Forbedret generasjon av Induced kardiomyocytter Ved hjelp av en polycistronisk Construct Uttrykke optimale forholdet mellom Gata4, Mef2c og Tbx5

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Direkte konvertering av kardiale fibroblaster (CFS) i indusert kardiomyocytter (ICMS) har et stort potensiale for regenerativ medisin ved å tilby alternative strategier for behandling av hjertesykdom. Denne omdannelse er blitt oppnådd ved tvungen ekspresjon av definerte faktorer som Gata4 (G), Mef2c (M) og Tbx5 (T). Tradisjonelt er ICMS generert av en cocktail av virus som uttrykker disse individuelle faktorer. Det er imidlertid forholdsvis lav omprogrammering effektivitet og mesteparten av in vitro-G, M, T-omformet fibroblaster ikke bli fullt omprogrammert, noe som gjør det vanskelig å studere mekanismene omprogrammering. Vi har nylig vist at støkiometrien for G, M, T er avgjørende for effektiv ICM omprogrammering. En optimal støkiometri av G, M, T med relativ høy grad av M og lave nivåer av G og T som oppnås ved hjelp av vår polycistronisk MGT vektor (heretter referert til som MGT) signifikant øket omprogrammering effektivitet og forbedret kvalitet ICM in vitro. Her gir vi en detaljert beskrivelse av metoden som er benyttet for å generere ICMS med MGT konstruere fra hjerte fibroblaster. Isolering av kardiale fibroblaster, generering av virus for omprogrammering og evaluering av omprogrammering prosessen er også inkludert for å gi en plattform for effektiv og reproduserbar generasjon av ICMS.

Protocol

Protokollen skissert her bruker neonatale mus. Dyr omsorg og eksperimenter utføres i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt av The Division of Laboratory Animal Medicine (DLAM) ved University of North Carolina, Chapel Hill.

1. Utarbeidelse av buffere og Media

  1. Forbered fibroblast (FB) medium: Supplement 500 ml IMDM media med 100 ml Fetal Bovine Serum (FBS) og 6 ml penicillin / streptomycin.
  2. Forbered ICM medium: Supplement 400 ml DMEM media med 100 ml M199 media og 50 ml FBS.
  3. Forbered B27 medium: Supplement 490 ml RPMI1640 medie med 10 ml B27 media.
  4. Forbered Plat-E kultur medium: Supplement 500 ml DMEM media med 50 ml FBS, 5 ml penicillin / streptomycin og 5 ml ikke-essensielle aminosyrer.
  5. Forbered Plat-E transfeksjon medium: Supplement 500 ml DMEM media med 50 ml FBS og 5 ml ikke-essensielle aminosyrer.
  6. Prepare Gelatin belagte 24-brønners plate: Tilsett 0,5 ml 0,1% gelatinoppløsning til en brønn av 24-brønners plate, inkuberes ved 37 ° C i minst 10 min og aspireres rett før bruk.
  7. Forbered FACS merking buffer: Supplement 500 ml DPBS med 10 ml FBS og 2 ml EDTA (0,5 M) for å nå en sluttkonsentrasjon på 2 mM. Passere gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
  8. Forbered MACS sortering buffer: Supplement 500 ml DPBS med 2,5 g BSA og 2 ml EDTA (0,5 M) for å nå en sluttkonsentrasjon på 2 mM. Passere gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
  9. Forbered 2x HBS buffer for transfeksjon: supplere 500 ml HEPES-buffer (50 mM) med 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glukose (1,08096 g ). Legg rundt 650 mL 10 N NaOH å justere pH til 7.5 til 7.12. Filtrer gjennom et 0,22 mikrometer pore filter og oppbevares ved 4 ° C.
  10. Forbered 2,5 M CaCl 2 løsning for transfeksjon: Legg 18,376 g CaCl 2 til 50 ml DDH 2 O. Filtrer gjennom et 0,22 mikrometer pore filter og oppbevares ved 4 ° C.
  11. Forbered ICC (immunocytokjemi) fiksering buffer: Tilsett 5 ml paraformaldehyd (PFA, 32%) i 35 ml DPBS for å nå en sluttkonsentrasjon på 4%.
  12. Forbered ICC permeabiliseringsbuffer: Tilsett 0,1 ml Triton til 100 ml DPBS for å nå en sluttkonsentrasjon på 0,1%.
  13. Forbered ICC blokkeringsbuffer: Tilsett 5 g bovint serum-albumin (BSA) i 100 ml DPBS for å nå en sluttkonsentrasjon på 5%.
  14. Forbered ICC farging buffer: til 1 g BSA til 100 ml DPBS for å nå en sluttkonsentrasjon på 1%.

