stata confrontata con una fila di whiskers non stimolati) 20.

In sintesi, una preparazione testa fisso per baffo-segnalato eyeblink condizionata permette una piattaforma cranica garantito per l'esecuzione di tecniche avanzate e la sperimentazione che era stato in precedenza impossibili o difficili da eseguire. stimolazione baffo Mild è stato utilizzato come stimolo condizionato ed una lieve scossa elettrica è stato utilizzato come stimolo incondizionato. risposte Eyeblink sono state registrate con cavi posati subdermally dietro la palpebra. apprendimento affidabile è stata dimostrata in topi con la stimolazione diretta di baffi selezionati come il CS e scosse elettriche periorbitale come gli Stati Uniti, e nessun apprendimento era evidente nei topi che sono state date le presentazioni casuali del CS e negli Stati Uniti. Le registrazioni EMG fornito un affidabile e relMetodo tivamente semplice per registrare le risposte Eyeblink e osservando come le risposte modificate attraverso sessioni di formazione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa (W81XWH-13-01-0243) e il National Institutes of Health (R37 AG008796). Ringraziamo Alan Baker nel negozio di macchina della Northwestern University per costruire l'apparato cilindro di testa fissa. Ringraziamo il Dott Shoai Hattori per la sua guida in MATLAB e Solidworks. Ringraziamo il Dr. John Power per il software LabView che controllava l'esperimento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"  Amazon B002ONUM0E For cylinder
Plexiglas Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter) Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long) Amazon Supply B00F33Q8QO For cylinder
Classic Design Hair Comb Conair 93505WG-320 For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator Piezo Systems T220-A4-303X  For whisker stimulation
Solder and Flux Kit Piezo Systems MSF-003-NI For whisker stimulation
Magnetic Base Thor Labs MB175 For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor Amazon Supply B0002ZPZYO  For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets Electronic Connector Corp. 220-S02 For connector
Relia-Tac Pins Electronic Connector Corp. 220-P02 For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) Amazon Supply B000FN68EE Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) Amazon Supply B000N2TK7Y Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid Loctite 1365896 Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy Ace Hardware 18613 For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) PlasticsOne 005sw/2.0 37365 S-S  For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) AM Systems 792800 For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer Tenma 72-110 For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier A-M Systems 1700 Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator World Precision Instruments 31405 For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein: Animal Health 50031 For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc NDC 12496-0757-1 For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment  Akorn NDC 17478-062-35 Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads PDI NDC 10819-3883-1 For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) Integra Miltex  4-7. For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades Integra Miltex 4-310 or 4-315 For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip Roboz RS-5459 For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) Amazon Supply B002SG89X4  For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool Walnut Hollow 29637 Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr Roboz RS-6282C-34 Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit Dremel 106 Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base Parkell S398 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder Parkell S399 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml Parkell S371 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip Parkell S387 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5 World Precision Instruments 504506 For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators VWR International 10806-005  For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit Dentsply 675570 For surgery; dental cement

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References

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