Emulsiones agua en aceite: Un nuevo sistema para el ensamblaje de las proteínas de unión de clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrófobos

Chemistry
 

Summary

Este manuscrito describe un método simple y de alto rendimiento para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos que se basa en las emulsiones de agua-en-aceite. Se demuestra la eficacia del método en el montaje de las clorofilas nativas con cuatro variantes de soluble en agua-clorofila recombinante de unión a proteínas (WSCPs) de las plantas de Brassica expresan en E. coli.

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Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

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Abstract

Clorofilas (Chls) y bacterioclorofilas (Bchls) son los co-factores principales que llevan a cabo la recolección de luz fotosintética y de transporte de electrones. Su funcionalidad depende críticamente de su organización específica dentro de los complejos de proteínas de múltiples subunidades transmembrana grandes y elaborados. A fin de comprender a nivel molecular cómo estos complejos facilitan la conversión de energía solar, es esencial para comprender la proteína de pigmento, y las interacciones de pigmento en pigmentos, y su efecto sobre la dinámica excitados. Una forma de obtener este entendimiento es mediante la construcción y el estudio de complejos de Chls con proteínas recombinantes simples solubles en agua. Sin embargo, la incorporación de los Chls lipófilos y Bchls en proteínas solubles en agua es difícil. Por otra parte, no existe un método general, que podría ser utilizado para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos. Aquí, demostramos un sistema simple y rendimiento alto a base de emulsiones de agua en aceite, que permite culoembly de las proteínas solubles en agua con Chls hidrófobos. El nuevo método fue validado mediante el ensamblaje de las versiones recombinantes de la proteína de unión a la clorofila soluble en agua de plantas Brassicaceae (PCSW) con Chl a. Demostramos el montaje exitoso de Chl a utilizando lisados ​​crudos de E. expresan PCSW células coli, que puede utilizarse para el desarrollo de un sistema de pantalla genética para nuevas proteínas de unión a Chl solubles en agua, y para el estudio de interacciones proteína-Chl y procesos de montaje.

Introduction

pigmentos hidrófobos tales como las clorofilas (Chls), bacterioclorofilas (Bchls) y los carotenoides son los cofactores primarios en los centros de reacción fotosintéticos y proteínas de recolección de luz que llevan a cabo el transporte de electrones, y la captura de energía de la luz y la transferencia. Los centros de reacción y la mayor parte de los complejos de recolección de luz Chl-de unión son proteínas transmembrana. La proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de la bacteria fotosintética verde-azufre no oxigénica 1,2, y la proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados 3 son ejemplos excepcionales de proteínas solubles en agua captadores de luz. La unión de clorofila proteínas solubles en agua (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae y plantas Amaranthaceae 4, 5 son otro ejemplo único, sin embargo, en contraste con FMO y el PCP, éstos no son ni involucrarse en recolección de luz ni en ninguna de la reacción fotosintética primaria y su grafía precisasiological funciones todavía no están claros 5-8. Su alta afinidad de unión a Chl han dado lugar a una función sugerido como portadores transitorios de Chls y derivados de Chl 9,10. Alternativamente, se planteó la hipótesis de que PCSW juega un papel en los basureros Chls en las células dañadas y protege contra el daño foto-oxidativa inducida por Chl 7,11-13. Más recientemente, se sugirió que las funciones PCSW como un inhibidor de la proteasa y desempeña un papel en la resistencia herbívoro, así regula la muerte celular durante el desarrollo de la flor 14. WSCPs se dividen en dos clases principales de acuerdo con sus propiedades fotofísicas. La primera clase (clase I, por ejemplo. De Chenopodium album) puede someterse a fotoconversión tras la iluminación. WSCPs Clase II de las plantas del género Brassica, que no sean objeto de fotoconversión 5,10, se subdividen en la clase IIa (por ejemplo., De Brassica oleracea, Raphanus sativus) y IIb (por ejemplo., De Lepidium virginicum Lepidium virginicum fue resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,0 Å 8. Revela un homotetrámero simétrica en la que las subunidades de la proteína forman un núcleo hidrófobo. Cada subunidad se une una sola Chl que se traduce en una disposición apretada de cuatro Chls estrechamente empaquetados dentro de los core.This sencilla todo disposición Chl hace WSCPs un sistema modelo potencialmente útil para el estudio de unión y ensamblaje de complejos Chl-proteína, y los efectos de la vecina Chls y entornos de proteínas en las propiedades espectrales y electrónicas de Chls individuales. Además, se puede proporcionar plantillas para la construcción de proteínas de unión a Chl artificiales que pueden ser utilizados para los módulos de captación de luz en dispositivos fotosintéticos artificiales.

Estudios rigurosos de WSCPs nativos no son factibles debido a que los complejos purificados de plantas siempre contienen una mezcla heterogénea de tetrámeros con diferentes combinaciones de Chl ay Chl b 9. Por lo tanto, se requiere un método para el montaje de WSCPs expresadas de forma recombinante con Chls in vitro. Este es desafiada por la insignificante solubilidad en agua de Chls que hace imposible ensamblar el complejo in vitro mezclando simplemente las apoproteínas solubles en agua con pigmentos en soluciones acuosas. Ensamblaje in vitro mediante la mezcla de las apoproteínas con membranas tilacoides 15 se demostró, pero este método se limita a la nativa Chls presente en los tilacoides. Schmidt et al. informaron sobre el montaje de varios derivados de Chl y BChl con PCSW de la coliflor (CaWSCP) mediante la expresión de una proteína recombinante marcado con histidina en E. coli inmovilizándolo en una columna de Ni-afinidad y la introducción de derivados de Chl solubilizan en detergentes 11. Con éxito la reconstitución de WSCPs recombinantes a partir de A. 6 thaliana, y las coles de Bruselas (BoWSCP), rábano japonés salvaje (RshWSCP) unaTambién se informó d Virginia pepperweed (LvWSCP) por un método similar.

A continuación, presentamos una novela, método general y directa para el montaje de Chls con PCSW que no requiere etiquetado o la inmovilización de las proteínas. Se basa en la preparación de emulsiones de sus soluciones acuosas de los apoproteínas solubles en agua en aceite mineral. Las proteínas se encapsulan por lo tanto en agua-en-aceite (W / O) microgotas con muy alta relación de superficie a volumen 16. Los cofactores hidrofóbicos se disuelven en el aceite y se introducen fácilmente en las gotitas de la fase de aceite. Se presenta sobre el uso del método para el montaje de varias variantes de apoproteínas PCSW recombinante expresadas en E. coli con Chl a. Se demuestra el conjunto de lisado crudo de bacterias PCSW sobreexpresan que pueden ser utilizados como un sistema de detección para el desarrollo de nuevas proteínas de unión de Chl.

Protocol

1. Preparación de Chl un Colección de Soluciones

  1. Paso crítico: Realizar todos los pasos de la preparación de clorofila en una campana química, bajo la luz verde (520 nm) o en la oscuridad con el fin de minimizar el daño solar. Siempre agregue nitrógeno o argón antes de congelar los pigmentos para el almacenamiento. Asegúrese de que todos los disolventes son de calidad analítica.
  2. Pesar aproximadamente 5 mg de Spirulina platensis células liofilizadas u otras células que contienen sólo cianobacteria Chl a en las membranas tilacoides y aplastar usando un mortero y una mano de mortero.
  3. Cargar las células trituradas en una columna de vidrio y se lava con aproximadamente 50 a 100 ml de acetona al 100% con el fin de eliminar los carotenoides. Desechar la fracción naranja / verde eluido.
    Nota: Si la fracción de naranja no se eluye con 100 ml de acetona seguir lavando las células con acetona hasta fracción verde empieza a eluir.
  4. Acetona intercambio con metanol al 100% y recoger la fracción verde que contiene clorofila a. El volumen de eluido fraction puede variar entre 50-100 ml. Al principio, la fracción eluida tiene un color verde oscuro, que cambia en color verde pálido al final de la elución. Cuando el color de la fracción eluida se convierte en verde pálido detener la elución.
  5. Se evapora el metanol en el evaporador rotativo hasta que el extracto esté completamente seco. No aplique calor a la solución; asegúrese de que la temperatura del baño de agua del evaporador no supera los 30 ° C.
    Nota: El tiempo de evaporación depende del volumen de la fracción de metanol se evapora y puede variar entre 10 a 60 min. Es importante secar el extracto completo.
  6. Disolver los pigmentos del extracto se seca en un pequeño volumen de éter dietílico (alrededor de 5 a 10 ml), y filtrar a través de lana de algodón. Asegúrese de que los pigmentos se disuelven completamente en éter antes de filtrar.
  7. Se evapora el éter dietílico hasta que los pigmentos estén completamente secas (10-30 min).
    Nota: Los pigmentos secos se pueden purgar con y mantenerse bajo nitrógeno o argón a -20 ° C, en la oscuridad hasta su posterior procesamiento.
  8. Disolver los pigmentos secos en el menor volumen posible de 100% de metanol (alrededor de 1 ml), incluso si no todo está completamente suspendida. Añadir 4 ml de acetona a la solución, y la película de la copa suavemente con el fin de disolver completamente los pigmentos.
  9. Utilizando una pipeta Pasteur, la carga de la muestra con cuidado sobre una columna de DEAE Sepharose equilibrada en 100% de acetona.
  10. carotenoides (eluir una banda de color naranja-amarillo) con acetona al 100%. A continuación, se eluye Chl a (banda verde) con mezcla 3: 1 v / v de acetona / metanol.
    Nota: El volumen de acetona y la mezcla de acetona / metanol es aproximadamente equivalente al volumen de DEAE Sepharose se cargó en la columna.
  11. Verificar Chl una pureza por cromatografía en capa fina utilizando un 68: 25: 5: 2 de diclorometano / n-hexano / isopropanol / metanol (v / v) como eluyente una mezcla 17.
  12. Se evapora el disolvente utilizando un evaporador rotatorio hasta que la Chl a está completamente seco (10-60 min).
    Nota: El Chl seco una se puede purgar con nitrógeno o argón y se almacenó bajo atmósfera de argón a -20 ° C en la oscuridad.
  13. Preparar Chl una solución de stock de volver a disolver el seco Chl a en 2-4 ml de etanol al 100%.
    Nota: El coeficiente de extinción de Chl a en 663 nm es 74.400 cm-1 M-1 (83,3 cm-1 (mg / ml) -1) en etanol. Una solución de reserva típica debe tener un diámetro exterior de 1860 correspondiente a una concentración de 25 mM (23 mg / ml). La adición de 20 l de esta población a una emulsión que contiene 5 ml de la fase orgánica, y 1 mg de PCSW en 1 ml de los resultados de la fase acuosa en una mezcla con un exceso molar de 10 veces de la Chl a vs. PCSW.

2. Preparación de la fase orgánica de la emulsión

Nota: La fase orgánica de la emulsión se compone de aceite mineral que contiene 4,5% (v / v) Span 80, y 0,4% (v / v) de Tween 80.

  1. Pesar en un tubo de 50 ml 0,2 g de tween 80, 1,8 g de Span 80, y 38 g de aceite mineral. Mezclar bien todos los componentes y enfriar en hielo.
    Nota: La fase orgánica se puede almacenar en 4 ° C durante hasta una semana.

3. Preparación de la fase acuosa de la emulsión

Nota: La fase acuosa de la emulsión puede estar compuesta de cualquiera de PCSW purificada o extracto crudo de bacterias que sobreexpresan PCSW.

  1. Preparar una fase acuosa que contiene PCSW purificada.
    1. Crecer bacterias BL21 de E. coli que contiene el plásmido PCSW 12 en 1 l de medio LB a 37 ° C hasta que la DO de desde 0,3 hasta 0,6.
    2. Inducir la expresión de proteína mediante la adición de IPTG 1 mM. Después de la inducción crecer las bacterias a 30 ° C durante 12-16 horas.
    3. Cosecha bacterias por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    4. Disolver el precipitado en tampón de unión y se somete a ultrasonidos en hielo (30 segundos en 15 segundos fuera, cinco veces). Usar 10 ml de tampón para el sedimento obtenido a partir de centrifugación de 250 ml demedio LB con células que sobreexpresan la proteína.
      Nota: Dependiendo del método de purificación, el tampón de unión puede estar compuesta de tampón fosfato 100 mM, pH 7,2 o Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM.
    5. Centrifugar el lisado de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    6. Se purifica mediante cromatografía de afinidad PCSW. Dependiendo de la etiqueta fusionado a PCSW, purificar proteínas recombinantes utilizando el sistema de cromatografía de afinidad comercialmente disponible adecuado para la purificación de proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante.
    7. Para la preparación de la emulsión, utilizar PCSW purificada en tampón fosfato 50 mM, pH 7,8. Asegúrese de que la cantidad final de proteína utilizada para la reconstitución es de 0,5-1,0 mg por 1 ml de tampón.
  2. Preparar una fase acuosa que contiene lisado bacteriano bruto con PCSW.
    1. Se cultivan las células BL21 de E. coli que contienen el plásmido que expresa PCSW en 250 ml de medio LB a 37 ° C hasta que OD desde 0,3 hasta 0,6.
    2. Inducir la expresión de proteína con1 mM de IPTG y hacer crecer las bacterias durante la noche a 30 ° C.
    3. células bacterianas de la cosecha por centrifugación a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    4. Disolver el precipitado en 1 a 2 ml de 50 mM de tampón de fosfato de sodio de pH 7,8, se somete a ultrasonidos (30 seg en, 15 seg apagado, tres veces) y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    5. Preparar la fase acuosa de la emulsión mediante la mezcla de 0.125 ml de sobrenadante con 0,875 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 7,8.

4. Montaje de PCSW con Chl a en Emulsión

  1. Transferencia de 5 ml de la mezcla de aceite-agente tensioactivo en un vial de vidrio y enfriar en hielo. Antes de pipeteado, compruebe que todos los componentes de la fase orgánica se mezclan a fondo y no hay separación de fases entre tensioactivos y aceite mineral.
  2. Añadir 1 ml de fase acuosa enfriada con hielo preparadas como en la sección 3 a 5 ml de fase orgánica.
  3. Mezclar las dos fases utilizando un homogeneizador de tejidos durante 2 minutos a 9500 rpm en hielo.
  4. Paso crítico: A partir de esta etapa, realice todos los pasos siguientes menores de luz verde (520 nm) con el fin de minimizar el daño solar. Añadir 20 l de Chl 25 mM de una solución de reserva (véase la sección 1.13) a la emulsión. Se dispersa con un movimiento rápido e invirtiendo el vial de vidrio. Asegúrese de que la Chl se distribuye uniformemente en la emulsión.
  5. Incubar la emulsión durante 1-2 horas en hielo en la oscuridad.
  6. Con el fin de romper la emulsión y las gotitas de agua separados de la fase orgánica Se transfiere la emulsión a tubos de plástico de 1,5 ml y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Si el conjunto tiene éxito, la fase acuosa inferior debe tener un color verde.
  7. Desechar la fase superior de aceite y añadir 1 ml de aceite mineral. Mezclar bien el aceite mineral con la emulsión sedimentaron por vórtice o volteando el tubo a fondo. Centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Repita este paso hasta que un menisco clara separación de la fase acuosa y la minerafases de aceite al, sin ningún tipo de emulsión intermedia se obtiene.
  8. Realice este paso en una campana química. Después de las fases de aceite y minerales acuosos están claramente separadas, eliminar el aceite mineral y añadir 1 ml de éter dietílico saturado de agua. Vortex y centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces.
  9. Después de la segunda centrifugación, eliminar el éter dietílico y dejar los tubos abiertos de 5-20 minutos en la campana.
  10. Por último, la carga de la fase acuosa que contiene el PCSW / Chl un complejo en una columna de desalado y se eluye con tampón apropiado para experimentos adicionales.
    Nota: La proteína es estable en tampones fosfatos y tris en una amplia gama de pH (6,0 a 7,5). La muestra se puede almacenar a 4 ° C protegido de la luz hasta un mes.

Representative Results

Apoproteínas PCSW recombinantes se montan con Chl a en emulsiones W / O de acuerdo con el protocolo descrito en la sección anterior. El protocolo fue implementado utilizando fases acuosas que contienen ya sea WSCPs puros, o lisados ​​de E. coli que sobreexpresan células PCSW (Figura 1). El protocolo es simple, rápido y no requiere ningún equipo especial excepto un homogeneizador de tejidos.

La absorción y espectros de CD de Chl a complejos de cuatro variantes PCSW recombinantes, a saber RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP y LvWSCP se muestran en la Figura 2. Estos son similares en forma de banda y la posición de los espectros ya se ha informado de los respectivos complejos nativos 10,18, 19. Estos resultados muestran claramente que PCSW / complejos de Chl reconstituidas en el sistema de emulsión W / O se asemeja a los complejos nativos.

E. coli que expresan WSCPs se utilizaron como la fase acuosa de la emulsión. Los lisados ​​de bacterias que no expresan WSCPs se utilizaron como control negativo. Montaje positiva de PCSW con Chl a se observa fácilmente por el color verde de la fase acuosa, pero sólo en lisados ​​de células que expresan PCSW (Figura 3). Gotitas que contienen estos lisados ​​característica distintiva Chl fluorescencia en imágenes de microscopia confocal. Esto implica que el conjunto de éxito de complejos PCSW / Chl se puede detectar directamente en las gotas de agua, que pueden ser la base para los sistemas de detección basados ​​en emulsión W / O.

Figura 1
Figura 1: Montaje de PCSW con Chls en emulsiones W / O (A. de E. coli que expresan PCSW. Cuando la emulsión está preparada, Chls se añaden a la emulsión. Después de la reconstitución, las gotas de agua se separan de la fase orgánica por centrifugación. (B) sistema de emulsión W / O se puede utilizar para la detección rápida y de alta rendimiento para la reconstitución positivo de WSCPs con Chls. La fluorescencia del complejo / Chl PCSW se puede detectar directamente de las microgotas de agua mediante un microscopio confocal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Absorbancia y los espectros de CD de PCSW / Chl a apoproteínas Complejos de cuatro.Variantes PCSW se reconstituyeron con 10 veces el exceso molar de Chl a. Los espectros de absorbancia (a) se normalizaron a 1 a 673nm para BoWSCP (negro), CaWSCP (verde), y RshWSCP (azul) y 663nm para LvWSCP (rojo). Los mismos factores de normalización se aplicaron a la CD (b). Reproducido con permiso de 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Exploración de la microscopía de fluorescencia y Visual Proyección de complejo montaje PCSW / Chl (A) SDS-PAGE de E.. coli BL21 lisados ​​celulares antes y después de la reconstitución con Chl a en las emulsiones W / O. Carril 1: células BL21 sin el plásmido PCSW, carril 2: células BL21 con el pla PCSWsmid sin inducción por IPTG, carril 3: células BL21 con el plásmido PCSW inducida con IPTG. Carril 4, 5 y 6 son las mismas muestras como carriles 1, 2 y 3, respectivamente, pero después de la separación de la fase acuosa de la fase orgánica de la emulsión. Pequeñas partes alícuotas de cada muestra se llevaron a cabo en un gel de SDS-proteína. Carril M: marcador de tamaño de proteína. Imágenes de las muestras antes y después de la separación de fases se muestran en la parte superior de cada carril. (B) Las imágenes de microscopia confocal de W / O gotitas preparados con Chl a en la fase de aceite. Las gotitas en la imagen de la izquierda no contienen ninguna proteína, mientras que los de la imagen de la derecha contenía la proteína PCSW. La fluorescencia se monitorizó a 682 nm. Reproducido con permiso de 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Nuestro objetivo era desarrollar un nuevo sistema general de ensamblaje de las proteínas de unión a la clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrofóbicos. Aquí se demuestra que el nuevo sistema basado en la reconstitución de emulsión W / O es un enfoque general demostrado que funciona para el montaje de apoproteínas PCSW de las coles de Bruselas, coliflor, rábano picante japonés y pepperweed Virginia recombinante expresado en E. coli. Aquí se presentan los resultados de la reconstitución de 1 mg de PCSW con un exceso molar de 10 veces de Chl a. Sin embargo, también es posible utilizar concentraciones más bajas de PCSW para reconstituciones y diferentes relaciones molares / proteína de Chl. La cantidad mínima de la proteína, que hemos sido capaces de reunirse en emulsiones W / O era 100 g, mientras que la relación de pigmento a proteína podría variar de 5: 1 y hasta 20: 1. Además, el volumen de la fase acuosa podría reducirse hasta 50 l. En este trabajo se presenta el conjunto de PCSW con Chl a. Sin embargo, también es posible montarPCSW con otros Chls hidrófobos, Bchls y sus derivados. Actualmente, estamos probando nuestro sistema con otras proteínas de unión pigmentos solubles en agua tales como FMO y el PCP.

A pesar de que nuestro método es rápido y sencillo, hay algunos pasos críticos, que deben tenerse en cuenta durante la preparación de E / S y W reconstitución de PCSW con Chl. Los viales de vidrio, que se utilizan para la preparación de la emulsión, necesitan estar limpia y libre de detergente. Incluso pequeñas trazas de detergentes en viales afectarán a la preparación de la emulsión y resultar en una baja calidad de la emulsión. Además, los viales deben estar completamente secos. Otro paso crítico, lo que podría influir en la eficacia de reconstitución, es bien dispersión de Chl en la fase orgánica de la emulsión. Por lo tanto, es importante mezclar completamente un pequeño volumen de Chl en 5 ml de emulsión. También es importante hacer tantos pasos como sea necesario para romper la emulsión y eliminar completamente el aceite mineral de la fase de agua. Cualquier rastro de aceite mineral en agua pHase podría influir en otros experimentos.

Emulsión W / O es un enfoque alternativo para el método establecido por Schmidt et al. 11, que se basa en la inmovilización de PCSW marcada con His en la columna de cromatografía de afinidad e incubando con Chls. Aunque, el método de Schmidt et al., Ha demostrado funcionar para diferentes WSCPs, se requiere de proteínas con cola de histidina y puede resultar en la unión no específica de Chls por ligación a las histidinas de la etiqueta. Por otra parte, la inmovilización de proteínas sobre una superficie sólida puede influir en la estructura de proteínas, influyendo así en el proceso de montaje con pigmentos. Además, Chl, que fue utilizado para el montaje de WSCPs en este sistema se disolvió ya sea en tampón que contiene detergentes o 40% 11,12 metanol. Tales disolventes pueden dar lugar a la agregación de pigmento y / o no específica Chl unión a PCSW. Nuestro nuevo sistema de reconstitución basado en emulsión W / O no se basa en la inmovilización de las proteínas a un soporte sólido. Therefore, no se requiere etiqueta de purificación fusionado a WSCPs, y las proteínas recombinantes con secuencia nativa puede ser montado. Otra ventaja importante del método W / O es reducir al mínimo la agregación de pigmentos que pueden influir en la eficacia de la reconstitución, la oligomerización y la estequiometría de pigmento / proteína. Esto es porque los pigmentos hidrofóbicos se disuelven en la fase de aceite y su introducción en las gotitas de W / O está activado por la alta relación de superficie a volumen de este último. Además, la unión inespecífica de Chls por PCSW se elude desde pigmentos hidrófobos no pueden difundirse entre las fases orgánica y acuosa de la emulsión. Sólo pigmentos que se ensamblan de forma activa por PCSW durante la reconstitución pueden entrar en las microgotas de agua de la emulsión.

El método de montaje de PCSW con pigmentos mezclando PCSW con tilacoides aisladas 10 es similar al sistema de emulsión W / O se presenta aquí. Se requiere detergentes o disolventes orgánicos para el solubilizing los Chls, ni el etiquetado de las proteínas. Sin embargo, el método W / O se puede utilizar con cualquier pigmento que es soluble en la fase oleosa mientras que el método anterior está limitado a Chls que son de forma nativa presente en las membranas tilacoides. De este modo, el montaje con puro o Chl a Chl d es posible desde ya que estos están disponibles a partir de cianobacterias tilacoides por ejemplo. Synechocystis PCC 6803 o Acaryochloris puerto deportivo, respectivamente. Sin embargo, no es factible para reconstituir PCSW con Chl b desde este pigmento se acompaña siempre de Chl a en tilacoides. Por el contrario, el montaje PCSW en emulsión W / O se puede probar con cualquiera de los derivados de Chl, BChl o porfirinas naturales o artificiales. No requiere el uso de membranas fotosintéticas y por lo tanto es libre de interferencias de componentes extra-membrana, tales como ficobilisoma que pueden estar unidos a las membranas de cianobacterias. El método W / O sólo está limitado por la solubilidad de los pigmentos en la fase oleosa unand por lo tanto conveniente para el montaje PCSW con cualquiera de los derivados de Chl, BChl o porfirinas naturales o artificiales.

En resumen, presentamos aquí un método general para el ensamblaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrofóbicos. Sus ventajas de se demostró por la asamblea con éxito de Chl a WSCPs con diferentes recombinantes a partir de plantas de Brassica como se indica claramente por medios espectroscópicos y los resultados bioquímicos. Además, hemos demostrado cómo el protocolo de montaje W / O puede ser utilizado para el cribado rápido de PCSW / Chl montaje complejo mediante el uso de lisados ​​de células de E. coli que sobreexpresa WSCPs recombinantes y extractos de Chl crudo. De esta manera podemos omitir tiempo etapas de purificación de proteína y la necesidad de romper las emulsiones con el fin de separar las gotitas de agua de la fase orgánica también puede ser evitado mediante el uso de microscopía de fluorescencia para visualizar directamente el conjunto en gotitas de agua. La aplicabilidad general del nuevo método hace que sea un usoful herramienta para el estudio de la unión del cofactor y de reunión, y los mecanismos de transferencia de energía y electrones en complejos proteína transmembrana de cofactor mediante el diseño y la construcción de sus análogos de proteínas solubles en agua artificiales simplificados.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

DN reconoce el apoyo de la UE 7PM proyectos PEPDIODE (GA 256 672) y REGPOT-2012-2013-1 (GA 316 157), y una beca de investigación personal (Nº 268/10) de la Fundación de Ciencias de Israel. Agradecemos al Prof. Shmuel Rubinstein, Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE.UU. para la toma de las imágenes de microscopía confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

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References

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