Moustaches de signalisation eyeblink conditionnement classique chez les souris de tête-fixe

1Department of Physiology, Northwestern University
Behavior

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Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice. J. Vis. Exp. (109), e53310, doi:10.3791/53310 (2016).

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Abstract

Introduction

conditionné eyeblink est une forme de conditionnement pavlovien et un système de modèle pour étudier les mécanismes neuronaux de l'apprentissage associatif et de la mémoire. Il a été étudié chez différentes espèces, y compris les humains, les lapins, les chats, les rats et les souris. Le paradigme implique la présentation de deux stimuli appariés: un stimulus neutre conditionné (CS, par exemple, un ton, un éclair de lumière, ou la stimulation de la moustache), et un stimulus inconditionné saillant (Etats - Unis, par exemple, une bouffée d'air à l'œil, ou choc périorbitaire). Les États - Unis suscite, une réponse eyeblink réflexive inconditionnée (c. -à- UR). Finalement, après plusieurs présentations du CS-US jumelé, le sujet apprend à associer le CS avec les États-Unis. Cet apprentissage se manifeste sous la forme d'une réponse conditionnée (RC), un clin d'œil provoquée par le CS seul qui précède la présentation des Etats-Unis.

conditionné eyeblink sous forme de trace comprend un intervalle de quelques heures sans stimulusmillisecondes undred qui sépare le CS et les États - Unis (figure 1). Trace conditionné est une forme d'apprentissage déclarative puisqu'elle nécessite la sensibilisation aux risques de relance 1. L'écart temporel besoin de l'animal pour maintenir une neuronal «trace» de la CS dans les régions du cerveau antérieur telles que l'hippocampe pour que les États - Unis et de la CS de devenir associé 1-6. Ainsi que les régions du cerveau antérieur, le conditionnement de trace est également dépendante du cervelet 7.

conditionné eyeblink est donc un paradigme utile pour l'enquête sur les multiples facettes de la mémoire, y compris l'acquisition, la consolidation et la récupération. Pendant le conditionnement eyeblink, un groupe témoin d'animaux est présenté avec des stimuli non appariés dans un ordre aléatoire pour tester pseudoconditioning ou sensibilisés réponses à la CS qui peuvent être causés par la présentation seuls Etats-Unis plutôt que d'une association CS-US appris.

Un appa couramment utiliséTus pour l'enquête du conditionnement eyeblink chez les rongeurs est une chambre dans laquelle les rongeurs sont autorisés à se déplacer librement pendant le processus de formation 8-10. Avec ce type d'appareil, une attache est normalement attaché à une pièce de tête qui est fixée au crâne du rongeur. L'attache permet la livraison des États - Unis (et parfois le CS) et pour transmettre la réponse de l'animal à ces stimuli ( par exemple, la réponse de eyeblink) 10. L'attache elle-même peut être modifiée en fonction du type de stimulus délivré et la manière dont la réponse en eyeblink est enregistrée.

La raison de l'utilisation "librement mobiles" souris attachés pour le conditionnement eyeblink est que les souris luttent contre la retenue. Bien que d'autres espèces peuvent être plus favorable à la retenue, le principal avantage d'utiliser des souris dans des expériences de conditionnement eyeblink est que la majorité des souches mutantes disponibles génétiquement modifiées sont des souches de souris. En plus de difficulté, res completsTraint des souris entraîne une détresse aiguë. Une préparation de la souris tête fixe qui minimise le stress augmenterait l'information physiologique qui peut être obtenue pendant le conditionnement eyeblink. Par exemple, ce système pourrait permettre l' imagerie des neurones corticaux avec deux photons 11 microscopie.

Préparations de tête fixe ont été utilisées dans les expériences précédentes pour l' imagerie optique du cortex au moyen d' implants crâniens amovibles, in vivo , des enregistrements électrophysiologiques du cerveau de rongeurs avec des tableaux tétrode, l' imagerie calcique à deux photons, et aussi comme une plate - forme pour le conditionnement eyeblink chez les souris 11 -16.

Dans le système de tête fixe, la stimulation et des enregistrements fiables sont assurés sans retenue complète de la souris (Figure 2). Un bandeau tel que celui utilisé dans le système se déplaçant librement est fixé sur le crâne de la souris. Pendant l'entraînement, l'élément de tête est fixé à un connecteur qui est fixé au-dessus des barresun tapis roulant cylindrique afin de stabiliser la tête du rongeur (figure 2A). Le tapis de course cylindrique permet à la souris de se reposer confortablement, mais si la souris le souhaite, lui permet également de courir ou de marcher. Avec l'utilisation de ce système, les souris peuvent être formés avec une vibration de moustache que le CS et un choc électrique périorbitaire doux que les États - Unis (figure 1). Les États-Unis est assurée par des fils chirurgicalement placés sous la partie latérale de la peau à l'œil. CS est délivrée par l' intermédiaire d' un peigne qui est attaché à une couche 2 rectangulaire actionneur de flexion (figure 2B). Le peigne et de l'actionneur de flexion sont ensuite attachés à une base magnétique qui est déplacé vers la position correcte pendant l'entraînement et est ajusté pour la livraison optimale pour chaque animal. Le peigne est positionné à cheval sur les moustaches sélectionnés. Lors de la livraison du CS, un signal est envoyé à l'actionneur de cintrage qui déplace le peigne et conduit à des vibrations des barbes 17.