2. generasjon av Neonatal Mouse Hjerte Fibroblaster

  1. Generere kardiale fibroblaster fra eksplantat dyrkningsmetode
    1. Clean neonatal αMHC-GFP transgene mus (P1 til P2) med 75% etanol. Kutt hodet av med steril saks. Deretter lage et horisontalt innsnitt fra under en armhule til den annen. Bruk en sterilsløv og bøyde pinsett til å dissekere ut hjertet og legg den i en brønn på 24-brønners plate som inneholder iskald PBS buffer.
      1. Alternativt, klem ut hjertet etter at den horisontale snittet.
    2. Sjekk GFP uttrykk i hjertet av fluorescerende mikroskop. Siden GFP uttrykk er drevet av αMHC promoter som er en hjerte spesifikk promoter, bør hjertet fra transgen muse være i grønt 15, mens den negative hjerte er svak i noen fluorescens.
    3. Ta 3-4 GFP positive hjerter i en 60 mm senter vel kultur fatet og hakke dem i små biter mindre enn 1 mm 3 i størrelse med steril saks og pinsett.
    4. Plasser 3-4 hakket hjerter i ett 10 cm tallerken med 2 ml FB media. La vev slå seg ned i 3 timer.
    5. Legge 8 ml forvarmet FB media sakte til rettene inneholder hjerte vev. Ikke forstyrr vev i tre dager.
    6. Bytt media hver tredje dag.
    7. På dag 7, aspirspiste kulturmediet og vaske cellene med DPBS. Tilsett 3 ml 0,05% trypsin til hver plate, og å fordøye ved 37 ° C i 5 min.
    8. Tilsett 5 ml FB media å slukke trypsin. Forsiktig løsne cellene med en celleskrape. Pipette media opp og ned for å ytterligere mekanisk distansere vevet.
    9. Samle celler og filtrer gjennom 40 um celle siler for å unngå forurensning av hjertevev fragmenter, og deretter pellet-celler ved spinning ved 200 xg i 5 minutter.
    10. Vask cellene en gang med MACS-buffer og cellene er klare for sortering.
  2. Generere kardiale fibroblaster fra enzymet fordøyelsen metode
    1. Innhøsting GFP positive hjerter som 2.1.1. Overfør alle hjerter i en 10 cm tallerken med 10 ml iskald DPBS.
    2. Klem ventriklene med steril tang for å fjerne blod og skyll en gang med iskalde DPBS.
    3. Trim hjertene til å være fri for andre vev og fett.
    4. Skjær hver hjerte i omtrent fire stykker som fortsatt er løst koblet.
    5. Hvis mindre enn 20 hjerter, overføre hjerter inn i en 15 ml konisk tube med 8 ml varm 0,05% Trypsin-EDTA, og inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
      1. Hvis det er 20-30 hjerter, overfører hjertene i et 50 ml konisk rør med 10 ml varm 0,05% Trypsin-EDTA, og inkuber ved 37 ° C i 15 min.
    6. Kast trypsin og tilsett 5 ml (for mindre enn 20 hjerter) eller 10 ml (for 20-30 hjerter) varm type II kollagenase (0,5 mg / ml) i HBSS.
    7. Vortex-røret på vortex i 1 min ved en hastighet nivå omkring 4 til 6 (dersom væsken ikke kommer opp til lokket, da hastigheten er fint).
    8. Inkuber røret i 37 ° C vannbad i 3-5 min.
    9. Vortex-røret i 1 min.
    10. Sediment i 1 min med tyngdekraften til vevet stykker slå seg ned, samle opp væsken inn i et nytt rør som inneholder 5 ml kaldt FB middels.
    11. Gjenta trinn 2.2.6-2.2.10 3-5 ganger.
    12. Kombiner alle samlingene ved filtrering gjennom 40 mikrometer celle silfor å lage enkeltcelle-suspensjon.
    13. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    14. Resuspender cellene i 10 ml MACS-buffer og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    15. Valgfritt: Hvis det er mange av blodceller, resuspender celler med 1 ml RBC lysis buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO 3 og 0,1 mM EDTA), holde på is i 1 min, deretter fortynnes med 10 ml MACS buffer og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. Vask en gang med MACS buffer.
  3. Isolering av Thy1.2 + fibroblaster ved MACS (magnetisk-aktivert celle sortering)
    1. Bestem levedyktig celle nummer gjennom trypanblått farging.
      1. Ta 10 mL celler ut fra 10 ml cellesuspensjon i trinn 2.2.14. Bland den med 10 mL 0,4% trypanblått løsning.
      2. Tilsett blandingen til et hemocytometer. La den stå i 3-5 min og deretter undersøke umiddelbart under et mikroskop. De døde cellene er farget i blått og levedyktige celler er unstained.
      3. 4 x 10 (totalt volum av cellesuspensjon).
    2. For mindre enn 1 x 10 7 celler, resuspender celler med 10 mL Thy1.2 microbeads i 90 mL kjølt MACS buffer. Legg til flere perler proporsjonalt hvis det er mer enn 1 x 10 7 celler. Bland godt og inkuber i kjøleskap (2-8 ° C) i 30 min.
    3. Tilsett 10 ml MACS buffer og spinnprøver ved 200 xg i 5 min; vaskes en gang med 10 ml MACS-buffer og sentrifuger på nytt.
    4. Bring volumet til 2 ml i MACS-buffer.
    5. Sett opp en MACS Separator i hette. Sett inn en LS kolonne til separatoren. Påfør 3 ml MACS buffer til kolonnen til likevekt den.
    6. Passere cellesuspensjonen gjennom den ekvilibrerte LS kolonne.
    7. Vask 3 ganger med 2 ml MACS buffer hver gang.
    8. Ta LS kolonne off tHan Separator og elueres 3 ganger med 2 ml MACS-buffer til et nytt 50 ml tube.
    9. Snurr på 200 xg i 5 min.
    10. Resuspender celler i 10 ml FB media, telle cellene og frø til plater på riktig tetthet. For fibroblaster generert fra eksplantatet dyrkningsmetode, kan den såing celler tettheten ligge på 2-3 x 10 4 celler / brønn på 24-brønners plate. For fibroblaster generert fra enzymoppslutning metode, kan cellene tettheten være i området rundt 4 til 5 x 10 4 celler / brønn på 24-brønners plate.

3. generasjon av Retrovirus for ICM Omprogrammering

Merk: Utfør følgende trinn i en BSL2 biologisk sikkerhetskabinett under sterile forhold. Riktig disponering av transfekterte celler, pipettespisser og rør anbefales å unngå risiko for miljø- og helsefare.

  1. Oppretthold Plat-E celler i Plat-E media supplert med 1 ug / ml puromycin og 10 ug / ml blasticidin ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. På dag to, erstatte mediet med Plat-E dyrkingsmedium mangler puromycin og blasticidin.
  3. På dag 0, delt Plat-E-celler i 10 cm skåler dagen før transfeksjon ved omtrent 4-5 x 10 6 celler pr plate. Cellene bør være ~ 80-90% konfluent på dagen for transfeksjon.
  4. På dag en, forandring kulturmedier til transfeksjon medier på celler i løpet av en time før transfeksjon. Transfeksjon Fremgangsmåten er som følger:
    1. Transfeksjon bruke kommersielle kits
      1. Bland 20 ul transfeksjon reagens (f.eks Lipofectamine) og 500 mL redusert serum media (f.eks Opti-MEM). Tilsett 10 mikrogram av det retrovirale plasmid til en annen 500 mL reduserte serum media. Inkuber hver blanding ved romtemperatur (RT) i 5 min.
      2. Langsomt tilsett plasmidblanding for transfeksjon blanding. Dette trinnet kan ta 15-30 sek. Inkuber blandingen i 20 minutter ved romtemperatur (oppløsning kan vises uklar). Legg blandingen dråpevis til cellene.
      3. Inkuber over natten i en 37 ° C inkubator.
    2. Transfeksjon bruker Kalsiumfosfat.
      1. Bland 40 ul 2,5 M CaCl 2 og 440 ul DDH 2 O, og deretter tilsettes 20 mikrogram av det retrovirale plasmid (justere mengden av DDH 2 O, slik at det totale volum er 500 ul).
      2. Legg til 500 mL 2x HBS til en 15 ml konisk tube.
      3. Vortex HBS og i mellomtiden legge til kalsium-DNA blandingen til HBS slippe klok. Dette trinnet tar rundt 30 sekunder for hver prøve. Så maksimalt gjøre 3-4 prøver samtidig.
      4. Inkuber ved RT i 3 min Inkubering i lengre tid fører til større bunnfall, og mindre celler vil ta opp bunnfallet.
      5. Legg blandingen slippe lurt til cellene og observere etter 20X mikroskop. Fin utfellinger (mange små er bra, men noen store de er ikke bra) bør sees.
      6. Inkuber over natten ved 37 ° C inkubator.
    3. På dag to, endre media på celler med 8 ml forvarmet kulturmedier. Inkuber i 24 timer.
    4. På dag 3 og dag 4, samle kultursupernatant fra skålene ved hjelp av en 10 ml steril engangssprøyte, filtrering gjennom en 0,45 um porestørrelse celluloseacetat-filter, og overføring til et 50 ml rør. Tilsett 2 ml av retrovirus presipiteringsoppløsning til hver 8 ml virus-inneholdende supernatant. Bland forsiktig det og inkuberes over natten ved 4 ° C.
    5. På dag 5, spinne viral blandingen ved 1500 x g ved 4 ° C i 30 min. De virale partikler skal vises i hvitt pellet på bunnen av røret.
    6. Kast supernatanten. Spinne ned gjenværende oppløsning ved sentrifugering ved 1500 x g i 5 min. Fjerne alle spor av væske ved aspirasjon, tar stor forsiktighet for ikke å forstyrre de utfelte retroviruspartikler i pellet.
    7. Suspender retrovirale pellets med 100 ul DPBS buffer for hver 8 ml viral supernatanten. Delmengdeviruset på is. Brukes umiddelbart eller oppbevares ved -80 ° C.

    4. Omprogrammering av Hjerte Fibroblaster

    1. Tilsett 4 pl 10 mg / ml polybren løsning i 10 ml ICM medium, og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Den endelige konsentrasjonen av polybren er 4 ug / ml.
    2. Legg 500 mL ICM medier som inneholder polybren til hver brønn av 24 brønn plate podet med fibroblaster.
    3. Tilsett 10 ul til hver brønn retrovirus som enten inneholder 2-3 x 10 4 celler fra eksplantatet kultur eller 4-5 x 10 4 celler fra enzymoppslutning metode. Mengden av virus bør proporsjonalt økt med økt celletall i ulike kulturplater eller retter. Sett av platen i en 37 ° C inkubator i 24-48 timer for å tillate viral infeksjon. Tidslinje for hjerte omprogrammering er vist i figur 1.
    4. Etter viral transduksjon, erstatte virus som inneholder media med 500 mL vanlig ICM media.
    5. Endre media hver 2-3 dager. For positiv utvelgelse av virus transduserte celler, legge ICM media supplert med puromycin på 2 mg / ml til målceller. Hold det i tre dager. Etter det, opprett puromycin i ICM mediet ved en konsentrasjon på 1 ug / ml.
    6. Tre dager etter virusinfeksjon, ta platen ut fra inkubatoren og plassere den under en invertert fluorescerende mikroskop (20X) å observere GFP uttrykk.
      Merk: Ti dager etter viral infeksjon, kan cellene bli høstet for FACS-analyse og ICC analyse for å fastslå reprogrammerings-effektivitet (i trinn 5 og 6).
    7. Fjorten dager etter virusinfeksjon, erstatte ICM media med B27 media. Endre media hver tredje dag. Spontan juling celle loci kan vises fra tre (celler fra enzym fordøyelsen metode) eller fire (celler fra eksplantat dyrkingsmetoden) uker etter virusoverføring.

    5. immunocytokjemisk Analyse av Omprogrammering Efficiency

    1. Skyll cellermed iskald PBS tre ganger; fjerne overflødig løsning.
    2. Tilsett 0,5 ml ICC fikseringsbuffer til hver brønn på 24 brønners plater. Fiksere cellene ved romtemperatur i 15-20 min.
    3. Rens cellene med PBS tre ganger.
    4. Tilsett 0,5 ml ICC permeabiliseringsbuffer til hver brønn i 24 brønners plater. Permeabilisere cellene ved RT i 15 min.
    5. Rens cellene med PBS tre ganger.
    6. Tilsett 0,5 ml ICC blokkeringsbuffer til hver brønn av 24-brønners plate, inkuber ved romtemperatur i 1 time.
    7. Utvannet primære antistoffer med ICC flekker buffer. Tilsett 200 ul antistoffløsninger til hver brønn og inkuber over natten ved 4 ° C. De antistoff fortynningsfaktorer er oppført i Materials.
    8. På den neste dag, vaskes cellene med PBS tre ganger.
    9. Tilsett 200 ul sekundære antistoffløsninger til cellene og inkuberes i 1 time ved romtemperatur i mørket.
    10. Vask cellene med PBS tre ganger.
    11. Legg 150 ul løsning som inneholdt monterings DAPI til hver brønn. Tillate å farge kjerner i 1 min. Dadekke hver brønn med runde glass dekkglass og trykk forsiktig slip mot bunnoverflaten med en tang for å fjerne luftbobler.
    12. Aspirer overskudd av oppløsning og prøvene er klar for avbildning. De representative bilder som viser omprogrammeres celler som uttrykker kardial markør cTnT og αActinin ved D14 er vist i figur 2B.

    6. FACS Analyse av Omprogrammering Efficiency

    1. Vask cellene en gang med DPBS. Legg 0,3 ml trypsin (0,05%) til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
    2. Forsiktig på platen for å lette løfte cellene. Kontroller mobil avløsning etter mikroskop. Tilsett 1 ml FACS-buffer i hver brønn når de fleste celler er dissosiert. Pipetter opp og ned for å ytterligere mekanisk å dissosiere cellene.
    3. Overfør cellene i 24-brønners plate i en 96-brønners plate dyp brønn brønn til brønn. Sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å samle cellene.
    4. Vask cellene én gang medFACS-buffer.
    5. Tilsett 100 ul fiksering / permeabilization løsninger for å resuspendere cellene i 20 minutter ved 4 ° C.
    6. Vask cellene to ganger med 1 x vaskeoppløsning, pellet, og fjern supernatanten.
    7. Forbered primær antistoff løsning mot GFP og cTnT i 1x vaskebuffer. Grundig resuspender hver prøve med 50 ul antistoffoppløsning og inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
    8. Vask cellene en gang i 1 x vaskeløsning, pellet, og fjern supernatanten.
    9. Tilsett 50 ul oppløsning inneholdende sekundært antistoff Alexa Fluor 488 konjugert esel-anti-kanin-IgG og Alexa Fluor 647 konjugert esel-anti-muse-IgG til hver prøve. Inkuber ved 4 ° C i 30 min i mørket.
    10. Vask cellene en gang i 1 x vaskeløsning, pellet, og fjern supernatanten.
    11. Resuspender celler i 400 mL fiksering buffer (DPBS med 1% PFA). Overfør celle inn FACS rør med celle sil cap. Prøvene er klare for FACS deteksjon. Representanten FACS analyse av omprogrammering efficiency ved hjelp av pMxs-puromycin-MGT konstruksjon med eller uten puromycin valg er vist i figur 2A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omprogrammering trinnene er oppsummert av skjematisk i figur 1. Etter MGT transduksjon, kunne GFP uttrykk i omprogrammere celler oppdages så tidlig som dag 3. Puromycin utvalg av transduserte celler starter fra dag 3 og blir vedlikeholdt i løpet av de to første ukene hvis PMX-puro -MGT konstruksjon blir brukt. Ved dag 10 til dag 14, kan uttrykk for hjertemarkører som cTnT og αActinin bli oppdaget av både ICC (figur 2B, trinn 5) og FACS (Figur 2A, trinn 6), noe som indikerer at start fibroblaster gjennomgår omprogrammering mot en hjertecelle skjebne.

Figur 1
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av den direkte hjerte reprogrammerings prosess Prosedyrer ved hvert tidspunkt er beskrevet i svarte bokser. Kultur media for hvert trinn er vist i fargede boksene nedenfor tidenlinje.

Figur 2
Figur 2: Omprogrammering effektivitet evaluert av FACS og ICC (A) FACS analyse på ICMS generert fra nyisolerte fibroblaster på dag 10 etter MGT transduksjon.. (B) Farging av ICMS på 2 uker med αMHC-GFP, hjerte cTnT, og αActinin med DAPI (4 ', 6-diamidino-to-phenylindole). Skala: 200 mikrometer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For vellykket ICM generasjon når du bruker denne protokollen, er det flere viktige faktorer som har innvirkning på den totale effektiviteten. Spesielt betingelsene for start fibroblaster og kvaliteten av retrovirus som koder for MGT kan i stor grad påvirke effektiviteten omprogrammering.

Det er viktig å generere fibroblaster så friske ut som mulig. For explant kultur metoden, kan fibroblaster brukes før sju dager etter explants ble sådd på retter. For enzymoppslutning metode, kan fibroblaster brukes så tidlig som den neste dag av isolasjon. Frysing eller aging fibroblaster for omprogrammering er ikke anbefalt. Disse ekstra behandlinger av fibroblaster vil betydelig redusere omprogrammering effektivitet. Seeding tetthet er en annen viktig faktor som påvirker omprogrammering effektivitet. Hvis cellene er tynt seeded, har de en tendens til å bli usunn med uregelmessig cellemorfologi og i stor størrelse. Sjelden could disse cellene bli omdannet til ICMS. Dersom cellene blir sådd altfor tett, blir MOI (multiplisitet av infeksjon) for viral infeksjon redusert. Vekst av ikke-infiserte fibroblaster betydelig utvanner omprogrammering hendelser dermed resulterer i en lav prosentandel av ICMS. Vi også legge merke til fremveksten av mindre celler i brostein lignende morfologi hvis flere celler blir sådd for omprogrammering. De kunne knapt være nytt og dermed føre til redusert omprogrammering effektivitet. Ved modifisering av protokollen for forskjellig størrelse på vevskulturskåler, anbefales det at poding av celletall reguleres proporsjonalt med overflatearealet til dyrkningsskålen.

Renheten av fibroblaster er kritisk for omprogrammering. Den høye renhet fibroblaster kan oppnås enten ved FACS-sortering eller 15 MACS anriking som vi beskrevet her. Sammenlignet med FACS sortering, er MACS sortering enklere, mildere og mer praktisk. Cell renhet etter MACS kunne nå over 90% whøne strengt følge protokollen. Lav renhet av fibroblaster kan redusere omprogrammering effektivitet ettersom de kontaminerte celler er vanskeligere å være nytt enn fibroblaster, og at de sprer mye raskere enn omprogrammering celler. Det er også sterkt anbefalt å frø cellene rett etter MACS og utføre virusinfeksjon over natten etter seeding. De sorterte fibroblaster kan delvis bli senescent etter vokser i fatet i lang tid, noe som reduserer opptaket av retrovirus som infiserer bare de prolifererende celler. Tail-tip fibroblaster (TTFs) og embryonale fibroblaster (MEFs) er rapportert å bli omdannet til ICMS med noen andre transkripsjonsfaktorer 10,12,19,26. Vår protokollen her bare fokuserer på hjerte fibroblaster. Anvendelsen av denne protokollen til andre fibroblast typer kan bli ytterligere optimalisert grunn av de iboende varianter av fibroblast signaturer som spredning status, genetiske og epigenetiske landemerker.

The kvaliteten av retrovirus for transduksjon er av største betydning. Lave titer virus klarer å konvertere fibroblaster inn ICMS. Mens virus på overdreven bruk vil føre til cytotoksisitet som direkte fører til fibroblast celledød. Det er nødvendig å bestemme den virale titer og optimalisere den virale dosering for omprogrammering basert på laboratorieoppsett og forsøksbetingelser. Fremgangsmåten for viral titrering har blitt grundig beskrevet før 23. Faktisk fant vi at veksten tilstanden Plat-E celler direkte relatert til viral kvalitet. Det anbefales å tine Plat-E celler ved lavere passasje (<30) hver gang. Celler oppnådd ved passering tre er best for emballasje virus i en tetthet rundt 4-5 x 10 6 celler per 10 cm kultur parabolen. I tillegg er nyhøstede virus gir høyere omprogrammering effektivitet enn frosne virus. Vær oppmerksom på at samtidig infeksjon av MGT virus med en annen pMxs vektorbaserte retrovirus vil redusere omprogrammering effektivitet possibly på grunn av konkurranse mellom de to virus av den samme type. To forskjellige transfeksjonsmetoder er gitt her. Begge metodene gi sammenlignretrovirus. Mens kommersiell Lipofectamine er kostbart, men stabil, er transfeksjon med kalsiumfosfat billigere. Utarbeidelse av HBS buffer må ta stor forsiktighet på grunn av pH i HBS buffer påvirker betydelig transfeksjonseffektiviteten.

Det er noen begrensninger i denne protokoll som må tas opp. En av begrensningene som ligger i bruken av retrovirus, som uunngåelig gjengir til biologisk problemer. Heterogeniteten av fibroblaster og mangelen på spesifikke hjerte fibroblast markør for isolasjon også påvirke renheten av celler som er omprogrammerbar. Variasjon av omprogrammering effektivitet kan observeres på grunn av batch-variabilitet iboende i fibroblast tilstand og virusproduksjon. I tillegg, selv om de omprogrammeres celler uttrykker sarcomere strukturproteiner som for eksempel hjerte troponin Tog αActinin, er de fortsatt ikke modne kardiomyocytter preget av funksjonelle egenskaper som kontraktilitet og elektrisk forplantning.

Oppsummert metoden beskrevet her tillater effektiv generasjon av ICMS basert på retrovirale levering av M, G, T transkripsjonsfaktorer i en enkel konstruksjon. Vår protokollen gir en reproduserbar og verdifull plattform for ICM forskning, og vil legge til rette for kontinuerlige arbeid på høy gjennomstrømming screening og mekanistiske studier av ICM omprogrammering, og til slutt flytte ICM omprogrammering feltet nærmere kliniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics