تحسين توليد المستحثة العضلية باستخدام تعبيد متعدد المقارين تعرب عن النسبة المثلى من Gata4، Mef2c وTbx5

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التحويل المباشر من الخلايا الليفية القلب (CFS) في العضلية التي يسببها (ICMS) يحمل إمكانات كبيرة للطب التجديدي من خلال توفير استراتيجيات بديلة لعلاج أمراض القلب. وقد تم تحقيق هذا التحويل عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة مثل Gata4 (G)، Mef2c (M) وTbx5 (T). تقليديا، يتم إنشاؤها ICMS بواسطة مزيج من الفيروسات التعبير عن هذه العوامل الفردية. ومع ذلك، إعادة برمجة كفاءة منخفضة نسبيا والأهم من ذلك في المختبر G، M، T-transduced الخلايا الليفية لا تصبح برمجتها بشكل كامل، مما يجعل من الصعب دراسة آليات إعادة برمجة. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن رياضيات الكيمياء من G، M، T هو أمر حاسم لكفاءة إعادة برمجة ICM. ورياضيات الكيمياء الأمثل للG، M، T مع مستوى عال نسبيا من M وانخفاض مستويات G و T عن طريق استخدام ناقلات MGT متعدد المقارين (يشار إليها فيما MGT) زيادة كبيرة في كفاءة إعادة برمجة تحقيقها وتحسين نوعية ICM في المختبر. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة لتوليد ICMS مع MGT بناء من الخلايا الليفية القلب. وشملت عزل الخلايا الليفية القلب، جيل من الفيروسات لإعادة برمجة وتقييم عملية إعادة برمجة أيضا إلى توفير منصة لتوليد فعالة وقابلة للتكرار من ICMS.

Protocol

بروتوكول المذكورة هنا يستخدم الفئران حديثي الولادة. تتم رعاية الحيوانات والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها شعبة الطب المخبري الحيوان (DLAM) في جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل.

1. إعداد المخازن والإعلام

  1. إعداد الخلايا الليفية (FB) المتوسطة: الملحق 500 مل سائل الإعلام IMDM مع 100 مل مصل بقري جنيني (FBS) و 6 مل البنسلين / الستربتومايسين.
  2. إعداد ICM المتوسطة: الملحق 400 مل سائل الاعلام DMEM مع 100 مل سائل الإعلام M199 و 50 مل FBS.
  3. إعداد B27 المتوسطة: الملحق 490 مل RPMI1640 وسائل الإعلام مع 10 مل B27 وسائل الإعلام.
  4. إعداد بلات-E مستنبت: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  5. إعداد بلات-E ترنسفكأيشن المتوسطة: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  6. العلاقات العامةepare الجيلاتين المغلفة 24 لوحة جيدا: إضافة 0.5 مل 0.1٪ محلول الجيلاتين إلى بئر من 24 لوحة جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل، ونضح الحق قبل الاستخدام.
  7. إعداد FACS العازلة العلامات: الملحق 500 مل DPBS مع 10 مل FBS و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  8. إعداد MACS الفرز العازلة: الملحق 500 مل DPBS مع 2.5 ز BSA و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  9. إعداد العازلة HBS 2X لترنسفكأيشن: تكملة 500 مل HEPES العازلة (50 ملم) مع 280 ملي كلوريد الصوديوم (8.1816 ز)، 10 ملي بوكل (0.37275 جم)، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 (0.10647 جم)، 12 ملي الجلوكوز (1.08096 جم ). إضافة حوالي 650 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إلى 7،05-7،12. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  10. إعداد 2.5 M CaCl 2 حل لترنسفكأيشن: إضافة 18.376 ز كاالبنود 2-50 مل ده 2 O. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  11. إعداد ICC (مناعية) عازلة التثبيت: إضافة 5 مل بارافورمالدهيد (PFA، 32٪) إلى 35 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 4٪.
  12. إعداد ICC العازلة permeabilization: إضافة 0.1 مل تريتون إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
  13. إعداد ICC عازلة حظر: إضافة 5 ز المصل البقري الزلال (BSA) إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 5٪.
  14. إعداد ICC عازلة تلطيخ: إضافة 1 ز BSA إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪.

2. جيل من الأطفال حديثي الولادة ماوس القلب الليفية

  1. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة ثقافة يزدرع
    1. نظيف حديثي الولادة αMHC-GFP الماوس المعدلة وراثيا (P1 إلى P2) مع 75٪ من الإيثانول. قطع رأس قبالة مع مقص العقيمة. ثم إجراء شق أفقي من تحت الإبط واحدة إلى أخرى. استخدام معقمملقط حادة وعازمة على تشريح من القلب ووضعه في بئر واحدة من لوحة 24 جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS العازلة.
      1. بدلا من ذلك، اخراج القلب بعد شق أفقي.
    2. تحقق من التعبير GFP في القلب عن طريق المجهر الفلورسنت. منذ مدفوعة التعبير GFP التي كتبها αMHC المروج الذي هو المروج معين في القلب، وينبغي أن يكون القلب من الماوس المعدلة وراثيا في الأخضر 15، في حين أن القلب السلبي الباهت في أي مضان.
    3. يستغرق 3-4 GFP قلوب الإيجابية إلى 60 ملم مركز جيد صحن الثقافة واللحم المفروم إلى قطع صغيرة أقل من 1 مم 3 في حجم بواسطة مقص العقيمة وملقط.
    4. ضع 3-4 قلوب المفروم في واحد صحن 10 سم مع 2 مل سائل الإعلام FB. السماح للأنسجة يستقر لمدة 3 ساعة.
    5. إضافة ببطء 8 مل قبل تحسنت وسائل الإعلام FB إلى الأطباق التي تحتوي على أنسجة القلب. لا تخل الأنسجة لمدة ثلاثة أيام.
    6. استبدال وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام.
    7. في يوم 7، aspirأكل مستنبت وغسل الخلايا مع DPBS. إضافة 3 مل 0.05٪ التربسين إلى كل لوحة وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. إضافة 5 مل سائل الإعلام FB لإرواء التربسين. بلطف فصل الخلايا مع مكشطة الخلية. ماصة وسائل الاعلام صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الأنسجة.
    9. جمع الخلايا وتصفية من خلال 40 ميكرومتر مصافى الخلية لتجنب التلوث من شظايا أنسجة القلب، ومن ثم بيليه الخلايا من خلال الدوران في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. غسل الخلايا مرة واحدة مع MACS العازلة والخلايا جاهزة للفرز.
  2. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة الهضم انزيم
    1. حصاد GFP قلوب إيجابية 2.1.1. نقل كل القلوب في صحن 10 سم مع 10 مل DPBS الجليد الباردة.
    2. ضغط البطينين مع ملقط معقم لإزالة الدم وشطف مرة واحدة مع DPBS الجليد الباردة.
    3. تقليم قلوب لتكون خالية من الأنسجة والدهون الأخرى.
    4. قطع كل القلب إلى ما يقرب من 4 قطع التي لا تزال ارتباطا فضفاضا.
    5. إذا كانت أقل من 20 القلوب، نقل نفوس الى 15 مل أنبوب مخروطي مع 8 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      1. إذا كان هناك 20-30 القلوب، ونقل القلوب إلى 50 مل أنبوب مخروطي مع 10 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. تجاهل التربسين وإضافة 5 مل (لأقل من 20 القلوب) أو 10 مل (لمدة 20-30 القلوب) الدافئة النوع الثاني كولاجيناز (0.5 ملغ / مل) في HBSS.
    7. دوامة أنبوب على vortexer لمدة 1 دقيقة على مستوى السرعة في جميع أنحاء 4-6 (إذا كان السائل لا تحصل على ما يصل إلى الغطاء، ثم سرعة على ما يرام).
    8. احتضان أنبوب في 37 ° C حمام الماء لمدة 3-5 دقيقة.
    9. دوامة الأنبوب لمدة 1 دقيقة.
    10. الرواسب لمدة 1 دقيقة عن طريق الجاذبية حتى قطعة نسيج يستقر، وجمع السائل في أنبوب جديد يحتوي على 5 مل FB الباردة المتوسطة.
    11. كرر الخطوات من 2.2.6-2.2.10 3-5 مرات.
    12. الجمع بين جميع المجموعات من خلال تصفية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومترلجعل تعليق خلية واحدة.
    13. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    14. خلايا resuspend في 10 مل MACS العازلة، وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    15. اختياري: إذا كان هناك الكثير من خلايا الدم، Resuspend الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة (150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO و 0.1 ملي EDTA)، والحفاظ على الجليد لمدة 1 دقيقة، ثم تمييع مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. غسل واحد لمزيد من الوقت مع العازلة MACS.
  3. عزل Thy1.2 + الليفية التي كتبها MACS (المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا)
    1. تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة من خلال تلطيخ التريبان الأزرق.
      1. يستغرق 10 ميكرولتر من خلايا من 10 مل تعليق خلية في الخطوة 2.2.14. مزجها مع 10 ميكرولتر 0.4٪ التريبان حل الأزرق.
      2. إضافة الخليط إلى عدادة الكريات. السماح لها الوقوف لمدة 3-5 دقيقة ثم فحص على الفور تحت المجهر. وملطخة في الخلايا الزرقاء وقابلة للحياة الخلايا الميتة هي غير ملوثين.
      3. 4 × 10 (الحجم الكلي للتعليق الخلية).
    2. أقل من 1 × 10 7 خلايا، Resuspend الخلايا مع بلي Thy1.2 10 ميكرولتر في 90 ميكرولتر برود عازلة MACS. إضافة المزيد من الخرز نسبيا إذا كان هناك أكثر من 1 × 10 7 الخلايا. تخلط جيدا واحتضان في الثلاجة (2-8 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    3. إضافة 10 مل MACS العازلة وعينات تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. تحقيق وحدة التخزين إلى 2 مل العازلة في MACS.
    5. إنشاء فاصل MACS في غطاء محرك السيارة. إدراج عمود LS لالفاصل. تطبيق 3 مل MACS العازلة إلى العمود لكي تتوازن فيه.
    6. تمرير تعليق الخلية من خلال العمود LS معايرتها.
    7. يغسل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في كل مرة.
    8. تأخذ العمود LS قبالة ركان فاصل وأزل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في أنبوب جديد 50 مل.
    9. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. خلايا resuspend في 10 مل سائل الإعلام FB، عد الخلايا والبذور في لوحات في كثافة المناسبة. لالليفية الناتجة عن أسلوب ثقافة يزدرع، يمكن أن كثافة الخلايا البذر يكون حوالي 2-3 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا. لالليفية ولدت من طريقة انزيم الهضم، يمكن أن كثافة الخلايا تكون حوالي 4-5 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا.

3. توليد الارتجاعي للICM إعادة برمجة

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة. يوصى التخلص السليم من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، نصائح ماصة والأنابيب لتجنب خطر حدوث الأخطار البيئية والصحية.

  1. الحفاظ على خلايا بلات-E في بلات-E وسائل الإعلام تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل بوروميسين و 10 ميكروغرام / مل بlasticidin عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. في يوم 2 استبدال المتوسطة التي كتبها بلات-E مستنبت تفتقر بوروميسين وblasticidin.
  3. في اليوم 0، تقسيم الخلايا بلات-E في 10 سم أطباق اليوم قبل ترنسفكأيشن في حوالي 4-5 × 10 6 خلايا لكل لوحة. يجب أن تكون الخلايا ~ 80-90٪ متكدسة يوم ترنسفكأيشن.
  4. في يوم 1، وسائل الإعلام ثقافة التغيير إلى وسائل الإعلام ترنسفكأيشن على الخلايا داخل 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن. إجراء ترنسفكأيشن على النحو التالي:
    1. ترنسفكأيشن باستخدام مجموعات تجارية
      1. مزيج 20 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن (على سبيل المثال Lipofectamine) و 500 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل (على سبيل المثال، غروب MEM). إضافة 10 ميكروغرام من البلازميد فيروسات إلى 500 ميكرولتر آخر خفضت وسائل الاعلام المصل. احتضان كل الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
      2. إضافة ببطء الخليط إلى خليط ترنسفكأيشن البلازميد. هذه الخطوة قد تستغرق 15-30 ثانية. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT (قد يظهر حل غائم). إضافة قطرة مزيج من الحكمة أن الخلايا.
      3. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. ترنسفكأيشن باستخدام فوسفات الكالسيوم.
      1. مزيج 40 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2 و 440 ميكرولتر ده 2 O، ثم إضافة 20 ميكروغرام من البلازميد فيروسات (ضبط كمية من ده 2 O بحيث الحجم الإجمالي هو 500 ميكرولتر).
      2. إضافة 500 ميكرولتر 2X HBS إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
      3. دوامة HBS وفي الوقت نفسه إضافة خليط-DNA الكالسيوم إلى HBS قطرة من الحكمة. هذه الخطوة يستغرق حوالي 30 ثانية لكل عينة. حتى الحد الأقصى قيام 3-4 عينات في وقت واحد.
      4. في احتضان RT لمدة 3 دقائق الحضانة لوقت أطول يؤدي إلى راسب أكبر والخلايا أقل ستتناول راسب.
      5. يضاف خليط إسقاط الحكمة أن الخلايا ومراقبة تحت المجهر 20X. وينبغي أن ينظر الرواسب الدقيقة (الكثير من الشركات الصغيرة هي جيدة ولكن عدد قليل من الشركات الكبيرة ليست جيدة).
      6. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    3. في يوم 2، تغيير وسائل الاعلام على الخلايا مع 8 مل prewarmed سائل الإعلام والثقافة. احتضان لمدة 24 ساعة.
    4. في يوم 3 و 4 يوم، وجمع ثقافة طاف من الأطباق باستخدام الحقنة 10 مل العقيمة، وتصفية من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام السليلوز مرشح خلات، ونقل في أنبوب 50 مل. إضافة 2 مل من الفيروس الارتجاعي هطول حل كل 8 مل تحتوي على فيروس طاف. مزيج بلطف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    5. في يوم 5، وتدور الخليط الفيروسي في 1500 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب أن تظهر الجسيمات الفيروسية في بيليه الأبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
    6. تجاهل طاف. تدور باستمرار الحل المتبقي بواسطة الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة كل آثار السائل بواسطة الشفط، مع الحرص الشديد على عدم تعكير صفو الرجعية الجسيمات المترسبة في بيليه.
    7. و resuspend الكريات فيروسات مع 100 ميكرولتر العازلة DPBS لكل 8 مل طاف الفيروسي. قاسم غير تامفيروس على الجليد. استخدامها على الفور أو تخزين في -80 ° C.

    4. إعادة برمجة الخلايا الليفية القلب

    1. إضافة 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل polybrene في ICM المتوسطة 10 مل، والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. التركيز النهائي من polybrene هو 4 ميكروغرام / مل.
    2. إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM التي تحتوي على polybrene إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا المصنف مع الخلايا الليفية.
    3. إضافة 10 ميكرولتر الارتجاعي لتحتوي كل منها على ما يرام سواء 3/2 × 10 4 الخلايا من ثقافة يزدرع أو 4-5 × 10 4 الخلايا من طريقة انزيم الهضم. وينبغي زيادة كمية الفيروس بشكل متناسب مع زيادة عدد الخلايا في لوحات ثقافة مختلفة أو الأطباق. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة للسماح للعدوى فيروسية. يظهر خط الزمن لإعادة البرمجة القلب في الشكل 1.
    4. بعد تنبيغ الفيروسية، استبدل الفيروس التي تحتوي على وسائل الاعلام مع 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM منتظم.
    5. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. لاختيار الإيجابية للخلايا transduced الفيروسية، إضافة وسائط ICM تستكمل مع بوروميسين في 2 ميكروغرام / مل لاستهداف الخلايا. يبقيه لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، والحفاظ على بوروميسين في المتوسط ​​ICM في تركيز 1 ميكروغرام / مل.
    6. بعد ثلاثة أيام من العدوى الفيروسية، واتخاذ لوحة الخروج من الحاضنة ووضعه تحت المجهر الفلورسنت المقلوب (20X) لمراقبة GFP التعبير.
      ملاحظة: بعد عشر أيام من العدوى الفيروسية، ويمكن أن تحصد الخلايا لتحليل FACS وتحليل للمحكمة الجنائية الدولية لتحديد كفاءة إعادة برمجة (في الخطوة 5 و 6).
    7. بعد أربعة عشر يوما عدوى فيروسية، استبدال ICM وسائل الاعلام مع وسائل الإعلام B27. تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام. قد تظهر الضرب العفوي خلية مواضع من ثلاثة (الخلايا من طريقة الهضم انزيم) أو أربعة (الخلايا من يزدرع الأسلوب الثقافة) أسابيع بعد تنبيغ الفيروسية.