16,18,19. La stimulation de trichites de motif est choisi pour que le CS dans ce paradigme expérimental est la dépendance à l'égard des animaux murins sur leur vibrisses pour somatosensoriel entrée d'information au cours de l'exploration. Moustaches stimulation a été montré pour être un CS fiable et efficace 20. En outre, étant donné le substrat cortical bien établi et organisé du système de vibrisses (ie, le cortex baril), la stimulation de la moustache que le CS fournit un outil élégant pour cartographier les changements corticaux et la plasticité associés à l' apprentissage eyeblink conditionné 20,21. Un système de tête fixe permet la stimulation précise de moustaches sélectionnées pour comparer les réponses entre les neurones et les neurones recevant des entrées de moustaches non stimulées stimulées. Enfin, de nombreuses souches de souris présentent une perte auditive liée à l'âge comme relativement jeunes adultes 16). Trichites stimulation ne soit pas affectée par l'une ou l'autre de ces complications.

Présenté ici sont des modifications uniques et importantes sur d'autres préparations de tête-fixe pour le conditionnement eyeblink, y compris les méthodes de livraison CS et des États-Unis, et l'acquisition de la réponse eyeblink. La fiabilité de cet appareil et le paradigme de la formation dans le conditionnement eyeblink est démontrée par des courbes de souris climatisées et une courbe d'apprentissage relativement plat des animaux témoins pseudoconditioned (Figure 7A) d' apprentissage.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par Institutional Animal Care de l'Université Northwestern et l'utilisation Comité sur la base des lignes directrices publiées par l'Institut national de la santé.

1. Le cylindre (figure 2A)

  1. Construire le cylindre comme décrit par Chettih et al. Et Heiney et al. À partir d' un long cylindre de mousse 14-15. Couper une longueur de 10 cm du cylindre et percer un trou dans le centre pour adapter l'axe, une tige de 12,7 mm de métal (0,5 po.) De diamètre. Monter le cylindre avec son axe sur un breadboard optique métallique tel que décrit par Heiney et al. , Ou un autre support (par exemple, Plexiglas) 15.
  2. Ériger deux tiges métalliques verticales de 12,7 mm de diamètre de part et d'autre du cylindre.
  3. Fixez les deux supports à angle droit sur les tiges métalliques.
  4. Fixer deux tiges plus (5 cm de long, 12,7 mm de diamètre) à travers les supports à angle droit. Bevel ee extrémités de ces tiges et niveler leurs extrémités au- dessus du centre du cylindre (figure 2G).
  5. Percer et appuyez sur un trou à travers les extrémités nivelées des tiges pour tenir deux 4-40 vis de la machine qui contiendra les ailes du connecteur en place (Figure 2G).

2. Montage du système de stimulation Whisker (figure 2B)

  1. Couper un segment de 10 dent de peigne d'un peigne ordinaire.
  2. Couper une fente d'environ 2-3 mm de large et environ 5 mm de profondeur sur la partie supérieure du peigne à accepter un 2-couche actionneur de flexion rectangulaire.
  3. Soudez un fil à chaque surface de l'actionneur de flexion. Utiliser la soudure et du flux fourni par le fabricant. Couverture de l'actionneur et de la soudure avec du ruban isolant pour protéger la souris et de l'utilisateur à partir du courant électrique.
  4. Glissez la barre d'actionnement dans la fente découpée dans le peigne de telle sorte que la bande de l'actionneur de flexion se trouve perpendiculaire au plan du peigne. Angle du peigne de sorte qu'il est incliné à 45 ° et plus naturellement suit la courbe du visage de la souris.
  5. Fixer l'extrémité de la bande d'actionneur vers le haut du peigne avec prise rapide époxy.
    Remarque: les fils soudés sur la bande d'actionneur de flexion doivent être connectés à un rhéostat qui délivre 40 volts à l'actionneur. Des expériences antérieures ont montré que 40 volts est efficace pour le conditionnement, mais n'évoquent pas de réactions effarouchées.
  6. Placez l'actionneur de pliage et le peigne sur un support mobile. Un porte-pipette attachée à une base magnétique normalement utilisé pour les plates - formes in vitro d'électrophysiologie fonctionne bien.

3. Montage du connecteur qui se monte à Rods au-dessus du cylindre (figure 2C, 2E)

Remarque: Le connecteur est un 3-D imprimé bande 7 trous modélisée de la série 221 bande de nylon Amphenol utilisé pour l'attache par Weiss et Disterhoft et Galvez et al 10,17.

  1. Appuyez sur le premier trou dans la bande pour un x-1 0-80"Vis de la machine. Cela servira une vis de blocage pour fixer le casque au connecteur. Apposer un écrou 0-80 à la tête de la vis de blocage avec de la colle cyanoacrylate, afin de faciliter la rotation de la vis à la main.
  2. Laisser un trou vide après le trou taraudé (pour laisser place à l'écrou 0-80 de la machine) et pousser cinq prises relia-tac dorés à travers les cinq trous restants.
  3. Dénuder le revêtement de cinq longs fils (fils obtenus à partir d'un câble Ethernet) et souder les extrémités des douilles.
    Remarque: Les deux premiers fils seront utilisés pour enregistrer les signaux électromyographiques (EMG) qui détecteront une réponse eyeblink suivant le filtrage du signal et l'amplification d'un amplificateur. La seconde deux vont délivrer le signal de choc d'un isolateur de stimulus. Le dernier fil servira de liaison au sol. Ces fils seront connectés aux systèmes utilisés pour la livraison CS-US chronométré.
  4. Assurer la connectivité électrique entre les fils et les prises avec un multiMeter. Mettez le multimètre sur le réglage de la continuité et de maintenir l'une des sondes à la broche et l'autre sonde aux extrémités dénudées du fil. Les broches et les fils sont reliés électriquement lorsque la résistance est faible et le multimètre émet un signal sonore.
    1. Par ailleurs, si le multimètre n'a pas de réglage de la continuité, mesurer la résistance entre les broches et les fils. Il y a continuité électrique s'il y a très peu de résistance mesurée.
  5. Préparer les ailes du connecteur à partir de transistors deux TO-220 style. Coupez les fils émetteur, de base et de collecteur du transistor et niveler la surface de sorte qu'il peut être apposé sur le connecteur.
  6. Coupez le bord de la patte de fixation de violer le trou de sorte que la languette peut se glisser sous la tête de la vis.
  7. Époxy transistors au connecteur. Le trou dans la patte de fixation est utilisé pour fixer le connecteur aux tiges au-dessus du cylindre.
  8. Appliquer l'époxy sur la base des fils protruding des prises de courant et permettre à l'époxyde sécher. L'époxy va isoler et protéger les connexions.

4. Préparation de la Coiffe (figure 2D, 2E)

Remarque: La bande de têtière est un 3-D imprimé bande 7 trous modélisée de la bande série de nylon Amphenol 221 utilisé pour la têtière par Weiss et Disterhoft et Galvez et al 10,17.. Cette pièce est plus fabriqué commercialement. Le fichier d'imprimante peut être téléchargé à partir du site web de ce journal.

  1. Appuyez sur le premier trou dans la bande pour une "vis 0-80 x 1 de la machine et laisser un trou vide après le premier trou.
  2. Poussez cinq broches plaqués or à travers le fond des cinq trous restants (à travers les extrémités plus étroites). Utilisez un étau pour faciliter pousser les broches dans la bande uniformément.
  3. En utilisant un extracteur thermique, retirer environ 0,5 cm d'un revêtement de polyimide à l'extrémité d'un fil d'acier inoxydable (0,005 po. De diamètre), souder l'extrémité dénudée du poidsire à l'ouverture de l'une des broches et couper le fil à 0,6-0,7 cm.
  4. Bande d'environ 0,2 cm de l'extrémité du fil pour permettre au courant de passer à l'animal.
  5. Répétez les étapes 4,3-4,4 pour les trois fils restants.
    Remarque: Les deux premiers fils vont enregistrer les réponses EMG tandis que le second deux vont servir à délivrer un choc à l'animal.
  6. Comme la dernière (cinquième) fil servira de fil de terre, couper environ 5 cm de fil non revêtu d'acier inoxydable (0,005 po. De diamètre), et de la soudure à la broche restante.
  7. Assurer la continuité entre les fils et les broches avec un multimètre. (Dans le cas du fil de terre, qui est non couché, la sonde multimètre peut être placé n'importe où le long du fil.)

5. Préparation chirurgicale (Figure 2F)

  1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris la têtière. Stériliser l'élément de tête en le trempant dans de l'alcool, puis rincer avec une solution saline stérile.
  2. Anesthésier la souris dans une chambre d'induction à 04/03% en volumeaporized isoflurane mélangé avec un taux de 1-2 litres d'oxygène par minute.
  3. Vérifier que l'animal est entièrement anesthésié avec une pincée d'orteil. La souris est entièrement anesthésié quand il ne répond pas réflexive au pincement des orteils.
  4. Une fois que l'animal a été complètement anesthésié, injecter une dose de chlorhydrate de buprénorphine comme analgésique (0,05-2 mg / kg, sc), de se raser le haut de la tête de l'animal, placez-le sur un coussin chauffant recouvert sur la base du cadre stéréotaxique , vérifier que l'animal est complètement anesthésié, et fixer la tête sur le cadre. Maintenir le débit d'isoflurane vaporisé à l'animal, le passage à 2% à un taux de 1-2 litres d'oxygène par minute. Appliquez une petite quantité de pommade ophtalmique aux cornées.
  5. Désinfecter le cuir chevelu avec povidone-iode et d'alcool trois fois chacun, en alternance entre les deux.
  6. Avec une lame n ° 10 ou 15 scalpel, faire une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu, à exposer le crâne de l'avant du til les yeux au-delà de l'os interparietal (~ 1,5-2 cm).
  7. Retenez les volets de la peau avec des micro clips. Placez un clip dessus de l'œil, on le long du milieu de l'axe rostrale-caudale, et un à l'arrière du crâne bilatéral (c. -à- utiliser six clips en tout). Afin d'éviter que headpiece avulsion, exposer autant du crâne que possible, y compris les côtés et l'arrière. Cela augmente la surface pour l'application du ciment colle de scellement.
  8. En utilisant le scalpel, gratter le long du sommet du crâne pour enlever le périoste et d'assurer une surface de travail propre et sec. Nettoyez le dessus du crâne avec 3% de peroxyde d'hydrogène à trois reprises.
  9. Percez deux trous dans le crâne avec un inversé ronce de taille 34 de cône ou d'un foret de coupe de gravure de 1,6 mm à accepter 00-90 vis (0,0625 à. Long). Les vis assurer la connexion électrique de masse. Placer un trou en face du bregma, et l'autre en face de Lambda, à gauche de la ligne médiane lorsque le conditionnement droit oeil. Placer une vis dans chaque trou. Abaissez la vis 0,28 mm dans le crâne pour chaque tour complet; deux tours complets est suffisant.
  10. Créer plusieurs petites mottes de gazon d'environ 0,75 mm de diamètre sur le crâne afin d'augmenter la surface et la force de préhension pour le ciment.
  11. Prenez le casque rempli et enrouler le fil de terre dans une configuration en forme de huit autour des deux vis. Laissez un peu de mou (~ 1,5 cm entre le casque et la vis) dans le fil de terre de sorte que le casque peut être positionné correctement plus tard.
    Note: Le chiffre huit assure habituellement une bonne connexion électrique entre le fil et les vis de terre. Le fil peut également être soudée à la vis pour assurer une connexion électrique.
  12. Appliquer le ciment adhésif de collage. Suivez les instructions du fabricant pour mélanger l'adhésif ciment de scellement ou mélanger 4 boules de L-Powder mélange, 8 gouttes de la base, et 2 gouttes de catalyseur dans un plat de mélange céramique à froid (assurer la bande de température on le plat de mélange est complètement noir.) La température froide prolonge le temps de travail du ciment.
    1. Enduire le crâne et les vis libéralement avec le ciment de scellement et laisser le ciment sécher. Cela ne devrait prendre que quelques minutes.
  13. Après que le ciment a séché, positionner verticalement l'élément de tête, avec les broches debout, au-dessus du crâne. Tenir le casque en place avec un support similaire au connecteur
    Remarque: Voir "3. Montage du connecteur" -Le titulaire doit seulement être une bande de cinq trous avec des prises plaquées or afin de recevoir les broches de la têtière. Le support est fixé à un bras sur le cadre stéréotaxique. L'utilisation du support et du bras facilite le positionnement de l'embout supérieur et les fils.
  14. Après la têtière a été positionné, peler la peau autour de la zone périorbitaire et positionner les deux fils de choc pour permettre aux 0,2 cm extrémité dénudée pour se reposer sous la peau et d'environ 2-4 mm directement caudale à l'eye. Ne pas laisser les extrémités des deux fils se touchent mutuellement. Placez les deux fils EMG sur la musculeuse orbiculaire au-dessus de l'orbite.
    1. Si nécessaire, couper les extrémités des fils si elles sont trop longues et semblent comme si elles peuvent directement rayer l'orbite et entraîner une infection. Si couper les extrémités du fil, assurez-vous qu'il ya assez de fil nu exposé. Par ailleurs, si les fils semblent trop long, plier le fil de retour à la base, où ils étendent de la têtière.
    2. Sceller la base des fils (ie, la fin près de la têtière) en place sur le crâne avec un petit écart de l'adhésif ciment de scellement et laisser sécher (utiliser la moitié de la partie décrite plus haut).
  15. Retirez les micro clips et incorporer délicatement les volets de la peau en arrière sur le ciment. Laissez la peau de régler naturellement à éviter les tensions sur toute partie de la peau afin d'éviter toute distorsion de la paupière, de la prévention de la réponse eyeblink,et la détresse de l'animal.
  16. Sceller la zone exposée avec du ciment dentaire, couvrant tout de la peau incisée sur le bord de la partie supérieure de la coiffe avec du ciment. Prendre des précautions supplémentaires pour éviter dégoulinant de ciment sur les yeux ou les broches de la têtière. Partiellement ciment durci peut être lissée et manipulé avec un coton-tige qui est humidifié avec un solvant de ciment dentaire. Laisser le ciment sécher complètement avant de retirer le support de têtière.
  17. Permettre à l'animal de se remettre de l'anesthésie sur une surface chauffée avant de remplacer l'animal dans sa cage. Administrer Metacam (1 mg / kg, SQ), puis placer l'animal dans sa cage.
  18. Laisser l'animal 5-7 jours de récupération avant l'essai ou de formation. Maintenir les soins post-opératoires standard pour l'animal selon les directives de votre institution. L'animal doit être vérifié au moins une fois par jour après qu'il a récupéré de la chirurgie. Surveillez les signes de mauvaise alimentation et / ou de boire et de comportement apathique. Si la douleurest soupçonné, fournir Metacam toutes les 24 heures (même dose à la fin du post-chirurgie) jusqu'à atténué. Lidocaïne peut être appliqué localement sur la plaie si l'animal se gratte ou montre des signes d'inconfort.

6. Mise en place de la souris sur le cylindre et la formation (Figure 2G)

  1. Pour placer la souris sur le cylindre, retenir la souris avec une main brièvement en le tenant par la queue avec une main, puis saisir la souris derrière les épaules avec l'index et le pouce de l'autre. Envelopper les autres doigts autour de l'abdomen et le torse de la souris.
  2. Avec la main ne retenant la souris, branchez le connecteur du casque sur la tête de la souris et tourner la vis de blocage.
  3. Placez la souris doucement sur le cylindre et le maintenir en place pendant que la fixation du connecteur sur le châssis. Utiliser les deux vis pour fixer le connecteur sur les barres au-dessus du cylindre.
  4. Une fois que le connecteur a été fixé sur le châssis de cylindre, release l'emprise de la souris. Donnez la souris une journée de deux sessions de habituation au cylindre. Permettre à chaque session d'habituation la même durée que chaque session de conditionnement.
    1. Enregistrement fréquence de clignotement spontanée au cours de l'habituation et pré-exposer la souris à la vibration des moustaches CS afin de minimiser l'apparition de réponses effarouchées. Appliquer le CS comme lors d'une séance réelle de conditionnement, mais sans le choc électrique US.
    2. Appliquer la stimulation des moustaches CS en plaçant la fin du système de Piezo (environ 0,5 cm) sur le côté conditionné (du côté droit) de la souris, tout en glissant les dents du peigne sur les moustaches individuelles. Assurez-vous que les mêmes moustaches sont stimulées au jour le jour en plaçant le système Piezo dans la même position de jour en jour.
  5. Commencez la formation de la souris sur le conditionnement classique. Livrer deux sessions de formation par jour pendant cinq jours. Laissez environ deux heures entre chaque session de formation.
    1. Pour le groupe conditionné, épiceriever trente essais par session d'une 250 msec longue vibration whisker CS (60 Hz) couplé à une 100 msec longue impulsion électrique US (0,3 mA - 3 mA, livrés à partir d'un WPI A385R stimulus isolateur). Séparez le CS et les Etats - Unis avec un msec long intervalle de trace 250 sans stimulus pour rendre la tâche dépendante de l'hippocampe (figure 1) 23.
    2. Réglez l'intensité du choc électrique pour chaque animal de telle sorte qu'un clin est évoqué. Des essais distincts avec un intervalle intertrial aléatoire de 30-60 sec (moyenne de 45 secondes, la durée totale de 30 minutes par session.)
    3. Livrer trente apparié CS seul et essais seuls américains chacune (pour un total de soixante essais) au groupe pseudoconditioned, en utilisant les mêmes paramètres de stimulus comme indiqué pour le groupe conditionné. Veiller à ce que le CS seul et essais américains seuls sont pseudorandomized de telle sorte que l'absence de stimulus est présenté plus de deux fois de suite. Séparer chaque essai avec un intervalle intertrial moyenne de 22,5 sec.
  6. debruit de fond du foie à 65 dB tout au long de l'habituation et de formation afin de masquer le bruit de la vibration générée par le stimulateur de moustache.

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Representative Results

8-10 semaine vieille souris mâles C57BL6 / J ont été formés sur la trace eyeblink conditionné sur l'appareil de tapis roulant tête cylindrique fixe. 8 souris ont été formés avec des présentations appariés CS-US (groupe conditionné) et 9 souris ont été formés avec des présentations non appariés CS et américains (groupe pseudoconditioned).

Exemple enregistrements EMG d'une réponse conditionnée à partir d' une souris conditionné sont représentés sur les figures 3 et 4. Enregistrements EMG pour chaque essai ont été corrigées et intégrées avec un msec constante de 10 temps. La figure 5 montre l'rectifiées et intégrés traces de réponse EMG moyenne dans tous les essais pour chacune des 10 sessions à la fois pour un conditionné (A) et un (B) de la souris pseudoconditioned. L'évolution des réponses conditionnées peut être vu sur la figure 5A, les réponses deviennent plus grandes rapprocher de l'apparition des Etats - Unis. Cette évolution est pas i vun les réponses de la figure 5B pseudoconditioned.

L'évolution du bien-chronométré, et les réponses conditionnées ainsi, bien apprises peut aussi être vu dans la figure 6. La figure 6 montre les histogrammes de l'époque à la pointe de la réponse suivante CS apparition. Il y a un pic initial dans le graphique entre 0 - 150 ms après CS apparition. Ce pic initial peut être vu dès en session 1. Avec plus de sessions de formation, il est le développement d'un second pic dans le graphique entre 400-500 msec chez les animaux conditionnés, indiquant le développement de réponses conditionnées mieux chronométrés.

La figure 7A montre les réponses adaptatives conditionné pour cent moyennes enregistrées chez des souris conditionnées et pseudoconditioned. les réponses adaptatives conditionnés sont considérés comme ayant une activité significative qui est présente au moins 20 msec befminerai US début (ie, au moins 4 SD supérieures à l'activité moyenne actuelle de 250 msec avant CS apparition). Au cours des sessions de formation, des souris conditionné a montré l' apprentissage progressif du paradigme de conditionnement en présentant des réponses adaptatives plus conditionnés à chaque session de formation afin que les souris conditionné présentait significativement plus adaptative conditionné réponses que les souris pseudoconditioned (groupes, F (1,15) = 20,62, p <.0005; sessions, F (1,9) = 9,987, p <0,0001; groupes * sessions, F (1,9) = 5,977, p <0,0001). Notez que le groupe pseudoconditioned typiquement exposé CRs pseudo moins de 20% des essais.

La figure 7B montre la zone moyenne conditionné de réponse (aire sous la courbe de la réponse EMG redressé et intégré) pour les deux souris climatisées et pseudoconditioned au cours des sessions de formation de dix. Les comparaisons planifiées avec une ANOVA à mesures répétées sur la last quatre sessions (c. -à- sessions 7-10, une fois que le groupe conditionné avait atteint un critère d'apprentissage de 60% ​​CR) montrent un effet principal significatif du groupe, ce qui indique que la zone CR était plus grande dans le groupe conditionné que dans pseudoconditioned poste de groupe d' apprentissage critère (groupes, F (1,14) = 5,733, p <.05; session, F (1,3) = 0,486, ns, les groupes * session, F (1,3) = 0,432, ns).

Figure 7C montre les moyenne pour cent alpha (effarouchées) réponses enregistrées à partir des souris conditionnées et pseudoconditioned. réponses alpha sont une activité à moins de 50 ms de CS début qui étaient au moins 4SD ci-dessus l'activité initiale moyenne. Au cours des sessions de formation, de la climatisation et pseudoconditioned souris généralement exposées réponses alpha sur moins de 25% des essais, sans différence significative entre les souris conditionnées et pseudoconditioned (groupes, F (1,15) = 2,502, ns). the mesures répétées ANOVA ont toutefois révélé une interaction significative des groupes et des sessions en raison de la diminution des réponses pseudoconditioned et le maintien des réponses alpha à ​​environ 25% pour les souris conditionné (groupes * sessions, F (1,9) = 2.074, p <0,05). L'augmentation des réponses alpha lors de la session 10 est probablement dû à la latence d'apparition courte du CR bien développé.

La figure 7D montre la réponse courte latence moyenne pour cent enregistré à partir des deux groupes de souris. réponses de latence court reflètent l'activité entre 50-70 ms suivant CS apparition qui était 4SD ci-dessus l'activité initiale moyenne. A des mesures répétées ANOVA ont révélé que les animaux conditionnés présentaient des réponses de latence plus court que les animaux pseudoconditioned au cours des dix séances de formation (groupes, F (1,15) = 5,377, p <.05; session, F (1,9) = 3,920, p <.0005, les groupes * session, F (1,9) = 3,158, p <.005). Tson peut refléter un temps de déclenchement précoce de la CR, en tant que groupe conditionné présentait les grandes CRs à chaque session de formation.

Figure 1
Figure 1:. La Trace eyeblink Conditioning Paradigm Dans trace eyeblink conditionné, un stimulus conditionné inoffensif (CS) est associé à un stimulus inconditionné légèrement nocif (US) destiné à induire une réponse eyeblink. Le CS et des États - Unis sont séparés par un intervalle temporel libre stimulus, ce qui rend le paradigme dépendante de l' hippocampe 23. Dans le paradigme décrit ici, 250 msec vibration longue moustache CS est jumelé à un 100 msec à long périorbitaire choc US. Le CS et des États - Unis sont séparés par un 250 msec long intervalle temporel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2:. Le chef-fixe Préparation A, Le set-up tête fixe pour le conditionnement eyeblink avec le cylindre, le stimulateur de moustache, et le connecteur indiqué B, Le stimulateur de moustache avec l'actionneur et un peigne à deux couches de flexion indiqué.. C, le connecteur avec les différentes parties indiquées: la vis de blocage, la bande 7 trous, les fils soudés aux prises et époxy pour préserver les fils, les ailes converties à partir d' un TO-220 transistor de style D, la têtière avec l'individu. pièces indiquées: la bande 7 trous, les broches et les fils soudés dans les broches, y compris le fil de terre en acier inoxydable non revêtu, et le choc individuel et EMG fils en acier inoxydable, avec 0,2 cm de revêtement de polyimide dépouillé de l'extrémité E. la configuration pour chaque trou dans la bande de 7 trous à la fois le connecteur et letêtière. F, Une souris avec un casque implanté chirurgicalement. G, A la souris est placé sur le cylindre, prêt à être formé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Exemple EMG enregistrement Les lignes bleues délimitent la présentation CS (250 msec long). Les lignes rouges délimitent la présentation des États-Unis, ce qui montre l'artefact qui vient du choc électrique (100 msec). Le CS et des États-Unis sont séparés par un intervalle libre de stimulus-250 msec. Dans cet intervalle sans stimulus est l' activité EMG de plus grande amplitude ( par rapport à la ligne de base) qui délimite un CR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ A>

Figure 4
Figure 4:. Exemple EMG et les enregistrements correspondants de réflexion optiques à infrarouge L'enregistrement EMG est tout aussi précis que le capteur optique infrarouge de réflexion pour détecter l' apparition conditionné de réponse (ligne bleue), la latence maximale de réponse (ligne rouge), et eyeblink inconditionnée réponse apparition ( ligne rose). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Averaged Traces eyeblink Les moyennes corrigées et des traces intégrées de la réponse eyeblink pour une souris conditionné (A) et une souris pseudoconditioned (B). Chaque trace représente la moyenneréponse de la souris pour tous les essais sur une seule session. La section bleue représente la réponse lors de la vibration des moustaches présentation CS. La section rouge représente la réponse pendant l'intervalle de trace sans stimulus. En A, le choc US induit un artefact qui est présent au cours de la zone gris foncé après l'intervalle de trace. B montre les réponses à la vibration des moustaches CS seulement. Présentation de CS seul et américains essais seulement ont été pseudorandomized dans pseudoconditioning. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
. Figure 6: histogrammes de la réponse Heures de pointe histogrammes du temps au pic de réponse pour toutes climatisées (n = 8; barres bleues) et 8 pseudoconditioned (barres rouges) les animaux pour tous les trEIAA à travers toutes les sessions (données d'une souris pseudoconditioned a été exclu pour permettre une comparaison directe du nombre de réponses entre les groupes). barres pourpres indiquent où les animaux conditionnés et pseudoconditioned se chevauchent. Les heures de pointe de réponse sont calculés comme le temps du plus grand pic de l'enregistrement EMG redressé et intégré entre CS et US début. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Courbes de réponse des animaux conditionnés (n = 8; courbes bleues) et les animaux pseudoconditioned (n = 9; courbes rouges). A, Pourcentage Averaged Réponses Adaptive Conditionné (± SEM) pour les animaux conditionnés et pseudoconditioned plus de 10 sessions de formation. B, zone moyenné (± SEM) de la CR pour conditionnéet les animaux C, Pourcentage Averaged Réponse Alpha (± SEM) pour les animaux conditionnés et pseudoconditioned plus de 10 sessions de formation D, Pourcentage Averaged Réponses Latence courte (± SEM) pour conditionné pseudoconditioned plus de 10 sessions de formation.. et pseudoconditioned plus de 10 sessions. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Classique eyeblink conditionné est une forme d'apprentissage associatif qui est un outil utile pour comprendre les substrats neuronaux sous-jacents apprentissage et la mémoire. Les méthodes précédentes utilisées pour le conditionnement eyeblink chez les rongeurs tels que les souris impliqués une chambre qui a permis à l'animal de se déplacer librement. Une préparation de tête fixe pour le conditionnement eyeblink chez la souris, en utilisant l'appareil décrit par Chettih et al. Et Heiney et al. , Et plus récemment utilisés dans la lumière évoquée trace eyeblink conditionné dans Siegel et al. Offre plusieurs avantages, comme la possibilité pour certains des procédures et des expériences à réaliser pendant le conditionnement eyeblink qui n'a pas pu ou a été limitée dans le passé (par exemple, in vivo à deux photons imagerie calcique) 14-16. Ce type de préparation facilite également l'utilisation d'autres techniques telles que l' électrophysiologie in vivo avec des matrices tétrode. Comme les souris semblent devenir DistreSSED de retenue, cette préparation de la tête-fixe a été développé pour garder la tête sécurisée tout en réduisant le montant de la retenue nécessaire. Bien que cette préparation permet à des souris ambulate sur un tapis roulant cylindrique, d' autres ont également réussi à recueillir des données comportementales de souris de tête fixée sur une plate - forme stable 24.

Il y a, cependant, certaines questions qui se posent à l'utilisation du système de culasse fixe. Une préoccupation est que lorsque l'on place d'abord une souris sans formation sur le cylindre, il peut avoir besoin de temps pour apprendre à se reposer, marcher ou courir sur le nouvel appareil. La plupart des souris apprennent rapidement à se reposer, marcher ou de courir sur le cylindre confortablement. Deux séances d'habituation aident à accoutumer les souris à cylindre et par le milieu de la deuxième session, la plupart des souris sont confortables sur le cylindre. Une autre préoccupation qui se pose est headpiece avulsion. Il y a eu un problème avec cela dans le passé au cours des sessions de formation d'une journée à plusieurs, mais l'utilisation de l'adhésif luting cestion a amélioré les problèmes avec têtière avulsion. L'utilisation du ciment colle de scellement a donné lieu à 0% headpiece arrachements de plus de 50 chirurgies puisque l'utilisation de cette technique. Avec une utilisation correcte et la propagation suffisante du ciment sur le crâne, les chercheurs devraient rencontrer aucun problème avec têtière avulsion. Enfin, en présentant le CS au cours des séances d'habituation, il peut y avoir une certaine inquiétude à propos de l'inhibition latente. Il est clair, cependant, que les souris ont été conditionnés avec succès (voir Figure 7). A noter que l'intensité de la vibration de whiskers peut être modifiée en changeant la quantité de tension étant transmis par le rhéostat. Si les souris sont incapables d'apprendre, la tension peut être augmentée pour soutenir conditionné succès tout en minimisant les réponses effarouchées. Les chercheurs peuvent également modifier le type de choc électrique US qui est livré à l'animal. Le choc électrique US peut être une seule impulsion électrique durable 100 msec comme indiqué ici. En variante, comme the stimulus isolateur utilisé dans ce protocole est capable de transmettre des impulsions biphasiques, les chercheurs peuvent également utiliser 120 Hz 6 paires d'impulsions biphasiques à 1 ms par impulsion pour un choc électrique efficace des États-Unis aussi bien.

Boele et al. Indique la probabilité que certains "conditionnés réponses" peuvent provenir de saisissement (alpha) réponses à la CS ou des réponses de latence courte (SLR) 25. Réponses alpha sont considérées comme des fermetures rapides des paupières dans un temps de latence de 50 ms après l'apparition de CS. Les souris gardent souvent les yeux fermés pendant toute la durée du procès, à la suite de cette réponse alpha. SLRs, d'autre part, ont une latence de 50-70 msec de CS apparition et surviennent généralement après seulement quelques paires CS-américaines. Le court temps de latence à l'apparition des deux alpha et SLRs et le fait que les reflex peuvent survenir après seulement quelques paires CS-américains indiquent qu'ils sont probablement pas entraînés par le circuit de hippocampique-cérébelleuse. Ces observations examinées par Boele et al. Therefore mendier la question de savoir si les CRs enregistrées ici sont des réponses apprises. Comme la figure 7C et 7D montrent, ni réponses alpha ni SLRs représentent la majorité des CRs enregistrées, ce qui suggère que les CRs adaptatifs sont médiées par le cerveau et le cervelet. Les histogrammes de la figure 6 qui montrent la latence du pic de la réponse eyeblink suivant CS déclenchement indique également que , bien que certains essais peuvent comprendre une alpha apparition précoce ou réponse courte latence, avec plus d' essais d'entraînement, le pic de la réponse eyeblink se fait plus tard et plus proche de l'apparition des États-Unis, indiquant le développement de réponses conditionnées au bon moment. Comme mentionné précédemment, la stimulation de la moustache et de l'intensité de choc ont été atténués à un niveau qui n'a pas été surprenant ou trop aversif, mais il est resté efficace pour produire des réponses adaptatives conditionné. Enfin, comme la figure 7B montre la taille de la CR (mesurée comme étant la zone située sous lala courbe de la réponse redressée et intégrée, comme sur la figure 5) est plus grande dans le groupe de la climatisation que dans le groupe pseudoconditioned une fois que le groupe conditionné a atteint un critère d'apprentissage de 60%, ce qui signifie que ces réactions nécessitent plusieurs séances pour apprendre, à la différence des reflex et d' alpha réponses.

Boele et al. A également souligné que les mesures d' EMG, alors une méthode précise de détection des clignements dans les grands animaux tels que les lapins, ne sont pas aussi pratique chez les petits rongeurs tels que les souris 25. Ils recommandent l'utilisation de la technique de mesure de distance magnétique (MDMT) pour éviter la détection de faux signaux positifs que l'enregistrement EMG peut indiquer. La technique de MDMT, tout en impressionnant dans sa sensibilité et la qualité de la détection de clignement, présente également l'inconvénient d'avoir à anesthésier l'animal chaque jour de la formation afin de fixer la puce 26. Cela en soi peut confondre les taux d'apprentissage. Nous constatons que les signaux EMGenregistré avec les procédures décrites ici sont facilement obtenu, de haute résolution temporelle, fiable et relativement facile à mesurer et à analyser.

La figure 4 montre un signal de détection représentatif d' EMG clignote avec un signal correspondant provenant d' un capteur optique réfléchissant infrarouge placée à proximité de l'oeil de la souris pendant l' entraînement. Il existe une corrélation claire détection des clignements entre le signal EMG et le capteur optique, indiquant la précision de la détection de clignotement en utilisant des enregistrements EMG. Un avantage des enregistrements EMG est qu'il permet à la plus grande résolution temporelle. Bien que la résolution est dégradée par l'intégration sur une msec constante de 10 temps, on peut également analyser les données brutes EMG pour détecter l'activité de clignotement des yeux. Le nombre de pointes est un paramètre qui peut être utilisé pour détecter CR 18. Un inconvénient avec des enregistrements EMG est que les signaux seront sans doute contaminés par l'artefact électrique provenant du choc électrique américain (voir savoir celles qui se produisent avant l'apparition des États - Unis. Un autre inconvénient en utilisant des enregistrements EMG est que, en utilisant le critère actuel pour la détection CR, une ligne de base bruyante peut cacher ce qui peut par ailleurs été détecté comme un CR.

La préparation de la tête fixe décrit ici est similaire à celui présenté par Heiney et al. 15 Il y a, cependant, certaines différences notables de leur système élégant. Par exemple, la méthode décrite ici pour l'enregistrement des réponses eyeblink sont des fils placés subdermally dessus de l'œil pour enregistrer l'activité EMG. Cette technique permet des enregistrements stables et fiables de l'activité de la paupière et, par conséquent, de la réponse eyeblink. Le positionnement correct et la fixation de ces fils assure des enregistrements de qualité qui durent pendant au moins deux semaines, la durée de l'expérience. L'avantage d'utiliser des fils EMG plutôt que d'une hautecaméra -speed comme utilisé par Heiney et al. est que les enregistrements EMG ont une résolution temporelle extrêmement élevée, et ne nécessitent pas le positionnement quotidien et d' étalonnage qu'une caméra nécessite 15. L'appareil photo n'offre cependant la détermination visuelle directe de la fermeture des paupières.

Une autre différence entre les deux systèmes est le mode de fourniture de CS. Cette préparation de la souris sur la tête fixe particulière utilise la stimulation whisker comme stimulus conditionné. Les résultats montrent que les souris peuvent être conditionnés de manière efficace avec une stimulation trichite comme CS, comme des lapins de tête fixe peuvent être conditionnées avec les trichites de vibrations 27. Heiney et al. A démontré la stimulation de la plaquette de moustaches comme un CS efficace en dirigeant une bouffée faible de l' air à la plage de whisker 15. Bien que les deux techniques montrent conditionnement efficace, en plaçant un peigne sur des whiskers choisis et faire vibrer le peigne permet la capacité de stimuler whiske individuelr rangées ou même des moustaches individuelles. Cette technique a été utilisée dans des études précédentes pour permettre aux animaux de servir de leur propre contrôle (ie, la ligne de whisker stimulée a été comparée à une rangée de moustaches non stimulées) 20.

En résumé, une préparation de tête fixe pour whisker de signalisation eyeblink conditionné permet une plate-forme crânienne sécurisée pour effectuer des techniques de pointe et d'expérimentation qui avait été auparavant impossible ou difficile à réaliser. la stimulation de la moustache légère a été utilisée comme stimulus conditionné et un léger choc électrique a été utilisé comme le stimulus inconditionné. réponses eyeblink ont ​​été enregistrées avec des fils placés subdermally derrière la paupière. l'apprentissage fiable a été démontrée chez la souris avec une stimulation directe de whiskers choisis comme le CS et le choc électrique périorbitaire que les Etats-Unis, et pas d'apprentissage était évident chez les souris qui ont reçu des présentations aléatoires du CS et aux États-Unis. Les enregistrements EMG ont fourni un fiable et reltivement méthode simple pour enregistrer les réponses eyeblink et en observant comment les réponses ont changé à travers des sessions de formation.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le ministère de la Défense (W81XWH-13-01-0243) et les National Institutes of Health (R37 AG008796). Nous remercions Alan Baker dans la boutique de la machine de la Northwestern University pour la construction de l'appareil de culasse fixe. Nous remercions le Dr Shoai Hattori pour ses conseils en MATLAB et Solidworks. Nous remercions le Dr John Power pour le logiciel LabView qui contrôlait l'expérience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"  Amazon B002ONUM0E For cylinder
Plexiglas Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter) Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long) Amazon Supply B00F33Q8QO For cylinder
Classic Design Hair Comb Conair 93505WG-320 For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator Piezo Systems T220-A4-303X  For whisker stimulation
Solder and Flux Kit Piezo Systems MSF-003-NI For whisker stimulation
Magnetic Base Thor Labs MB175 For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor Amazon Supply B0002ZPZYO  For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets Electronic Connector Corp. 220-S02 For connector
Relia-Tac Pins Electronic Connector Corp. 220-P02 For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) Amazon Supply B000FN68EE Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) Amazon Supply B000N2TK7Y Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid Loctite 1365896 Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy Ace Hardware 18613 For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) PlasticsOne 005sw/2.0 37365 S-S  For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) AM Systems 792800 For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer Tenma 72-110 For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier A-M Systems 1700 Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator World Precision Instruments 31405 For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein: Animal Health 50031 For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc NDC 12496-0757-1 For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment  Akorn NDC 17478-062-35 Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads PDI NDC 10819-3883-1 For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) Integra Miltex  4-7. For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades Integra Miltex 4-310 or 4-315 For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip Roboz RS-5459 For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) Amazon Supply B002SG89X4  For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool Walnut Hollow 29637 Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr Roboz RS-6282C-34 Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit Dremel 106 Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base Parkell S398 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder Parkell S399 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml Parkell S371 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip Parkell S387 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5 World Precision Instruments 504506 For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators VWR International 10806-005  For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit Dentsply 675570 For surgery; dental cement

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References

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