    5. تحليل Immunocytochemical من كفاءة إعادة برمجة

    1. الخلايا شطفمع الثلج الباردة PBS ثلاث مرات؛ إزالة حل الزائد.
    2. إضافة 0.5 مل ICC عازلة التثبيت إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. إصلاح الخلايا في RT لمدة 15-20 دقيقة.
    3. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
    4. إضافة 0.5 مل ICC العازلة permeabilization إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. Permeabilize الخلايا في RT لمدة 15 دقيقة.
    5. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
    6. إضافة 0.5 مل ICC عرقلة العازلة إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا، في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
    7. الأجسام المضادة الأولية مخففة مع العازلة تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يتم سرد العوامل الأجسام المضادة في تخفيف المواد.
    8. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
    9. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد الثانوية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
    10. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث مرات.
    11. إضافة 150 ميكرولتر تركيب محلول يحتوي على دابي إلى كل بئر. السماح لوصمة عار نواة لمدة 1 دقيقة. ثمتغطية كل بئر مع جولة الغطاء الزجاجي الانزلاق واضغط بلطف زلة ضد السطح السفلي مع ملقط لإزالة فقاعات الهواء.
    12. نضح الحل الزائد والعينات جاهزة للتصوير. وتظهر الصور التمثيلية تظهر الخلايا المعاد برمجتها التي تعبر عن علامة القلب cTnT وαActinin في D14 في الشكل 2B.

    6. تحليل FACS من كفاءة إعادة برمجة

    1. اغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS. إضافة 0.3 مل التربسين (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. اضغط برفق لوحة لتسهيل رفع الخلايا. تحقق من مفرزة الخلايا تحت المجهر. إضافة 1 مل FACS العازلة على كل جانب عندما يتم فصل معظم الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الخلايا.
    3. نقل الخلايا في لوحة جيدا 24 إلى 96 لوحة بئر عميقة جيدا جيدا جيدا. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لجمع الخلايا.
    4. غسل الخلايا مرة واحدة معFACS العازلة.
    5. إضافة 100 ميكرولتر الحلول تثبيت / permeabilization ل resuspend الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. غسل الخلايا مرتين مع حل 1X غسل، بيليه، وإزالة طاف.
    7. يعد حل الأجسام المضادة الأولية ضد GFP وcTnT في غسل العازلة 1X. تماما resuspend كل عينة مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
    9. إضافة 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على فلور اليكسا 488 حمار مترافق مفتش المضادة للأرنب وفلور اليكسا 647 حمار مترافق مكافحة الفأر مفتش لكل عينة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    10. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
    11. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر العازلة التثبيت (DPBS مع 1٪ PFA). نقل الخلية في أنبوب FACS مع غطاء مصفاة الخلية. عينات جاهزة للكشف FACS. تحليل FACS التمثيلي للبرمجة الكفاءهذ باستخدام pMxs-بوروميسين-MGT بناء مع أو بدون اختيار بوروميسين هو مبين في الشكل 2A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتتولى التخطيطي لخص خطوات إعادة برمجة في الشكل 1. بعد MGT تنبيغ، يمكن الكشف عن التعبير GFP في إعادة برمجة الخلايا في وقت مبكر من يوم 3. بوروميسين اختيار الخلايا transduced تبدأ من يوم 3 وحافظت خلال الأسبوعين الأولين إذا PMX-بورو يستخدم بناء -MGT. يوم 10 إلى يوم 14، قد يتم الكشف عن التعبير عن علامات القلب مثل cTnT وαActinin من قبل كل من المحكمة الجنائية الدولية (الشكل 2B، الخطوة 5) وFACS (الشكل 2A، الخطوة 6)، مشيرا إلى أن الخلايا الليفية بدءا تشهد إعادة برمجة نحو خلية القلب مصير.

الشكل 1
ويرد التمثيل التخطيطي لعملية إعادة برمجة القلب مباشرة الإجراءات في كل نقطة زمنية في صناديق سوداء: الرقم 1. وأظهرت وسائل الإعلام ثقافة لكل مرحلة في المربعات الملونة أسفل وقتخط.

الرقم 2
الشكل 2: إعادة برمجة كفاءة تقييمها من قبل FACS والمحكمة الجنائية الدولية (A) FACS التحليل على ICMS المتولدة من الخلايا الليفية طازجة معزولة في يوم 10 بعد MGT تنبيغ. (B) تلون ICMS في 2 أسابيع مع αMHC-GFP، cTnT القلب، وαActinin مع دابي (4، 6-diamidino-2-phenylindole). شريط مقياس: 200 ميكرون

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتوليد ICM الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على الكفاءة بوجه عام. خاصة في ظل الظروف الخلايا الليفية بدء ونوعية الترميز الارتجاعي MGT يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كفاءة إعادة برمجة.

من المهم لتوليد الخلايا الليفية كما طازجة وصحية ممكن. ليزدرع الأسلوب الثقافة والليفية يمكن استخدامها من قبل كانت مطلية سبعة أيام بعد إإكسبلنتس على الأطباق. لانزيم طريقة الهضم، والخلايا الليفية يمكن استخدامها في وقت مبكر من اليوم التالي من العزلة. لا ينصح تجميد أو الركض الخلايا الليفية لإعادة البرمجة. وهذه العلاجات إضافية من الخلايا الليفية يقلل بشكل كبير من كفاءة إعادة برمجة. كثافة البذر هي عامل مهم آخر يؤثر على كفاءة إعادة برمجة. إذا الخلايا المصنف قليلة، فإنها تميل إلى أن تصبح غير صحية مع مورفولوجيا الخلايا غير النظامية والحجم الكبير. شارك نادراULD يتم تحويل هذه الخلايا إلى ICMS. إذا المصنف خلايا كثيفة جدا، وزارة الداخلية (تعدد العدوى) عن عدوى فيروسية وانخفضت. فرط نمو الخلايا الليفية غير المصابة يخفف إلى حد كبير من الأحداث برمجة مما أدى إلى انخفاض نسبة ICMS. كما اننا نلاحظ ظهور الخلايا الصغيرة في مثل حصاة كبيرة التشكل إذا هي المصنفة المزيد من الخلايا لإعادة برمجتها. انهم لا يمكن ان تكون برمجتها وبالتالي يؤدي إلى انخفاض كفاءة إعادة برمجة. عند تعديل البروتوكول لحجم مختلفة من أطباق زراعة الأنسجة، فمن المستحسن أن بذر أعداد الخلايا تعديلها بما يتناسب مع مساحة سطح الطبق الثقافة.

نقاء الليفية أمر بالغ الأهمية لإعادة البرمجة. ويمكن تحقيق نقاوة عالية من الخلايا الليفية إما عن طريق FACS فرز 15 أو تخصيب MACS كما وصفنا هنا. مقارنة FACS الفرز، MACS الفرز هو أسهل، ألطف، وأكثر ملاءمة. نقاء الخلية بعد MACS يمكن أن تصل إلى أكثر من 90٪ ثدجاجة عقب صارمة على البروتوكول. نقاء منخفضة من الخلايا الليفية قد يقلل كفاءة إعادة برمجة الخلايا الملوثة منذ يصعب إعادة برمجة الخلايا الليفية من وأنها تتكاثر أسرع بكثير من إعادة برمجة الخلايا. كما ينصح بشدة على البذور الخلايا مباشرة بعد MACS وأداء عدوى فيروسية بين عشية وضحاها بعد البذر. قد تصبح الخلايا الليفية فرز جزئي الشيخوخي بعد تزايد في طبق لفترة طويلة، مما يقلل امتصاص الفيروس الارتجاعي الذي يصيب فقط الخلايا المتكاثرة. تم الإبلاغ عن الليفية الذيل طرف (الصناديق) والخلايا الليفية الجنينية (MEFS) لتحويلها إلى ICMS مع بعض النسخ عوامل أخرى 10،12،19،26. بروتوكول لدينا هنا يركز فقط على الخلايا الليفية القلب. تطبيق هذا البروتوكول لأنواع الخلايا الليفية أخرى قد يكون الأمثل أكثر بسبب الاختلافات الكامنة التوقيعات الليفية مثل حالة انتشار والوراثي والمعالم جينية.

عشرجودة (ه) من الفيروس الارتجاعي لتنبيغ أمر في غاية الأهمية. فشلت الفيروسات عيار منخفضة لتحويل الخلايا الليفية إلى ICMS. في حين أن فيروسات في كمية زائدة سوف يسبب السمية الخلوية التي تؤدي مباشرة إلى موت الخلايا الليفية. فمن الضروري تحديد عيار الفيروسية وتحسين الجرعة الفيروسية لإعادة برمجة تستند إلى مختبر انشاء والظروف التجريبية. أسلوب المعايرة الفيروسية وقد وصفت بدقة قبل 23. في الواقع وجدنا أن حالة نمو الخلايا بلات-E يتعلق مباشرة جودة الفيروسية. فمن المستحسن أن ذوبان الجليد الخلايا بلات-E في انخفاض مرور (<30) في كل مرة. الخلايا التي تم الحصول عليها في مرور ثلاثة هي الأفضل لفيروس التعبئة والتغليف في مناطق ذات كثافة حوالي 4-5 × 10 6 خلايا في صحن 10 سم ثقافة. بالإضافة إلى ذلك، الفيروسات المقطوع حديثا عائدات أعلى كفاءة إعادة برمجة من الفيروسات المجمدة. يرجى ملاحظة أن شارك في عدوى فيروس MGT مع pMxs ناقل القائمة الارتجاعي أخرى سيقلل من possib كفاءة إعادة برمجةلاي يرجع إلى المنافسة بين الفيروسين من نفس النوع. يتم توفير طريقتين ترنسفكأيشن مختلفة هنا. كلتا الطريقتين تنتج الارتجاعي للمقارنة. في حين Lipofectamine التجاري غير مكلفة لكنها مستقرة، ترنسفكأيشن مع فوسفات الكالسيوم هو أرخص. إعداد العازلة HBS يحتاج إلى أخذ الحيطة والحذر عظيم لدرجة الحموضة العازلة HBS يؤثر بشكل كبير على كفاءة ترنسفكأيشن.

هناك بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول التي تحتاج إلى معالجة. واحدة من قيود يكمن في استخدام الارتجاعي، مما يجعل حتما إلى قضايا السلامة الأحيائية. عدم تجانس الخلايا الليفية وعدم وجود علامة محددة الليفية القلب لعزل تؤثر أيضا على نقاء الخلايا التي هي قابل للبرمجة ثانية. ويمكن ملاحظة الاختلاف من كفاءة إعادة برمجة نظرا لدفعة تقلب الأصيل في حالة الخلايا الليفية وإنتاج الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن الخلايا المعاد برمجتها تعبر عن قسيم عضلي البروتينات هيكل مثل التروبونين القلبي TوαActinin، فإنها لا تزال غير ناضجة العضلية التي تتميز الخصائص الفنية مثل انقباض ونشر الكهربائية.

وباختصار، فإن المنهجية الموضحة هنا يسمح الجيل كفاءة ICMS على أساس تسليم فيروسات من عوامل النسخ M، G، T في بناء واحد. وينص بروتوكول لدينا منصة استنساخه وقيمة للبحث ICM، وستسهل الجهود الجارية على فحص الإنتاجية العالية والدراسات الميكانيكية للICM إعادة برمجة، وفي نهاية المطاف التحرك الميداني برمجة ICM أقرب إلى التطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics